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墨西哥钝口螈心脏再生的冷冻损伤诱导及通过超声心动图与无偏定量组织学评估再生进程

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DOI：

10.3791/61966

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2021年5月10日

 , 
1Department of Clinical Medicine (Comparative Medicine Lab), Aarhus University

本文内容

摘要

本文介绍了一种对蝾螈心室心肌诱导冷冻损伤的手术方案。此外，还介绍了利用超声心动图无创评估再生过程中梗死面积比例的方案，以及通过无偏定量组织学方法对离体心脏进行精确测量梗死面积比例的方案。

摘要

有尾两栖类动物（如蝾螈和蝾螈科动物）是系统发育上最接近哺乳动物的物种，能够在心室切除后实现完全的心肌再生。心室切除模型为了解心脏修复过程中涉及的基本机制提供了基础性知识。然而，该模型与临床情况的相关性较差，因为在临床上，组织损伤、细胞凋亡、坏死、纤维化和心肌肥厚均为缺血性心肌梗死所导致的关键有害后果，而非单纯的组织切除。相比之下，冷冻损伤诱导的心肌梗死更接近于缺血性心肌梗死。本文详细描述了在墨西哥钝口螈（Ambystoma mexicanum）中实施冷冻损伤的实验方法，该模型为研究四足动物心脏修复的基本机制提供了一个有力工具。此外，我们还提供了通过超声心动图在活体中无创定量评估梗死面积的方法，以及通过无偏定量组织学在离体条件下精确测量梗死面积的技术。

引言

缺血性心脏病是全球主要的致死原因之一1,2。缺血诱导的心肌梗死会导致心肌细胞广泛死亡3。尽管及时的医疗干预可以降低即刻死亡的风险，但人类与传统的哺乳动物模型动物（如小鼠、大鼠、兔子、猪等）共有的继发性纤维化反应会导致瘢痕组织形成，最终可能引发心脏肥厚、心律失常和心力衰竭4。与哺乳动物不同，某些非羊膜动物模型（如斑马鱼5和蝾螈6）具有明确的心脏再生能力。传统上，这些物种的心脏再生研究主要在心室部分切除或钳夹损伤后进行5,6,7,8,9,10。然而，2011年，三个研究团队独立开发了在斑马鱼中通过冷冻损伤诱导心肌梗死的技术11,12,13。该冷冻损伤技术可导致斑马鱼心脏心室大部分区域发生坏死和凋亡，并伴随早期纤维组织积聚，相较于心室切除，更接近哺乳动物缺血性梗死后的心脏病理发展过程11,12,13。此外，将冷冻损伤诱导的心肌梗死与小鼠和猪冠状动脉结扎诱导的缺血性心肌梗死进行方法学比较后证实，冷冻损伤技术在哺乳动物模型中也是一种有效的替代方法14,15。受斑马鱼冷冻损伤模型相关方法的启发16,17，我们建立了类似的墨西哥钝口螈模型18，该两栖动物以其强大的再生能力而著称19，该模型可用于研究这种四足动物在组织损伤而非组织切除后心脏修复的相关机制。

本文详细介绍了一种在墨西哥钝口螈中实施冷冻损伤诱导心肌梗死的实验方案。我们特别强调了若干关键步骤，这些步骤具有快速、微创的特点，可提高动物存活率、促进恢复，并增强实验的可重复性。此外，我们还提供了利用超声心动图在体评估解剖学再生，以及利用无偏倚体视学方法进行定量组织学分析以离体评估再生效果的适当技术指导。

在蝾螈中，可通过冷冻损伤诱导心肌梗死，以研究这种四足动物心肌再生所涉及的基本机制。蝾螈对冷冻损伤诱导的心肌梗死具有耐受性，该损伤至少影响心室的45%，导致每搏输出量和心输出量下降，但由于其相对缓慢的生活方式，并不会引起行为学上的改变；然而，更严重的损伤可能会导致动物健康状况下降。

