分离高质量小鼠心房和心室肌细胞用于同时检测Ca2+瞬变和L型钙电流

摘要

小鼠模型可用于研究心律失常发生的关键机制。为此，需要高质量的心肌细胞以进行膜片钳测量。本文介绍了一种通过逆行酶解Langendorff灌流法分离小鼠心房和心室肌细胞的方法，该方法可实现钙瞬变与L型钙电流的同步记录。

摘要

小鼠模型在心律失常研究中发挥着关键作用，可用于研究心律失常发生的关键机制，包括离子通道功能改变和钙处理异常。为此，需要高质量的心房或心室心肌细胞，以进行膜片钳测量或探究钙处理异常。然而，现有分离方案获得的高质量心肌细胞产量有限，无法在同一小鼠中同时进行这两项检测。本文介绍了一种通过逆行酶法Langendorff灌流分离高质量小鼠心房和心室心肌细胞的方法，可从同一只动物中同时检测钙瞬变和L型钙电流。获取小鼠心脏后，迅速插管至主动脉以清除血液。随后，先用无钙溶液（37 °C）对心脏进行初始灌流，以在闰盘水平解离组织；再用含少量钙的酶溶液灌流，以破坏细胞外基质（37 °C）。消化完成后，将心脏解剖分离为心房和心室。将组织样本切成小块，并通过轻柔吹打使其分散。随后终止酶消化过程，并逐步将细胞重新暴露于生理钙浓度环境中。在加载荧光Ca²⁺指示剂后，分离的心肌细胞即可用于钙电流与钙瞬变的同步测量。此外，本文还讨论了分离过程中的常见问题，并提供了膜片钳实验方案，以及上述方法分离的小鼠心房和心室心肌细胞中L型钙电流与钙瞬变同步测量的典型记录图谱。

引言

心律失常十分常见，是当前主要的医疗挑战之一，全球有数百万人受到影响。心律失常与高发病率和高死亡率相关^1,2，并且是大多数心源性猝死的根本原因³。尽管现有的治疗手段已改善了患者的生存率，但这些治疗仍主要以缓解症状为主，而非针对其根本机制。因此，这些疗法疗效有限，且常引发严重不良反应^4,5,6。要改进当前的治疗策略，必须深入了解其潜在的病理生理机制，这就需要建立合适的疾病研究模型。小型动物模型——尤其是小鼠模型——在心律失常研究中发挥着关键作用，因其可用于研究心律失常发生的关键机制，例如基因对细胞电生理、离子通道功能或钙处理的影响^7,8。

为此，需要获取足量且具有足够活性的分离心房和心室心肌细胞。此前已有多种用于分离心房和心室心肌细胞的方法被报道^9,10,

方案

所有动物实验程序均经下萨克森州动物审查委员会（LAVES, AZ-18/2900）批准，并严格遵守所有机构、国家及国际动物福利指南进行。

1. 准备工作

1. 根据提供的配方，配制 1 L 的 10 倍灌流缓冲液（表 1）、500 mL 的 1 倍灌流缓冲液（表 2）、50 mL 消化缓冲液（表 3）、10 mL 终止缓冲液（表 4）、1 L 台氏液（表 5）、每种钙梯度溶液各 10 mL（含葡萄糖及相应浓度钙的台氏液，具体浓度见说明）、1 L 4-AP 溶液（表 5）、100 mL 电极内液（表 6）以及 5 mL 普流尼克酸。
   注意：浴液（台氏液和 4-AP 溶液）可提前配制（不含葡萄糖），于 +4 °C 保存，实验当天加入葡萄糖。电极内液可于 -20 °C 保存，实验当天加入钙指示剂，之后置于冰上保存待用。10 倍灌流缓冲液可室温保存；1 倍灌流缓冲液、消化缓冲液和终止缓冲液应在实验当天新鲜配制。
2. 打开水浴锅和滚轴泵。
3. 用灌流缓冲液预填充兰格多夫装置，确保系统内无气泡。
4. 在解剖显微镜下固定主动脉插管，连接装有 1 mL 灌流缓冲液的注射器，通过冲洗插....

