通过卵母细胞玻璃化冷冻实现生育力保存：临床与实验室视角

摘要

多个国际科学学会已将卵母细胞冷冻保存技术认定为青春期后女性生育力保存的金标准。恰当的临床与实验室策略可确保生育力保存治疗的最大有效性、效率和安全性。

摘要

在兼顾患者未来生活质量的多功能医疗体系中，保护女性生育力至关重要。对于青春期后女性，无论是出于医学还是非医学原因，卵母细胞冷冻保存已被多个国际科学组织公认为生育力保存的金标准。主要医学指征包括肿瘤性疾病、严重的子宫内膜异位症等妇科疾病、影响卵巢储备功能的全身性疾病，以及与早发性绝经相关的遗传性疾病。本文阐述了生育力保存治疗的完整临床与实验室工作流程，提出了基于客观证据的咨询建议。此外，本文重点讨论了该技术的有效性，并描述了如何在最短时间内充分挖掘并最大化获取可用卵母细胞的最优策略。文中详细说明了卵巢储备功能评估、理想促排卵方案的制定，以及取卵、去颗粒细胞和玻璃化冷冻等操作步骤，同时介绍了提高这些环节有效性、效率与安全性的具体方法。

引言

建立并实施高效的人类卵母细胞冷冻保存方案是生殖医学领域的一项重大突破。近期证据表明，玻璃化冷冻是保存减数分裂II期（MII）卵母细胞最有效的方法，与慢速冷冻相比，其卵母细胞存活率在统计学上显著更高，且该结果不受患者人群（不孕患者或卵母细胞捐赠项目）的影响^1,2,3。卵母细胞玻璃化冷冻技术取得的显著成果，促使美国生殖医学会（ASRM）和辅助生殖技术学会（SART）的实践委员会宣布，该技术是青春期后女性出于医学或非医学指征进行选择性生育力保存的最有效手段^4,5,6。生育力保存的医学指征包括：（i）需要接受放疗、细胞毒性化疗或内分泌治疗的癌症及自身免疫性疾病⁷（这些治疗对卵巢储备功能的不利影响与母亲年龄以及治疗类型和剂量相关）；（ii）需要反复或根治性手术的卵巢疾病（如子宫内膜异位症）⁸；以及（iii）遗传性疾病（如脆性X染色体综合征）或早发性卵巢功能衰竭。此外，对于因非医学原因尚未完成生育目标的所有女性而言，生育力保存也已成为一项有价值的可选方案（亦称为社会性冷冻）。

方案

1. 处理与临床咨询

注意：对于因肿瘤相关原因需要进行生育力保存的患者，应确保安排咨询时无等待名单，并尽快提供就诊预约。

1. 检查患者的病史和既往资料，评估其整体健康状况。
2. 将所有信息（包括癌症患者接受促排卵治疗的肿瘤科医生批准意见）记录在关系型数据库中。
3. 向患者提供关于该操作可行性的专门咨询，解释操作步骤（卵巢刺激、卵母细胞采集、卵母细胞玻璃化冷冻），并告知其实际成功率（主要取决于母亲年龄及取卵时预计获得的MII期卵母细胞数量）、费用以及该操作的局限性。
4. 进行经阴道超声检查，获取卵巢储备功能信息（即窦卵泡计数，AFC），并评估卵巢是否便于取卵操作。
5. 要求进行血液检测，以评估血型和Rh因子、凝血功能筛查（血常规、凝血酶原、凝血活酶、纤维蛋白原、蛋白C、蛋白S、抗凝血酶III、同型半胱氨酸）以及传染病检测（乙型肝炎、丙型肝炎、HIV、性病研究实验室试验/梅毒螺旋体血凝试验）。
   注意：对于因非紧急医疗原因接受生育力保存项目的患者，更全面的评估可包括基础卵泡刺激素（FSH）、黄体生成素（LH）、雌二醇、抗缪勒管激素（AMH）、乳腺检查、巴氏涂片、凝血相关基因筛查（V因子Leiden突变和凝血酶原基因突变）以及TORCH筛查（弓形虫、风疹、巨细胞病毒）。
6. 要求进行心脏科评估（心电图）。
7. 建议进行心理咨询服务。

....