简而言之，为诱导冷冻损伤，需在麻醉后的墨西哥钝口螈胸部做一腹侧切口。通过钝性分离暴露心室，并将预冷的冷冻探针贴附于心室10秒以诱导冷冻损伤。随后缝合腹侧切口，动物可迅速恢复，意识恢复后未见行为异常。对照/假手术动物接受相同操作，但使用未冷却的冷冻探针。心脏功能可通过超声心动图进行监测（需使用高频超声系统，≥20 MHz），其在健康墨西哥钝口螈心脏中的应用已有详尽描述。20，并可在再生过程中无创且重复地估算梗死面积比例。在为期3个月的再生过程中的任意时间点，均可收获梗死心脏，进行冷冻切片以制备组织学样本，并采用标准流程（如伊红）染色 & 苏木精或马松三色染色）。特别是马松三色染色可清晰区分心室的梗死区域与健康组织。采用既往心脏研究中所述的体视学技术测定心室的梗死面积比例。21.

方案

本方案符合所有机构（奥胡斯大学）和国家（丹麦国家动物实验检查局方案编号# 2015−15−0201−00615）的动物护理法规和指南。

1. 冷冻探针的制备

  1. 将三根直径为1 mm的铜丝各剪成10 cm长的段。
  2. 将铜丝缠绕成一根线束。
  3. 使用气体喷灯将铜线束的一端熔化，形成直径为2 mm的球形端部。
    注意：铜具有较高的热导率（在0 °C时为401 W m-1 K-1），可在易于控制的温度下进行塑形（熔点为1084.6 °C），但铜表面随时间推移容易发生腐蚀，尤其是接触血液后会显著降低其热导率。因此，基于铜的冷冻探针需定期抛光。其他更稳定的可用于冷冻探针的金属包括银（在0 °C时热导率为428 W m-1 K-1，熔点为961.8 °C）和金（在0 °C时热导率为318 W m-1 K-1，熔点为1064.2 °C）。
  4. 从2 mL注射器上取下活塞，并移除柔软的橡胶头。
  5. 将铜线束的非球形端从注射器尾部穿入，并将其固定在活塞上。
  6. 将活塞重新插入注射器中（图1A）。
    注意：当冷冻探针不使用时，应将活塞完全拉回以保护铜线束；使用时，则需将活塞完全推入，使铜线束暴露于冷却浴中。

