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方法文章

分离高质量小鼠心房和心室肌细胞用于同时检测Ca2+瞬变和L型钙电流

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DOI：

10.3791/61964

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2020年11月3日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine I, University Hospital Munich, Campus Großhadern, Ludwig-Maximilians University Munich (LMU), 2Partner Site Munich, Munich Heart Alliance (MHA), DZHK (German Centre for Cardiovascular Research), 3Walter Brendel Center of Experimental Medicine, Ludwig-Maximilians University Munich (LMU), 4Institute of Pharmacology and Toxicology, University Medical Center Göttingen, 5Partner Site Göttingen, DZHK (German Centre for Cardiovascular Research), 6Cluster of Excellence "Multiscale Bioimaging: from Molecular Machines to Networks of Excitable Cells" (MBExC), University of Göttingen

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

小鼠模型可用于研究心律失常发生的关键机制。为此，需要高质量的心肌细胞以进行膜片钳测量。本文介绍了一种通过逆行酶解Langendorff灌流法分离小鼠心房和心室肌细胞的方法，该方法可实现钙瞬变与L型钙电流的同步记录。

摘要

小鼠模型在心律失常研究中发挥着关键作用，可用于研究心律失常发生的关键机制，包括离子通道功能改变和钙处理异常。为此，需要高质量的心房或心室心肌细胞，以进行膜片钳测量或探究钙处理异常。然而，现有分离方案获得的高质量心肌细胞产量有限，无法在同一小鼠中同时进行这两项检测。本文介绍了一种通过逆行酶法Langendorff灌流分离高质量小鼠心房和心室心肌细胞的方法，可从同一只动物中同时检测钙瞬变和L型钙电流。获取小鼠心脏后，迅速插管至主动脉以清除血液。随后，先用无钙溶液（37 °C）对心脏进行初始灌流，以在闰盘水平解离组织；再用含少量钙的酶溶液灌流，以破坏细胞外基质（37 °C）。消化完成后，将心脏解剖分离为心房和心室。将组织样本切成小块，并通过轻柔吹打使其分散。随后终止酶消化过程，并逐步将细胞重新暴露于生理钙浓度环境中。在加载荧光Ca2+指示剂后，分离的心肌细胞即可用于钙电流与钙瞬变的同步测量。此外，本文还讨论了分离过程中的常见问题，并提供了膜片钳实验方案，以及上述方法分离的小鼠心房和心室心肌细胞中L型钙电流与钙瞬变同步测量的典型记录图谱。

引言

心律失常十分常见，是当前主要的医疗挑战之一，全球有数百万人受到影响。心律失常与高发病率和高死亡率相关1,2，并且是大多数心源性猝死的根本原因3。尽管现有的治疗手段已改善了患者的生存率，但这些治疗仍主要以缓解症状为主，而非针对其根本机制。因此，这些疗法疗效有限，且常引发严重不良反应4,5,6。要改进当前的治疗策略，必须深入了解其潜在的病理生理机制，这就需要建立合适的疾病研究模型。小型动物模型——尤其是小鼠模型——在心律失常研究中发挥着关键作用，因其可用于研究心律失常发生的关键机制，例如基因对细胞电生理、离子通道功能或钙处理的影响7,8。

为此，需要获取足量且具有足够活性的分离心房和心室心肌细胞。此前已有多种用于分离心房和心室心肌细胞的方法被报道9,10,11,12,13，一些研究团队已报道了从小鼠心房14或心室15心肌细胞同时记录L型钙电流与钙电流诱导的钙瞬变的数据。然而，据我们所知，目前尚无来自同一只动物的心房和心室细胞同步测量数据。研究人员关注的研究领域广泛，涵盖从电生理学到蛋白质组学、细胞收缩功能或蛋白质相互作用、线粒体功能以及遗传学等多个方面——这些研究均依赖于分离的心肌细胞。因此，许多已发表的实验方案并非专门为膜片钳研究设计，导致细胞得率较低，且细胞质量不足以满足膜片钳实验的要求。因此，现有实验方案无法实现从同一只动物分离的心房和心室细胞进行同步膜片钳与钙瞬变联合检测。