结果

本中心生育力保存项目的概述

在12年期间（2008–2020年），共有285名女性接受了至少一次卵母细胞采集，并对所获得的全部成熟卵子进行了玻璃化冷冻。其中大多数女性（n=250）仅接受了一次取卵，35名女性接受了多次取卵。进行卵子玻璃化冷冻的取卵原因被归纳为4类：医学原因（除癌症外）、癌症、非医学原因及其他原因。在250名仅接受一次卵子冷冻取卵的女性中，8%为非癌症相关的医学原因（10例子宫内膜异位症、3例子宫肌瘤、4例卵巢囊肿、1例输卵管积水），16%为癌症（31例乳腺癌、3例卵巢癌、2例结直肠癌、2例霍奇金淋巴瘤、1例外阴癌和1例宫颈癌），53%为非医学原因，23%为其他原因（43例因未获得精子、10例存在卵巢过度刺激综合征风险、4例感染及1例发热）。在接受多次卵子冷冻取卵的患者中，这一分布有所不同：9%为非癌症相关的医学原因（1例子宫内膜异位症、2例卵巢储备功能减退），6%为癌症（2例乳腺癌），80%为非医学原因，3%为其他原因（1例因未获得精子）。所有接受多次卵子冷冻取卵的患者均未解冻使用这些卵子，而250名仅接受一次卵子冷冻周期的女性中.......

讨论

临床注意事项

尽管新兴策略（如卵巢组织冷冻保存和体外成熟技术）已被探索，但在控制性卵巢刺激（COS）后进行卵母细胞玻璃化冷冻仍是生育力保存的金标准技术。在此背景下，应尽可能在最短时间内获取并冷冻保存更多的卵母细胞，因为大多数癌症患者可能仅能在开始抗癌治疗前完成一个卵巢周期。因此，合理的卵巢刺激方案对于充分挖掘卵巢储备潜能、提高未来活产的累积概率至关重要²⁸，而这一结局高度依赖于取卵时的 maternal 年龄。目前尚未提出用于生育力保存目的的卵母细胞玻璃化冷冻的理想年龄²⁹，学界尚需在35岁¹⁸或37岁^30,31之间达成共识。然而，只要向患者充分告知基于其年龄的成功率，生育力保存应向所有患者开放，包括年龄超过37岁的女性。