结果

在重新引入钙离子后，通过将10 µL细胞悬液移液至显微镜载玻片上测定分离得率。对于心房细胞分离，若每10 µL中可获得超过100个存活、杆状、非收缩性细胞；对于心室细胞分离，若每10 µL中可获得超过1,000个存活、杆状、非收缩性细胞，则认为得率充足，且通常使用本方案可达到该水平。采用本方案获得的心房细胞包含多种不同类型，包括心脏传导系统细胞（尤其是窦房结细胞），以及来自左右心房和心耳的不同心肌细胞。由于这些区域未被分别解剖，因此导致了多种细胞形态的存在。所有心房细胞均较小，细胞电容范围约为35 pF–100 pF，部分细胞比其他细胞更呈丝状。图3 面板A显示了来自心房工作心肌的典型细胞，该细胞已加载钙敏感性染料，可用于本方案下的测量。心室心肌细胞更呈杆状且体积较大，细胞电容范围为100至约400 pF，图3 面板B显示了来自工作心肌的典型心室细胞，该细胞已加载钙敏感性染料，可用于本方案下的测量。图4 展示了从一个心房心肌细胞（面板B和C）和一个心室心肌细胞.......

讨论

本文提供了一种简便且实用的方法，可从同一只小鼠中分离出高质量的心房和心室肌细胞，用于同时记录钙瞬变的膜片钳研究。所获得数据的质量在很大程度上取决于细胞分离的质量。如上所述，此前已有多种小鼠心肌细胞分离方法被报道^9,10,11,12。分离得到的细胞可用于多种分析，包括膜片钳实验、收缩功能研究、形态学研究、蛋白质组学、线粒体功能研究等。不同研究目的需要采用不同优化条件的分离细胞。因此，以往的任何一种方案均未能实现从同一只小鼠中同时获得适用于膜片钳实验并可同步检测心房和心室肌细胞钙处理特性的高质量细胞分离。为解决这一问题，本方案在整合并改进多种已有方法的基础上建立而成。其中某些步骤在操作上具有机械性挑战，某些步骤需以特定方式进行，而另一些步骤则对分离质量至关重要。这些关键步骤将在下文进行详细讨论。

细胞分离的得率和质量随动物年龄增长而.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2,3-丁二酮单肟	Sigma-Aldrich	31550
27G 套管针	Servoprax	L10220
4-氨基吡啶	Sigma-Aldrich	A78403
无水 DMSO	Sigma-Aldrich	D12345
主动脉套管	Radnoti	130163-20
BaCl2	Sigma-Aldrich	342920
钝头手术镊	Kent Scientific	INS650915-4
牛犊血清	Sigma-Aldrich	12133C
CaCl2	Sigma-Aldrich	C5080
循环加热水浴锅	Julabo	ME
II 型胶原酶	Worthington	LS994177
解剖剪刀	Kent Scientific	INS600124
DL-天冬氨酸 K+-盐	Sigma-Aldrich	A2025
EGTA	Sigma-Aldrich	E4378
Fluo-3	Invitrogen	F3715
Fluo-3 AM	Invitrogen	F1242
葡萄糖	Sigma-Aldrich	G8270
鸟苷-5′-三磷酸三钠盐	Sigma-Aldrich	G9002
加热线圈	Radnoti	158821
肝素	Ratiopharm	25.000 IE/5ml
HEPES	Sigma-Aldrich	H9136
诱导室	CWE incorporated	13-40020
异氟烷	Cp-pharma	1214
带夹套的心脏室	Radnoti	130160
KCl	Merck	1049360250
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P5655
MgCl × 6H2O	Sigma-Aldrich	M0250
MgSO4 × 7H2O	Sigma-Aldrich	M9397
Na2ATP	Sigma-Aldrich	A2383
Na2HPO4 × 2H2O	Sigma-Aldrich	S5136
NaCl	Sigma-Aldrich	S3014
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S5761
尼龙网（200 µm）	VWR-德国	510-9527
巴斯德吸管	Sigma Aldrich	Z331759
培养皿	Thermo Fisher	150318
普流罗尼克酸 F-127	Sigma-Aldrich	P2443
丙磺舒	Sigma-Aldrich	P8761
滚压泵	Ismatec	ISM597D
手术镊	Kent Scientific	INS650908-4
手术剪	Kent Scientific	INS700540
缝合丝线	精细科学工具	NC9416241
注射器	Merck	Z683531-100EA
牛磺酸	Sigma-Aldrich	86330