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复发性 大肠杆菌 由尿路感染引发的 Gardnerella vaginalis 小鼠膀胱暴露术

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DOI：

10.3791/61967

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2020年12月4日

 ,  ,  , 
1Department of Molecular Microbiology, Washington University School of Medicine in Saint Louis, 2Center for Women’s Infectious Disease Research, Washington University School of Medicine in Saint Louis, 3Center for Cellular Imaging, Washington University School of Medicine in Saint Louis, 4Department of Obstetrics and Gynecology, Washington University School of Medicine in Saint Louis, 5Department of Pediatrics, Washington University School of Medicine in Saint Louis, 6Fred Hutchinson Cancer Research Center, 7TESCAN USA, Inc., 8University of California San Diego

通讯作者： Nicole M. Gilbert <gilbert@wustl.edu>

本文内容

摘要

一种尿路致病性小鼠模型 E. coli (UPEC) 经尿道接种以建立潜伏性胞内膀胱储存库及随后的膀胱暴露于 G. vaginalis 展示了诱导复发性尿路致病性大肠杆菌（UPEC）尿路感染的方法。同时展示了细菌计数、尿液细胞学检查，以及用于扫描电子显微镜观察的膀胱原位固定与处理步骤。

摘要

由尿路致病性大肠杆菌引起的复发性尿路感染（rUTI） 大肠杆菌 尿路致病性大肠杆菌（UPEC）感染常见且治疗成本高。既往研究已描述了在雄性和雌性小鼠中建立尿路感染（UTI）模型的方法，包括细菌接种以及尿液和组织中细菌的定量检测。在C57BL/6小鼠初次膀胱感染期间，UPEC可在膀胱上皮细胞内建立潜伏性储存库，即使菌尿被清除后，这些储存库仍可持续存在。本模型在上述研究基础上，进一步探讨由潜伏性膀胱储存库中UPEC重新激活所导致的复发性尿路感染（rUTI）。该泌尿生殖道细菌 Gardnerella vaginalis 在该模型中，使用该菌作为rUTI的诱因，因为它常存在于女性泌尿生殖道中，尤其是在与尿路感染相关的阴道菌群失调背景下。此外，本文还描述了一种原位膀胱固定后接膀胱组织扫描电镜（SEM）分析的方法，该方法可能适用于其他涉及膀胱的研究。

引言

尿路感染（UTI）在全球范围内造成了沉重的医疗负担，每年影响数百万人的生活质量，尤其是女性1。尿路致病性大肠杆菌（Escherichia coli，UPEC）是导致尿路感染最常见的病因1。尽管通过抗生素清除了初次感染，仍有大量患者（约20–30%）在6个月内会经历复发性尿路感染（rUTI）2。不幸的是，多达5%的绝经前女性每年会经历3次或以上的rUTI3,4。rUTI的连续发作可能由初次感染中同一UPEC菌株的持续存在所引起5,6,7,8。来自人体样本和小鼠模型的研究数据表明，同菌株rUTI可能是由于UPEC存在于膀胱内的静息储存库中所致。在人类中，已在尿路感染患者的上皮细胞和膀胱活检组织中检测到UPEC9,10,11,12,13。在C57BL/6小鼠中的研究表明，某些UPEC菌株可在膀胱内建立静息的胞内储存库，通过荧光显微镜观察以及膀胱组织匀浆培养可检测到这些储存库，并可在菌尿症消退后持续数月14,15,16。使用可诱导膀胱上皮（尿路上皮）脱落的试剂（如硫酸鱼精蛋白17或壳聚糖18）处理膀胱，可触发UPEC从储存库中释放，从而引发rUTI。这些数据提示，在既往感染后膀胱内存有UPEC储存库的女性中，任何导致尿路上皮脱落的膀胱刺激因素均可能诱发rUTI。