分离小鼠——尤其是心房——心肌细胞用于膜片钳实验仍然具有挑战性。本文提供了一种简单且快速的方法，通过逆行酶法Langendorff灌流分离高质量的小鼠心房和心室心肌细胞，从而可从同一只动物同时记录膜总电流和电流诱导的钙瞬变。本文详细阐述了从小鼠（包括野生型小鼠和携带基因突变的小鼠）分离心房和心室心肌细胞的实验方案。该方案适用于雄性和雌性小鼠。下文所述的心肌细胞分离、图像及代表性结果均来自6（±1）月龄的野生型C57Bl/6小鼠。然而，该方案已成功应用于不同基因型、年龄范围在2至24个月的小鼠。图1展示了分离装置以及在酶灌流过程中插管心脏的局部放大图像。

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方案

所有动物实验程序均经下萨克森州动物审查委员会（LAVES, AZ-18/2900）批准，并严格遵守所有机构、国家及国际动物福利指南进行。

1. 准备工作

  1. 根据提供的配方，配制 1 L 的 10 倍灌流缓冲液（表 1）、500 mL 的 1 倍灌流缓冲液（表 2）、50 mL 消化缓冲液（表 3）、10 mL 终止缓冲液（表 4）、1 L 台氏液（表 5）、每种钙梯度溶液各 10 mL（含葡萄糖及相应浓度钙的台氏液，具体浓度见说明）、1 L 4-AP 溶液（表 5）、100 mL 电极内液（表 6）以及 5 mL 普流尼克酸。
    注意：浴液（台氏液和 4-AP 溶液）可提前配制（不含葡萄糖），于 +4 °C 保存，实验当天加入葡萄糖。电极内液可于 -20 °C 保存，实验当天加入钙指示剂，之后置于冰上保存待用。10 倍灌流缓冲液可室温保存；1 倍灌流缓冲液、消化缓冲液和终止缓冲液应在实验当天新鲜配制。
  2. 打开水浴锅和滚轴泵。
  3. 用灌流缓冲液预填充兰格多夫装置，确保系统内无气泡。
  4. 在解剖显微镜下固定主动脉插管，连接装有 1 mL 灌流缓冲液的注射器，通过冲洗插管排除空气。
    注意：灌流系统中必须避免任何气泡，否则将直接影响冠状动脉灌流效果，进而影响组织消化效率。如有必要，可在装置中添加气泡捕获器，以确保无气泡残留。
  5. 准备培养皿，加入足量灌流缓冲液用于器官收集和显微观察（缓冲液应完全覆盖整个器官，几毫升即可，具体用量取决于所用培养皿的尺寸）。
  6. 准备 3 个含消化缓冲液的培养皿，用于组织解离和显微观察；缓冲液应足以覆盖器官，以便在相应培养皿中进行显微解剖。心室组织解离使用 3 mL，心房组织使用 1.5 mL。

2. 器官收获

  1. 使用1 mL注射器和27 G针头，向小鼠腹腔注射0.1 mL肝素（1,000 U/mL），并等待5-10分钟。
  2. 将小鼠放入诱导室中，同时放入一块浸有约500 µL异氟烷的小块组织。动物不应直接接触该组织。为避免接触，可使用塑料活检包埋盒覆盖组织。当动物完全麻醉后，检查趾夹反射，一旦反射消失，立即通过颈椎脱位快速处死小鼠。
  3. 将小鼠仰卧置于平台（例如覆盖有纸巾的泡沫板）上，并用针头固定四肢以保持其位置。
  4. 使用剪刀从胸骨上切迹向耻骨联合方向清晰地剪除覆盖胸部和部分腹部的毛发和皮肤，并在剑突下方剪开腹腔，注意不要损伤任何器官结构。用手术镊提起胸骨，沿肋骨边缘用剪刀剪断膈肌，然后在腋中线内侧剪断肋骨，移除胸廓以暴露心脏。
  5. 使用钝头镊小心去除心包膜，并用钝头镊从下方提起心脏，同时用剪刀一次性剪断大血管，迅速将心脏取出。
  6. 尽快将心脏放入室温灌流缓冲液中，并在显微镜下用钝头针穿刺主动脉进行插管。
    注意：去除附着在器官上的肺组织和脂肪组织时应迅速操作，避免耗时过长。插管时需确保针头末端不穿过主动脉瓣，否则会阻碍缓冲液进入冠状动脉，影响实验结果。
  7. 用缝合丝线将心脏牢固地绑在针头上，并与注射器断开连接。
    注意：从获取心脏（即剪断大血管的时刻）到将主动脉缝合至针头的整个过程应尽可能缩短时间。建议从取出心脏到开始灌流的时间不超过90-180秒。