2. 冷冻损伤诱导的心肌梗死

  1. 将墨西哥钝口螈浸入200 mg/L的苯佐卡因麻醉剂中进行麻醉。浸入30分钟可获得约2.5小时的完全麻醉效果。
    注意：苯佐卡因不溶于水，应先溶于丙酮（每200 mg苯佐卡因使用3 mL丙酮），再将溶液加入水浴中。长时间浸泡在苯佐卡因中可能影响恢复，因此需密切监测在苯佐卡因中的处理时间。
  2. 将蝾螈腹侧朝上放置于手术皿中（右利手操作者可将蝾螈头部置于左侧）。用浸有麻醉液的擦拭纸包裹除胸部以外的所有身体部位以固定动物图1B).
    注意：将动物包裹在湿润的纱布中可确保为水生两栖动物提供必要的湿润环境，并避免在眼部使用兽用软膏。后续步骤中应使用经高压灭菌的器械，以确保手术过程中的无菌状态。
  3. 使用虹膜剪在胸腔正中线稍右侧的皮肤上做一个约1厘米长的纵向切口（图1C).
  4. 使用镊子分离胸带的软骨板。
    注意：胸带是一种精细的结构，操作时应小心避免损伤其组成部分，以免影响后续的伤口愈合、动物运动能力及福利。
  5. 轻轻切开暴露的心包膜，注意不要损伤 underlying 心脏结构。在心包液流出前，用带有钝头 2 Gauge 针头的 1 mL 注射器将其抽吸收集图1D).
  6. 将钝头镊子调至固定开口（约1 cm）后置于伤口内，以保持伤口边缘和软骨板分离（图1E).
  7. 将冷冻探针置于液氮中2 铜线暴露至少2分钟。
    注意：如果铜丝质量过小（即长度过短）或冷却不充分，可能导致不良的不完全透壁性冷冻损伤。
  8. 用棉签或紧实卷起的纸巾轻轻擦拭暴露的脑室，确保脑室表面无任何液体残留（图1F).
  9. 移除冷却至 -196 °C 来自液氮2 并将其直接应用于暴露的脑室（图1H）。它将附着于心室。冷冻探针应放置在心室侧壁并朝向心尖，以避免损伤其他心脏结构，并便于后续制备包含健康与梗死心肌的横向切片用于显微镜观察。10秒后，将先前收集的心包液涂抹于冷冻探针尖端（图1I）。这将使探针解冻，并使其从心室脱离。
    注意：在心室表面水分过多的情况下使用冷冻探针，可能导致冷冻梗死不完全（如果探针升温过快），或导致心肌损伤范围过大（如果覆盖心室全表面的薄层水被瞬间冻结）。这两种情况均不可取。若成功诱导冷冻损伤，心室表面将出现一个微小的红色环状肿胀图1J）。处理假手术动物时，以类似方式放置未冷却的冷冻探针，持续10秒（图1G).
  10. 将心包置于心室上方，移除用于保持切口开放的镊子，并重新调整肩带的软骨板。
    注意：如果后续需进行超声心动图以评估心脏功能，必须彻底清除所有气泡，包括软骨板下容易产生的微小气泡，因为这些气泡会引起成像伪影。可通过轻压组织或添加高压灭菌的两栖类林格氏液（6.6 g/L NaCl，0.15 g/L KCl，0.15 g/L CaCl₂）来去除这些气泡。2，0.2 g/L NaHCO₃3 用蒸馏水处理伤口表面以溶解气泡。
  11. 用可吸收缝线（6-0）缝合皮肤（3-5针）图1K).
  12. 用湿润的组织擦拭巾覆盖手术区域，擦拭巾需抬高置于伤口上方，然后用麻醉溶液浸透。
  13. 将盛有动物的手术皿置于冰上2小时，以促进伤口表皮的初步形成，封闭伤口边缘，防止动物暴露于非无菌水环境时发生感染。
  14. 将动物转移至含有水族箱水的洁净容器中。此时，动物应开始恢复意识。持续观察动物，直至其完全恢复意识并能协调运动。手术后两天内停止喂食和换水，并将墨西哥钝口螈单独饲养在独立的水族箱中，以确保伤口闭合后再引入外界干扰。
    注意：苏醒后，大多数墨西哥钝口螈有吞咽空气的倾向。为便于这一过程并减少所需活动量，术后1-2天内可短暂降低水族箱水位。术后24小时内可使用低浓度苯佐卡因（20 mg/L）作为镇痛剂。

3. 采用超声心动图无创测量梗死面积比例

  1. 按照步骤2.1所述方法对墨西哥钝口螈进行麻醉。
  2. 将动物置于盛有麻醉液的小容器中，使其呈仰卧位，麻醉液以覆盖腹面3-5 mm为宜。
  3. 将超声探头置于动物胸区正中线稍偏右侧的长轴位置。
  4. 为了进行梗死分数的二维评估 [IF(ultrasound, 2D)]，移动探头直至在B型超声模式下观察到梗死区域和心室显示最清晰图2A-D, 补充材料 1-2).
  5. 采集 ≥3 个心动周期的图像 > 50 帧/秒
  6. 在舒张末期测量心室的横截面积（CSAv）和梗死区域的横截面积（CSAi），并通过假设心室呈球形、梗死区域呈半球形，利用以下公式估算二维梗死分数：
    超声血流计算方程；展示用于心脏研究的CSAi和CSAv舒张期公式。 (1)
    注意：为了评估心室和梗死区域的几何形状假设，可将换能器旋转90˚，以显示心脏的短轴切面图2E-F, 补充材料 3).
  7. 为对梗死部分进行三维估算，将探头向左或向右移动，直至在心室舒张末期仅显示少量心室结构。
  8. 在0.5 mm（小型动物，体重 ≤ 20 g）或1 mm（大型动物，体重 > 20 g）将换能器在心室上移动，每个步骤/切面至少采集3个心动周期。
    注意：为获得合理的精确度，应获取 8 – 12 个切片（n）。
  9. 在每一切片（j）的舒张末期测量CSAv和CSAi，并利用以下公式在无需对心室和梗死区域形状进行任何几何学假设的情况下估算三维梗死分数[IF(超声, 3D)]：
    超声指数公式，三维，用于心脏舒张期分析的方程，临床研究 (2)
    注意：如 Dittrich 等（2018）的第 3 和第 6 节所述，可通过二维和三维图像采集以几何方法测量心脏功能（每搏输出量和心输出量）。20同样，通过脉冲波速度获得的速度时间积分（图2G) 也可用于测量心脏功能，具体方法如 Dittrich 等（2018）第 3 节所述20.
  10. 在步骤3.9中，将绘制的CSAv和CSAi感兴趣区域提取为二值掩膜，切片间z轴间距用于在舒张末期和收缩末期对心室和梗死区域进行三维建模图 2H, 补充材料 4).