越来越多的证据表明，阴道微生物群在尿路感染中起着重要作用19,20。Gardnerella vaginalis 是阴道和尿道微生物群中常见的成员之一21,22,23,24,25,26,27,28,29。在阴道中，高水平的 G. vaginalis 与一种称为细菌性阴道病（bacterial vaginosis, BV）的微生物失调相关，约影响30%的女性30,31,32。与阴道菌群以乳杆菌属（Lactobacillus）为主的女性相比，患有BV的女性发生尿路感染（UTI）的风险更高33,34,35,36,37。在小鼠模型中，G. vaginalis 可导致阴道38 和膀胱39 的上皮细胞脱落。在携带尿道致病性大肠杆菌（UPEC）膀胱储库的C57BL/6小鼠中，连续两次膀胱暴露于 G. vaginalis（而非PBS）可导致UPEC从储库中重新释放，引发UPEC反复性尿路感染（rUTI）。这一现象表现为：先前已清除UPEC菌尿的小鼠尿液中再次出现UPEC滴度，且在处死时其膀胱匀浆中的UPEC滴度较PBS暴露的对照组动物显著降低39。有趣的是，G. vaginalis 并未在膀胱中长期定植。在绝大多数情况下，仅需两次短暂暴露，每次尿液中可存活的 G. vaginalis 不足12小时（h），就足以诱发尿路上皮细胞脱落并促进rUTI的发生。

本方案描述了一种由定植于膀胱细胞内储存库中的尿路致病性大肠杆菌（UPEC）引发的复发性尿路感染（rUTI）小鼠模型，通过阴道加德纳菌（G. vaginalis）膀胱接种以诱导感染复发。该模型的创新之处在于，与先前使用的化学诱导剂相比，G. vaginalis 是一种具有临床相关性的生物学触发因素。此外，G. vaginalis 在小鼠泌尿道中存活时间相对较短，使得研究人员能够探究短暂微生物暴露对尿路上皮的影响，类似于性行为后可能发生的情况。除了阐述rUTI模型的建立方法外，本方案还介绍了尿液细胞学检测，以及通过扫描电子显微镜（SEM）对膀胱进行原位固定和尿路上皮成像的技术方法。

本实验方案采用携带卡那霉素抗性盒的尿路致病性大肠杆菌（UPEC）菌株UTI89（UTI89kanR）建立由G. vaginalis诱导的复发性尿路感染（rUTI）模型40。并非所有测试的UPEC菌株均能在小鼠急性感染阶段形成胞内细菌群落41，目前尚不清楚所有UPEC菌株是否均具备形成潜伏性胞内储存库的能力。在将其他UPEC菌株用于该模型前，应先验证其是否能够形成储存库。本方案使用一株自发产生链霉素抗性的G. vaginalis分离株JCP8151BSmR38。JCP8151BSmR诱导rUTI需要两次连续接种G. vaginalis，间隔时间为12小时或7天39。其他G. vaginalis菌株是否也能诱导尿路上皮脱落和/或UPEC rUTI，仍有待通过该模型进一步验证。必须使用已知抗生素抗性的UPEC和G. vaginalis菌株（例如UPEC对卡那霉素或壮观霉素耐药，G. vaginalis对链霉素耐药），因为在琼脂平板中添加相应抗生素可抑制小鼠内源性微生物群的生长，避免其干扰菌落形成单位（CFU）的计数，从而准确监测感染情况。这一点在培养尿液样本时尤为重要，因为小鼠尿液中常含有其他细菌，若无抗生素存在，这些细菌可能在培养平板上过度生长。这些内源性细菌的来源尚不明确，但很可能是在尿液采集过程中沾染的尿道周围及泌尿生殖道细菌。

G. vaginalis 是一种兼性厌氧细菌，因此本实验方案描述了在厌氧培养箱中培养 G. vaginalis JCP8151BSmR 的方法。若无厌氧培养箱，也可采用其他维持厌氧生长条件的方法（例如在密闭容器中使用 GasPak 厌氧袋）。此外，某些 G. vaginalis 菌株（包括 JCP8151BSmR）可在标准组织培养孵箱（5% CO2）中生长。与使用 JCP8151BSmR 以外的 G. vaginalis 菌株时需进行测试以确保细菌在该模型中表现一致类似，改变培养条件时也需通过实验确定培养时间（平板和液体培养）以及光密度（OD）600 的最佳值，以获得所需的活菌接种浓度。此外，目前尚不清楚培养条件是否会影响 G. vaginalis 的致病生物学特性。