3. 酶消化

  1. 主动脉插管后，立即将插管的心脏连接至Langendorff装置，避免任何空气进入系统。
    注意：在Langendorff装置底部悬挂一滴灌注缓冲液，同时在针头顶部放置一滴灌注缓冲液，有助于防止空气进入系统。
  2. 使用灌注缓冲液以精确37 °C的温度和精确4 mL/min的灌注速率对心脏进行灌注，持续1分钟。
    注意：为确保灌注针尖处温度达到37 °C，水浴温度需设定在略高于此值，约为40 °C。应通过测量灌注针尖处的温度定期验证该设置。
  3. 切换至消化缓冲液进行灌注，以精确37 °C的温度和精确4 mL/min的灌注速率持续灌注9分钟。
  4. 将消化后的心脏转移至含有足量消化缓冲液的培养皿中，确保其完全浸没。随后在显微镜下小心分离心房和心室。
  5. 将心房转移至含有1.5 mL消化缓冲液的培养皿中，心室则转移至另一含有3 mL消化缓冲液的培养皿中。
  6. 心房组织分离
    1. 迅速但小心地使用钝头镊子将心房组织撕分成微小碎片，避免不必要的延迟。
    2. 使用已剪切以扩大开口的1,000 µL移液枪头，轻柔地上下吹打，使组织溶解。
    3. 将溶液转移至15 mL离心管中，并通过沿管壁缓慢加入等体积的终止缓冲液（1.5 mL），轻柔吹打以终止反应。
    4. 将全部3 mL细胞/组织悬液小心地通过200 µm尼龙筛网过滤，以去除未完全消化的较大组织块。
      注意：成功的消化应几乎不残留固体团块。
  7. 心室组织分离
    1. 使用解剖剪迅速将心室组织剪成微小碎片，并用移液器上下吹打使其溶解。使用另一个1,000 µL移液枪头进行吹打操作，可将其缩短以扩大开口。
    2. 将细胞/组织悬液转移至15 mL离心管中，并通过沿管壁缓慢加入等体积的终止缓冲液（3 mL），轻柔吹打以终止反应。
    3. 将全部6 mL细胞/组织悬液小心地通过200 µm尼龙筛网过滤，以去除未完全消化的较大组织块。
      注意：成功的消化应几乎不残留固体团块。
  8. 将两支离心管（心房和心室细胞悬液）在室温下静置于实验台6分钟，使组织沉淀。
  9. 将两个15 mL离心管在5 × g 条件下离心2分钟。

4. 钙离子重新引入

注意：以下步骤对心房细胞和心室细胞均相同（除非另有说明），并在室温下进行。

  1. 使用塑料巴斯德吸管弃去上清液，并小心地将沉淀重悬于 10 mL 无钙台氏液中。
  2. 静置细胞 8 分钟以使其沉降。
  3. 以 5 × g 离心 1 分钟（仅心房细胞需要；心室细胞仅需沉降即可）。
  4. 弃去上清液，并小心地将沉淀重悬于 10 mL 含 100 µM 钙浓度的台氏液中。
  5. 静置细胞 8 分钟以使其沉降。
  6. 以 5 × g 离心 1 分钟（仅心房细胞需要；心室细胞仅需沉降即可）。
  7. 弃去上清液，并小心地将沉淀重悬于 10 mL 含 400 µM 钙浓度的台氏液中。
  8. 静置细胞 8 分钟以使其沉降。
  9. 以 5 × g 离心 1 分钟（仅心房细胞需要；心室细胞仅需沉降即可）。
  10. 弃去上清液，并小心地将沉淀重悬于 1 mL（心房细胞）或 5 mL（心室细胞）含 1 mM 钙浓度的台氏液中。