4. 用于测量梗死分数的无偏定量组织学方法

  1. 探索步骤 2.2 至 2.6 中所述的麻醉状态下墨西哥钝口螈的心脏。
  2. 使用配备26号针头的1 mL注射器缓慢注射 5 µL/g 向静脉窦注入1000 IU/mL肝素化的两栖类任氏液，注入量为体重的相应体积，等待2分钟，使抗凝剂在循环系统中分布均匀。
  3. 通过断头和脑脊髓破坏法实施安乐死，随后剪断流入血管，再剪断流出道，完整切除心脏。
  4. 通过轻轻提起流出道，将心脏转移至60 × 15 mm培养皿2 含两栖类林格氏液的培养皿
  5. 在放大镜下，用100 IU/mL肝素化林格液轻轻灌注静脉窦，以冲洗心脏中残留的血液。
    注意：虽然可通过灌注缓冲甲醛或多聚甲醛对心脏进行预先固定，但由于切片将在冷冻条件下进行，此步骤并非必需。随后可在载玻片上对切片进行固定。充分洗涤后的心脏呈苍白或灰白色，无红细胞残留。心室和心房表面可能形成少量血凝块，但这不会影响后续定量组织学操作的精确性。
  6. 将心脏转移至无绒毛的滤纸上，轻压1分钟以吸去多余液体。
  7. 使用适当大小的冷冻模具，加入一滴最佳切割温度包埋剂，将心脏转移至该液滴中。轻轻挤压心脏，使其沉至底部。
  8. 在冷冻模具中加入更充足的包埋剂（optimal cutting temperature compound），确保心室位于底部。将模具静置5分钟，使包埋剂充分渗透至样本中。
  9. 将模具置于漂浮在液氮上的移液器吸头盒盖子上，快速冷冻模具。
    注意：为了更可控地进行速冻，心脏组织可在10-30%蔗糖溶液中保存1小时至过夜，然后使用液氮冷却的异戊烷（2-甲基丁烷）进行速冻。根据我们的经验，最终结果并无显著差异。
  10. 在设定为 -18 至 -20 °C 的冷冻切片机中对冷冻模具进行温度平衡22 °C 至少在切片前1 h。
  11. 部分取样于 10 µm 切片厚度并每隔10张收集一次th 切片以获得指定的薄片厚度（t） 100 µm继续切片，直至整个心脏完全切完。
    注意：可使用不同的切片和切块厚度，但必须确保在刀片接触心室的瞬间即开始收集切片，并且整个心脏至少被均匀地切成10–12块切块。每个切块可收集多个切片，以获得重复样本集。
  12. 使用苏木精标准方案染色组织切片 & 伊红或马松三色染色，以清晰区分心外膜、心肌层、瓣膜和梗死区域。
  13. 使用相机显微镜或切片扫描仪以足够的放大倍数对组织切片进行数字化，以便清晰显示墨西哥钝口螈心室的小梁结构（图 2I).
  14. 将图像堆栈载入 ImageJ（https://imagej.nih.gov/ij/index.html），并初始化细胞计数插件（https://imagej.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html）。
  15. 运行多功能网格宏（https://imagej.nih.gov/ij/macros/Multipurpose_grid.txt），并生成具有适当网格密度的点阵网格。
    注意：网格密度（网格面积）取决于样本大小和形态。为了达到理想的精确度，应确保网格点与每种目标结构的交点数至少为100–200个。
  16. 使用细胞计数插件，统计点阵网格与目标结构之间的交点数量图 2I，右侧为放大图）。
    注意：为了确保精确性，仅包含那些恰好出现在十字线目标点处的交点。
  17. 根据预定义的点阵网格面积 [Ai(p) 和 Av(p)]、切片厚度以及每片上的点阵网格交点数 (P)，计算梗死部分的比例j）与梗死心肌及全心室心肌的比值，使用公式：
    静力平衡方程，体视学方法，教学科研用公式 (3)