最后，在考虑是否采用此模型时，研究人员应注意，该模型每组所需的动物数量可能多于典型的尿路感染小鼠模型。部分原因是，为诱导复发性尿路感染（rUTI），需确保小鼠能够清除由初始膀胱感染引起的尿路致病性大肠杆菌（UPEC）菌尿。因此，任何未能清除菌尿的小鼠（该表型通常提示存在持续性肾脏感染）将不被纳入实验的rUTI阶段。所需小鼠数量还受到以下因素影响： "自发的" 尿液中UPEC的出现（平均占12-14%）。最后，不同小鼠品系在形成慢性菌尿与胞内储存库的倾向性方面存在差异。42,43若在此模型中使用除 C57BL/6 以外的小鼠品系，必须确认动物能够形成静息状态的尿路致病性大肠杆菌（UPEC）胞内储存库。

方案

华盛顿大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准了所有小鼠感染实验及相关操作，作为方案编号20170081（已于2020年6月9日到期）和20-0031（将于2023年3月18日到期）的一部分。动物的整体护理符合美国国家研究委员会《实验动物护理与使用指南》以及美国农业部动物护理资源指南的要求。安乐死操作符合美国兽医协会《动物安乐死指南：2020年版》的规定。

小鼠实验流程图：UPEC储存库、G. vaginalis暴露、rUTI阶段、尿液细胞学、SEM。
图1. 小鼠模型示意图。 时间轴突出显示了本实验方案中所述模型的各个阶段或操作流程。第1阶段（橙色）： 建立胞内UPEC储存库。通过尿道接种UPEC至小鼠体内，并收集尿液样本，监测菌尿的清除情况。仅成功清除菌尿的小鼠进入后续阶段。第2阶段（绿色）： 膀胱暴露于G. vaginalis。小鼠通过尿道接种G. vaginalis两次。两次连续暴露之间的时间间隔为12小时（上图）或1周（wk；下图），具体取决于所需的下游分析。第3阶段（黄色）： UPEC反复性尿路感染（rUTI）。在G. vaginalis暴露后每日收集尿液，监测UPEC菌尿情况。此外，可在实验终点采集膀胱和肾脏组织，测定UPEC组织滴度。在1周暴露模型中，G. vaginalis诱导UPEC从胞内储存库中释放并随后从泌尿道清除，表现为膀胱组织中UPEC滴度降低（与PBS暴露小鼠相比，见图3D）。该滴度下降在12小时暴露模型中不明显，推测是因为需要更长时间才能实现足够的储存库释放和清除，从而显著降低组织滴度。操作A：尿液细胞学通常在第1阶段感染后1天（dpi）（甚至更早）进行，以评估急性UPEC感染；在第3阶段则用于评估尿液中中性粒细胞（PMN）含量，其水平与UPEC的释放相关。其他时间点收集的尿样也可进行类似分析。操作B：膀胱扫描电子显微镜（SEM）用于观察尿路上皮脱落，通常在12小时模型中第二次G. vaginalis暴露后3小时（即首次暴露给药后15小时）进行。也可评估其他时间点，例如第1阶段中UPEC接种后6–24小时。请点击此处查看此图的放大版本。