药物方案和.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
采集
设备
加热板	IVF 技术
实验室标志物	Sigma Aldrich
层流罩	IVF 技术		A级气流
体视显微镜	Leica	Leica M80
温度计
试管加热器
三气培养箱	Panasonic	MCO-5M-PE	02/CO2
真空泵	库克	K-MAR-5200
耗材
CSCM（连续单细胞培养完全）培养基	Fujifilm Irvine Scientific	90165	添加HSA的IVF培养基
用于胚胎培养的矿物油	Fujifilm Irvine Scientific	9305
取卵针（单腔）	库克	K-OSN-1730-B-60
初级培养皿	Corning	353803	Corning Primaria 培养皿 100x20 mm 标准细胞培养皿
圆底管	Falcon	352001	Falcon 14 ml 圆底聚苯乙烯试管，带卡扣盖
圆底管	Falcon	352003	卵母细胞采集管 / Falcon 5 ml 12×75 圆底聚丙烯试管，带卡扣盖
橡胶球囊	Sigma Aldrich	Z111589-12EA
无菌玻璃巴斯德吸管	Hunter Scientific	PPB150-100PL	巴斯德棉塞移液管，150毫米，MEA 和 CE 认证
去颗粒细胞
设备
CO2 培养箱	Eppendorf	Galaxy 14S
Flexipet 可调节手柄套装	库克	G18674	去颗粒细胞  持针器
Gilson Pipetman	Gilson	66003	p20
k-System 培养箱	Coopersurgical	G210Invicell
实验室标志物	Sigma Aldrich
层流罩	IVF 技术		A级气流
体视显微镜	Leica	Leica M80
耗材
Biopur epTIPS 架	Eppendorf	30075331	Micropipettes epTIPS Biopur 2-200 µl
人血清白蛋白	thermoFisher Scientific	9988
透明质酸酶	Fujifilm Irvine Scientific	90101	HEPES 缓冲 HTF 中含 80 IU/mL 透明质酸酶
IVF 培养皿（60 × 15 mm）	Corning	353802	Corning Primaria Falcon 培养皿 60×15 mm TC Primaria 标准细胞培养皿
4孔带滑盖培养皿	ThermoFisher Scientific	176740	4孔多孔培养皿（Nunc）
IVF One 培养皿	Falcon	353653	Falcon 60 x 15 mm TC 处理中心井 IVF
用于胚胎培养的矿物油	Fujifilm Irvine Scientific	9305
改良型 HTF 培养基	Fujifilm Irvine Scientific	90126	HEPES缓冲液
橡胶吸头	Sigma Aldrich	Z111589-12EA	1 mL 巴氏吸管
无菌玻璃巴斯德吸管	Hunter Scientific	PPB150-100PL	巴斯德棉签移液管，150 毫米，MEA 和 CE 认证
剥卵移液管  提示（140 µm)	库克	K-FPIP-1140-10BS-6	移液器 Flexipets 用于去颗粒细胞
去卵丘细胞移液吸头（130 µm	库克	K-FPIP-1130-10BS-7	移液器 Flexipets 用于去颗粒细胞
剥离吸头（170 µm)	库克	K-FPIP-1170-10BS-5	用于去核的FlexiPetts移液管
玻璃化冷冻
设备
电子计时器
Flexipet 可调节手柄套装	库克	G18674	去颗粒细胞  持针器
Gilson Pipetman	Gilson	F123601	p200
实验室标志物	Sigma Aldrich
层流罩	IVF 技术		A级气流
用于冷却架的不锈钢容器	Kitazato		玻璃化冷冻用液氮容器
体视显微镜	Leica	Leica M80
耗材
Biopur epTIPS 架	Eppendorf	30075331	Micropipettes epTIPS Biopur 2-200 µL
人血清白蛋白	Fujifilm Irvine Scientific	9988
IVF 培养皿（60 × 15 mm）	Corning	353802	Corning Primaria Falcon 培养皿 60 x 15 mm TC Primaria 标准细胞培养皿
IVF 培养皿 6 孔	Oosafe	OOPW-SW02	OOSAFE 6 孔培养皿配吸管架
改良型 HTF 培养基	Fujifilm Irvine Scientific	90126	HEPES缓冲液
剥离吸头（170 µm)	库克	K-FPIP-1170-10BS-5	用于去颗粒细胞的FlexiPetts移液管
玻璃化冷冻试剂盒	Fujifilm Irvine Scientific	90133-so	2 瓶 ES（平衡液，2 × 1 mL）和 2 瓶 VS（玻璃化冷冻液，2 × 1 mL）
Vitrifit	Coopersurgical Origio	42782001A	VitriFit  方框
解冻
设备
电子计时器
Flexipet 可调节手柄套装	库克	G18674	脱颗粒细胞  持针器
Gilson Pipetman	Gilson	F123601	p200
k-System 培养箱	Coopersurgical	G210Invicell
实验室标志物	Sigma Aldrich
层流罩	IVF 技术		A级气流
用于冷却架的不锈钢容器	Kitazato		玻璃化冷冻用液氮容器
体视显微镜	Leica	Leica M80
耗材
Biopur epTIPS 架	Eppendorf	30075331	Micropipettes epTIPS Biopur 2-200 µL
CSCM（连续单细胞培养完全）培养基	Fujifilm Irvine Scientific	90165	添加HSA的IVF培养基
IVF 培养皿（60 × 15 mm）	Corning	353802	Corning Primaria Falcon 培养皿 60×15 mm TC Primaria 标准细胞培养皿
4孔带滑盖培养皿	ThermoFisher Scientific	176740	4孔多孔培养皿（Nunc）
6孔IVF培养皿	Oosafe	OOPW-SW02	OOSAFE® 6孔培养皿配吸管架
用于胚胎培养的矿物油	Fujifilm Irvine Scientific	9305
SAtripping pipette tips (300µm)	库克	K-FPIP-1300-10BS-5	移液器 Flexipets 用于去颗粒细胞
玻璃化冷冻解冻试剂盒	Fujifilm Irvine Scientific	90137-so	4 瓶 TS（解冻液，4 × 2 mL）+ 1 瓶 DS（稀释液，1 × 2 mL）+ 1 瓶 WS（洗涤液，1 × 2 mL）