结果

在体重为 11.8 ± 1.3 g、总长度为 11.8 ± 0.5 cm 的墨西哥钝口螈中，使用直径为 2 mm 的冷冻探针进行冷冻损伤操作后，于损伤后第 7 天形成的心肌梗死区域占心室心肌的 45.4 ± 14.2%，此时梗死区域已完全形成[图 2I，比较梗死前健康心脏切片（上）与梗死后第 7 天切片（下）]。该操作的死亡率为 2.2%（90 只动物中有 2 只死亡）。该方法可产生边界清晰的损伤区域，可通过无创超声心动图进行可视化观察、定量分析和建模（图 2C-H，补充材料 1-4）。最初，冷冻损伤诱导的心肌梗死显著影响心脏功能，在损伤后第 7 天，每搏输出量降至损伤前的 62.2%，心输出量降至损伤前的 73.9%，随后在三个月内逐渐恢复结构与功能（数据未显示）。在相对安静的墨西哥钝口螈中，心肌冷冻损伤后未观察到行为学改变。

显示心脏模型上冷冻梗死的手术过程；包括设备和操作步骤。
图1：冷冻梗死操作流程。A，通过将三根铜丝缠绕成线圈，将尖端熔化成球形，并将导线连接到2.5 mL注射器的活塞上，制成一个定制的冷冻探针。B-L，冷冻梗死操作过程。除手术区域外，动物身体其余部分均用湿润的擦拭巾包裹（B），使用虹膜剪在胸腔中线右侧稍偏位置做腹侧切口（如B所示）（C），并通过残端解剖分离肩带。用切口轻轻打开心包膜，并使用钝头23号针头将心包液抽吸至1 mL注射器中（D）。暴露心室，用预设开口宽度的镊子保持切口开放（E），并擦去心室表面残留的液体（F）。假手术组使用未冷却的冷冻探针（G），操作方式与冷冻损伤相同；而在冷冻损伤组中，将置于液氮（-196 °C）中冷却的冷冻探针贴附于心室侧壁并朝向心尖方向（H）。10秒后，将心包液重新滴加至冷冻探针上，使其从心室脱离（I）。由此产生一个边界清晰的冷冻损伤区域（J）。最后，将心包膜和肩带复位覆盖心脏，并使用可吸收缝线对皮肤进行缝合（3–5针）（K）。将动物置于冰上静置2小时，以启动伤口愈合过程（L）。B-L中头侧朝左，代表惯用右手的外科医生操作时动物的方位。请点击此处查看该图的放大版本。

心脏成像示意图；梗死前后速度、心室收缩/舒张分析。
图 2：预期结果。A 和 B，健康蝾螈心室在舒张期（A）和收缩期（B）的 B 型长轴图像。C 和 D，冷冻损伤后（损伤后第 2 天）蝾螈心室在舒张期（C）和收缩期（D）的 B 型长轴图像。E 和 F，冷冻损伤后（损伤后第 2 天）蝾螈心室在舒张期（E）和收缩期（F）的 B 型短轴图像。G，脉冲波多普勒获取的梗死前（上图）和梗死后第 2 天（下图）心脏的速度-时间积分。H，基于三维超声采集数据建立的梗死前和梗死后第 2 天心脏模型。I，假手术后第 4 天（上图）和梗死后第 7 天（下图）通过蝾螈心室的代表性横断面组织学切片，采用马松三色染色。右侧放大图显示用于立体学测量梗死面积分数的点阵网格。蓝色和红色圆圈标记的点分别代表与健康组织（蓝色圆圈）和梗死组织（红色圆圈）的交界。在 A-D 中，头侧朝右；在 E-F 中，动物右侧朝左，此为超声心动图图像的标准显示方式。请点击此处查看该图的高清版本。