1. 在小鼠体内建立尿路致病性大肠杆菌的静息胞内存活库

  1. 准备导尿管（参见 44,45,46,47 用于此步骤的视频。
    1. 使用PE10导管穿接30号针头，使导管从针座延伸至针尖外数毫米。注意避免针尖刺破导管。 alternatively，可使用小儿静脉套管针46.
    2. 将制备好的导管放入培养皿中，用紫外光灭菌至少30分钟。盖上培养皿盖并密封，保存备用。
  2. 制备尿路致病性大肠杆菌（UPEC）接种物（第 -3 天至第 0 天）
    1. 第 -3 天：划线接种 UTI89kanR 来自 -80 °C 冻存菌种接种至Luria-Bertani（LB）琼脂平板上。将平板置于 37 °C 18–24 小时。
      注意：无需在接种物培养基中添加卡那霉素，因为UTI89菌株已稳定整合卡那霉素抗性基因。kanR.
    2. 第-2天：在无菌的125 mL锥形瓶中加入20 mL LB液体培养基，并接种一株UTI89单菌落kanR. 不要使用较小的锥形瓶，因为该培养方法对于诱导表达尿路致病性大肠杆菌（UPEC）的1型菌毛至关重要，而1型菌毛是膀胱黏附所必需的。
    3. 静置孵育（不振荡）于 37 °C 培养18-24小时。生长培养基中不要添加抗生素。仅使用LB平板上新鲜的菌落（培养18-24小时）来起始液体培养。
    4. 第 -1 天：传代培养 UTI89kanR 通过去除 20 µL 轻轻摇动锥形瓶使沉降的细菌重新悬浮，并取适量菌液接种于无菌的125 mL锥形瓶中的20 mL新鲜LB液体培养基中。按步骤2条件培养，但严格培养18小时。生长培养基中不添加抗生素。
    5. 第0天：将整个培养物转移至50 mL离心管中，于3200 × g 在台式离心机中离心10分钟以沉淀细菌。吸除上清液，并将细菌沉淀重悬于10 mL PBS中。
    6. 添加 100 µL 步骤4所得浓缩细菌悬液 900 μL 在比色皿中加入 PBS，测定 600 nm 处的光密度（OD）600使用已用 PBS 调零的分光光度计测定吸光度。将分光光度计读数乘以 10（以校正稀释倍数），得到 OD 值600 悬浮液的（OD悬浮液).
    7. 为达到所需的接种浓度 1 x 107 菌落形成单位在 50 µL，稀释（或浓缩）UTI89kanR 使用以下公式计算悬浮液的OD值，其中所需OD接种物 为0.35（该值可能因其他UPEC菌株而异），Y为所需接种液体积（100 µL 每只小鼠额外准备以排除气泡并填充导管：
      X mL × OD悬浮液 = Y mL × OD接种物
      例如，如果 OD悬浮液 值为4.7，需要5 mL接种物：
      X mL × 4.7 = 5 × 0.35
      X = (5 × 0.35) / 4.7
      X = 0.372 mL
      因此，加入 372 μL 加入细菌悬液至终体积为 5 mL
    8. 使用多通道移液器对接种物进行1:10系列稀释，直至10⁻⁸-6 在96孔板中的无菌PBS中。点样五个 10 µL 将全部6个稀释度的重复样本分别点样至LB和LB+Kan平板上，待斑点干燥后，于37℃倒置培养12-16小时 37 °C 过夜培养。不含抗生素的LB平板用于确认接种物未被其他生物污染（若被污染，则会在卡那霉素抗性筛选平板之外出现额外的菌落形态）。两种类型的平板应产生相同的结果。
      注意：平板应在使用前于实验台放置一天使其自然干燥，以确保其能够吸收所加液体且避免液滴融合。
    9. 统计稀释液中所有菌落可辨别的点位上的菌落总数，并利用该数值计算每次实验所用的实际接种剂量。不要仅依赖 OD 值。600 值。
  3. 接种 UTI89kanR 到麻醉的雌性小鼠膀胱中（第 0 天）
    注意：本实验操作的视频记录此前已发表44,46请参考这些论文以获取更详细的描述。有关小鼠插管的更多细节，请参见本方案的第5节。
    1. 采用经 IACUC 批准的方法，通过吸入异氟烷对小鼠进行麻醉。
    2. 在等待小鼠麻醉的过程中，用结核菌素注射器吸取 UTI89kanR 接种物，然后连接准备好的导管。下压活塞以排出导管内的空气，随后将导管蘸入无菌外科润滑剂中。
    3. 将小鼠仰卧放置，通过用力捏压小鼠足垫并观察其是否无反射或反应来确认麻醉效果。用双手食指定位膀胱（位于下腹部，触感如豌豆大小），将手指相互靠拢，轻柔挤压膀胱以排出尿液。
    4. 将导管经小鼠尿道插入膀胱，并缓慢注入 50 µL 接种物的量。
    5. 等待数秒后，轻轻将导管沿直线向外拔出。将小鼠放回笼中，并监测至其从麻醉状态恢复。
    6. 重复步骤 1.3.1 - 1.3.5，对额外的小鼠进行操作，每笼（5只小鼠）更换一次导管。如有需要，可采用相同程序用 PBS 接种对照组小鼠，例如用于展示另一菌株 G. vaginalis 诱发rUTI（超过自发性/背景水平）。