5. 使用荧光钙指示剂 Fluo-3 AM 负载心肌细胞

注意：由于荧光钙指示剂对光敏感，以下步骤应在避光条件下进行（例如，用铝箔包裹试管）。

  1. 通过将44 µL含20% Pluronic F-127的无水DMSO加入50 µg Fluo-3 AM中，制备Fluo-3 AM储存液（可于-20 °C避光保存）。
  2. 向1 mL细胞悬液中加入10 µL Fluo-3 AM储存液，室温避光孵育10分钟。
  3. 以5 × g离心1分钟。
  4. 用塑料巴斯德吸管弃去上清液，并将沉淀重悬于适量浴液中，以获得适宜的工作浓度（根据细胞密度使用1–5 mL浴液）。
  5. 实验开始前静置30分钟，以完成去酯化反应。

6. 同时进行膜片钳和落射荧光Ca2+瞬变测量，方法如前所述16

注意：膜片钳测量并非本文的主题，感兴趣的读者可参考主要出版物，这些出版物对这一方法提供了深入的描述17,18,19,20,21,22。然而，为了更好地整体理解，本文提供了一个测量L型钙电流以及电流诱导的钙瞬变的实验方案概要。

  1. 将心肌细胞转移至细胞记录室，并在37 °C下用灌流液进行灌流。
  2. 通过向灌流液中添加4-氨基吡啶和氯化钡来阻断钾电流，具体浓度见表5。
  3. 确保硼硅酸盐微电极的尖端电阻为2–5 MΩ，并用移液管溶液填充（表6）。
  4. 设置测量系统，以同时记录电信号和落射荧光信号。采用电压钳模式测量L型Ca2+电流，钳制电压程序为：将细胞钳制在-80 mV，随后施加持续600 ms的斜坡脉冲至-40 mV以失活快速Na+电流，再施加持续100 ms的测试脉冲至+10 mV，刺激频率为0.5 Hz（图2）。
  5. 使用488 nm激发光，检测发射光波长<520 nm的荧光信号，并根据以下静息平衡公式转换为[Ca2+]I浓度：
    静息平衡公式：\[ [Ca^{2+}]_i = k_d \left(\frac{F}{F_{max} - F}\right) \]。
    其中kd为Fluo-3的解离常数（864 nM），F为Fluo-3荧光强度；Fmax为每次实验结束时获得的Ca2+饱和状态下的荧光强度19。

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结果

在重新引入钙离子后，通过将10 µL细胞悬液移液至显微镜载玻片上测定分离得率。对于心房细胞分离，若每10 µL中可获得超过100个存活、杆状、非收缩性细胞；对于心室细胞分离，若每10 µL中可获得超过1,000个存活、杆状、非收缩性细胞，则认为得率充足，且通常使用本方案可达到该水平。采用本方案获得的心房细胞包含多种不同类型，包括心脏传导系统细胞（尤其是窦房结细胞），以及来自左右心房和心耳的不同心肌细胞。由于这些区域未被分别解剖，因此导致了多种细胞形态的存在。所有心房细胞均较小，细胞电容范围约为35 pF–100 pF，部分细胞比其他细胞更呈丝状。图3 面板A显示了来自心房工作心肌的典型细胞，该细胞已加载钙敏感性染料，可用于本方案下的测量。心室心肌细胞更呈杆状且体积较大，细胞电容范围为100至约400 pF，图3 面板B显示了来自工作心肌的典型心室细胞，该细胞已加载钙敏感性染料，可用于本方案下的测量。图4 展示了从一个心房心肌细胞（面板B和C）和一个心室心肌细胞...