补充材料1： 长轴切面，心梗前健康心室，B模式（见图2A-B）。请点击此处下载该视频。

补充材料 2：长轴切面，梗死心室（梗死后 2 天），B 模式（见图 2C-D）。请点击此处下载该视频。

补充材料3：短轴切面，梗死心室（梗死后2天），B模式（见图2E-F）。请点击此处下载该视频。

补充材料4：与图2A-H及补充材料1-3中所示相同心脏在梗死前和梗死后的三维交互式模型。请在Adobe Acrobat Reader 9或更高版本中打开交互式PDF文件。单击模型以激活3D功能。使用光标旋转、缩放和平移模型。在屏幕左侧的模型树中，可激活/关闭任一片段或将其设为透明。模型树采用分层结构，包含多个可展开的子图层（通过选择+号展开）。请点击此处下载该文件。

讨论

为尽量减少实验变异，冰损伤手术应遵循无菌操作规程，并在正式开展特定再生实验前，先在多只动物身上进行手术训练。经过训练后，冰损伤操作可适用于多种体型和年龄的墨西哥钝口螈，从小型幼体（5 g，7 cm）到大型成体（100 g，25 cm）均可。至关重要的是，冷冻探针应具备足够的尺寸并充分冷却，以在墨西哥钝口螈心室上产生稳定且可重复的冰损伤。对于体型非常小的动物（5–8 g，7–9 cm），可使用直径较小的冷冻探针。虽然冰损伤操作必须使用具有镇痛特性的麻醉剂（如苯佐卡因和MS-222），或联合使用其他辅助镇痛药物，但后续的超声心动图检查可采用镇痛作用较弱的其他麻醉剂，例如丙泊酚；已有研究表明，丙泊酚对墨西哥钝口螈心脏功能的影响小于苯佐卡因和MS-22222。

冷冻损伤操作的局限性在于，它并非通过冠状动脉闭塞来诱导缺血性心肌梗死，因此与更接近人类心肌梗死临床病例的冠状动脉结扎方法相比，其模拟程度较低。然而，基于结扎的方法并不适用于小梁化的两栖动物心脏，因为这类心脏的冠状血管系统极为稀少，主要依赖心腔内的氧气供应。此外，已有研究指出，冷冻损伤所诱导的心肌梗死能够重现缺血性心肌梗死的大多数病理后果14,16。冷冻损伤产生的损伤区域高度局限于冷冻探针附近的组织；尽管这种损伤模式不同于冠状动脉阻塞所导致的复杂分支状梗死，但在实验条件下具有优势，因为健康组织与梗死组织之间的边界区域易于识别，便于研究新生心肌细胞的形成过程。

与斑马鱼相比，墨西哥钝口螈是一种体型明显更大的动物，其心血管系统也更为复杂，心脏由三个腔室（两个心房、一个心室）组成，并且存在功能上而非解剖学上的血流分隔，将含氧血与去氧血分流23，而硬骨鱼类则具有两个腔室的心脏和串联式血流系统。此前在斑马鱼中描述的冷冻损伤操作无需对切开的腹侧表面进行术后缝合16,17。但在墨西哥钝口螈中，这一步骤是必要的，以避免心脏过度暴露于实验动物实验室栖息环境中的非无菌水体中。

目前，在再生医学领域中，基于无偏立体学的定量组织学方法的应用报道较少，该领域大多数对梗死面积的定量测量仍依赖于在梗死区域中部的组织切片上绘制面积，有时还包括相邻的两个切片24。由于立体学概念可应用于任何模式物种的组织学检测，以提供更可靠且无偏倚的测量结果，我们建议将这种可免费获取的方法纳入心脏再生的定量评估体系中，不仅应用于墨西哥钝口螈，还应推广至所有具有再生能力的物种。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们希望感谢Casper Bindzus Foldager、Asger Andersen和Michael Pedersen（均来自奥胡斯大学临床医学系）以及David Gardiner（加州大学欧文分校发育与细胞生物学系），他们在蝾螈冷冻损伤模型的初步建立及超声检查方面提供了帮助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
S&T Scissor SAS-15S&T AG - Microsurgical Instruments虹膜切除剪刀
Vevo 2100Fujifilm, VisualSonics高频超声成像系统

参考文献

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