2. 监测尿路致病性大肠杆菌菌尿的清除情况（第1至28天）

注意：尿液采集过程的视频此前已发表44。

  1. 在感染后第1天以及之后每周（感染后第7、14、21和28天）通过膀胱按压法从小鼠收集尿液（最少10 µL），方法如文献44所述。为监测UPEC感染，尿液应在采集后数小时内进行培养。在接种前将尿液储存于4 °C。尿液也可用于细胞学分析（见第4节）。偶尔当膀胱严重炎症时，可能无法获得10 µL尿液；此时可加入PBS至总体积达10 µL，但尿液细菌滴度和细胞学评分必须相应校正（例如，若仅收集到5 µL尿液并加入5 µL PBS，则滴度和评分需乘以2）。
  2. 使用多通道移液器，在96孔板中用无菌PBS将样品进行1:10倍比稀释至10-6。使用P10多通道移液器，从第1列开始，将全部6个稀释度各10 μL以垂直方向点样于含有相应抗生素筛选标记的LB平板左侧边缘。弃去吸头。
  3. 依次对剩余样品（第2列、第3列等）重复点样操作。单个平板可并排容纳5个样品。由此形成一个5 × 6的点样矩阵，从上到下稀释度递增，从左到右样品编号递增（图2A）。
  4. 让点样液滴在台面上自然干燥，随后在37 °C过夜培养。次日，计数稀释度最低且菌落清晰可辨的点样区域中的菌落数量（图2B），并据此计算CFU/mL：
    单个尿液点样区域的菌落数 × 稀释倍数 × 100 = CFU/mL 尿液
  5. 使用绘图软件绘制UTI89kanR尿液滴度（图2C）。筛选在感染后第28天尿液中未检测到UTI89kanR的小鼠（约占C57BL/6小鼠的65–80%）。这些小鼠体内存在静息性胞内菌库，将在后续实验阶段用于研究复发性尿路感染的诱导。在第28天尿液中仍检出细菌的小鼠不纳入后续步骤。

3. 膀胱暴露于 G. vaginalis

  1. 将小鼠分配至暴露组（第29天）。此步骤的主要目的是避免将所有菌尿持续时间较长的小鼠集中在同一暴露组中，因为目前尚不清楚这是否会影响复发性尿路感染（rUTI）的发生概率。
    1. 使用尿液CFU数据（图 2D），根据UTI89感染后的时间点对小鼠进行分类kanR 菌尿已无法检测到（图2E).
    2. 将每类小鼠随机分配至以下任一组别 G. vaginalis 或PBS接种组；例如，在第7天前清除的半数小鼠获得 G. vaginalis 一半将接受PBS；在第8至14天清除病原体的一半小鼠将接受 G. vaginalis 一半将接受PBS等处理（如在 图 2E).
  2. 准备 G. vaginalis 接种物（所有步骤均在厌氧环境中进行）
    注意：不同菌株的理想培养孵育时间各不相同 G. vaginalis，部分菌株进入稳定期，甚至比其他菌株更快开始死亡。这一点尤为重要，因为已死亡的 G. vaginalis (JCP8151B) 无法引发反复性尿路感染（rUTI）39因此，应在小鼠实验前针对特定菌株通过实验确定孵育时间。目前尚不清楚其他/所有菌株是否具有相同特性。 G. vaginalis 将在该模型中引发相同的效应。
    1. 划线 G. vaginalis 菌株来自 -80 °C 将冻存菌种接种至NYCIII平板（不含抗生素）上。将平板置于 37 °C 厌氧培养24小时。
    2. 在厌氧工作站中，用5 mL厌氧NYCIII培养基接种 1 μL 从NYCIII平板上挑取一环菌体（单个菌落不足）并静置培养 37 °C 在厌氧条件下培养18小时。生长培养基中不要添加抗生素。
  3. 测定 OD600 使用分光光度计测量培养物的光密度。
    1. 离心指定体积（X）的培养物，条件为 9600 × g 1 分钟，吸除培养基。计算所需 PBS 体积（Y），用于重悬菌体沉淀，以获得目标接种量的 OD 值，达到 108 菌落形成单位在 50 μL 使用以下公式：
      X mL × OD培养 = Y mL × OD接种物 求解 Y
      Y = （X ml × OD培养) / OD接种物
      注意：OD接种物 JCP8151BSmR 是5，但这必须通过实验针对其他情况确定 G. vaginalis 菌株。例如，当离心3 mL的JCP8151B时SmR 过夜液体培养，OD值培养 = 2.0：Y = (3 mL × 2.0) / 5.0；因此用 1.2 mL PBS 重悬沉淀
    2. 将细菌沉淀用 PBS 重悬至所需浓度。对菌液进行连续稀释，并接种平板（如上文 CFU 平板接种方案所述），以确定每次实验实际使用的接种剂量。切勿仅依赖 OD 值。
  4. 在接种UPEC后的第29至31天，对麻醉小鼠进行接种 G. vaginalis 或按上述第1.3步所述使用PBS。设置PBS对照组至关重要，因为导尿操作本身可能造成膀胱损伤和尿路上皮脱落，从而引发一定程度的尿路致病性大肠杆菌（UPEC）储库重新出现. PBS接种小鼠因此作为对照组 G. vaginalis接种的小鼠进行比较。
    注意：最终的UPEC菌尿测定（28天）需要对CFU平板进行过夜培养，因此该步骤最早可在初始UPEC接种后的第29天进行。如有必要，最晚可延迟至第31天进行。研究人员应在不同实验间保持操作的一致性。
  5. 重复接种物的制备，以进行第二次给药 G. vaginalis （或 PBS 对照）在预定时间点（如首次接种后 12 小时或 1 周）进行接种。需要进行第二次暴露，因为单次接种 G. vaginalis 不会导致显著的UPEC出现39.