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讨论

本文提供了一种简便且实用的方法，可从同一只小鼠中分离出高质量的心房和心室肌细胞，用于同时记录钙瞬变的膜片钳研究。所获得数据的质量在很大程度上取决于细胞分离的质量。如上所述，此前已有多种小鼠心肌细胞分离方法被报道9,10,11,12。分离得到的细胞可用于多种分析，包括膜片钳实验、收缩功能研究、形态学研究、蛋白质组学、线粒体功能研究等。不同研究目的需要采用不同优化条件的分离细胞。因此，以往的任何一种方案均未能实现从同一只小鼠中同时获得适用于膜片钳实验并可同步检测心房和心室肌细胞钙处理特性的高质量细胞分离。为解决这一问题，本方案在整合并改进多种已有方法的基础上建立而成。其中某些步骤在操作上具有机械性挑战，某些步骤需以特定方式进行，而另一些步骤则对分离质量至关重要。这些关键步骤将在下文进行详细讨论。

细胞分离的得率和质量随动物年龄增长而...

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致谢

本工作由德国研究基金会（DFG；血管医学临床科学家项目（PRIME），MA 2186/14-1 资助 P. Tomsits 和 D. Schüttler；VO1568/3-1、IRTG1816 和 SFB1002 项目 A13 资助 N. Voigt）、德国卓越战略计划下德国研究基金会（EXC 2067/1-390729940 资助 N. Voigt）、德国心血管研究中心（DZHK；81X2600255 资助 S. Clauss 和 N. Voigt；81Z0600206 资助 S. Kääb）、Corona 基金会（S199/10079/2019 资助 S. Clauss）、心血管疾病 ERA-NET 计划（ERA-CVD；01KL1910 资助 S. Clauss）、Heinrich-and-Lotte-Mühlfenzl 基金会（资助 S. Clauss）以及 Else-Kröner-Fresenius 基金会（EKFS 2016_A20 资助 N. Voigt）提供支持。资助方未参与稿件的撰写。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
2,3-丁二酮单肟Sigma-Aldrich31550
27G 套管针ServopraxL10220
4-氨基吡啶Sigma-AldrichA78403
无水 DMSOSigma-AldrichD12345
主动脉套管Radnoti130163-20
BaCl2Sigma-Aldrich342920
钝头手术镊Kent ScientificINS650915-4
牛犊血清Sigma-Aldrich12133C
CaCl2Sigma-AldrichC5080
循环加热水浴锅JulaboME
II 型胶原酶WorthingtonLS994177
解剖剪刀Kent ScientificINS600124
DL-天冬氨酸 K+-盐Sigma-AldrichA2025
EGTASigma-AldrichE4378
Fluo-3InvitrogenF3715
Fluo-3 AMInvitrogenF1242
葡萄糖Sigma-AldrichG8270
鸟苷-5′-三磷酸三钠盐Sigma-AldrichG9002
加热线圈Radnoti158821
肝素Ratiopharm25.000 IE/5ml
HEPESSigma-AldrichH9136
诱导室CWE incorporated13-40020
异氟烷Cp-pharma1214
带夹套的心脏室Radnoti130160
KClMerck1049360250
KH2PO4Sigma-AldrichP5655
MgCl × 6H2OSigma-AldrichM0250
MgSO4 × 7H2OSigma-AldrichM9397
Na2ATPSigma-AldrichA2383
Na2HPO4 × 2H2OSigma-AldrichS5136
NaClSigma-AldrichS3014
NaHCO3Sigma-AldrichS5761
尼龙网（200 µm）VWR-德国510-9527
巴斯德吸管Sigma AldrichZ331759
培养皿Thermo Fisher150318
普流罗尼克酸 F-127Sigma-AldrichP2443
丙磺舒Sigma-AldrichP8761
滚压泵IsmatecISM597D
手术镊Kent ScientificINS650908-4
手术剪Kent ScientificINS700540
缝合丝线精细科学工具NC9416241
注射器MerckZ683531-100EA
牛磺酸Sigma-Aldrich86330

参考文献

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