4. 监测尿路致病性大肠杆菌反复性尿路感染

  1. 在每次接种 G. vaginalis 后的预定时间点收集小鼠尿液（建议在接种后 1、2 和 3 天）。
    1. 将尿液进行系列稀释，并接种至选择性培养基（例如 LB+卡那霉素）上，以测定 UTI89kanR 的 CFU/mL。如需要，也可将尿液稀释液接种至其他选择性培养基（例如 NYCIII + 1 mg/mL 链霉素）上，以测定 G. vaginalis 的 CFU/mL。然而，G. vaginalis JCP8151BSmR 在大多数小鼠中于 12 小时内已被清除39。因此，若需在大多数小鼠中检测到 G. vaginalis，需采用更早的时间点。
  2. 在实验终点（例如第二次接种 G. vaginalis 后 3 天），按照批准的方法处死小鼠（例如在异氟烷麻醉下进行颈椎脱位或吸入 CO2），并采集膀胱和肾脏用于菌落形成单位（CFU）计数，具体方法如前所述44,46。

5. 尿液细胞学

注意：在需要观察尿液中细胞和/或细菌的任何时间点均可执行此操作。如图1所示，尿液细胞学检查通常在第1阶段感染后1天（dpi）（甚至更早）进行，以检测急性尿路致病性大肠杆菌（UPEC）感染，并在第3阶段对表现出UPEC出现的尿液中多形核（PMN）细胞的存在情况进行评估。

  1. 在带有滤膜和载玻片的细胞离心槽中，将 10 µL 尿液加入 90 µL PBS 中。（最简便的方法是使用尿液培养所用 96 孔板中 1:10 稀释液的剩余部分；若在 4 °C 下保存，这些样本可在尿液培养后 24 小时内使用）。将槽放入细胞离心机，以 600–800 x g 转速高速离心 6 分钟。
  2. 取出载玻片，室温下静置过夜使其干燥。次日，根据制造商说明书，使用血液学染色试剂盒（例如 Wright 染色、Giemsa 染色，包括固定液）进行染色。
  3. 通过光学显微镜观察载玻片，检测中性粒细胞（PMNs）和上皮细胞的存在情况。如需要，可根据每高倍视野中各类细胞的相对数量，采用半定量评分标准进行评分（例如，0=无，1=少量，2=中等量，3=大量）。分析载玻片的人员应处于对实验分组设盲的状态，以尽量减少潜在偏倚。

6. 通过扫描电子显微镜成像膀胱

注意：该操作可在需要观察尿路上皮的任何时间点进行。如图1（紫色框）所示，在UPEC接种后6小时至24小时的储菌库形成阶段，可最佳观察到UPEC与尿路上皮的相互作用；而在第二次暴露于G. vaginalis后的3小时至12小时内，可最佳观察到由G. vaginalis引发的尿路上皮脱落现象。

  1. 原位膀胱固定
    1. 在收获膀胱前立即配制固定液：将戊二醛（终浓度 2.5%）和多聚甲醛（终浓度 2%）加入含 2 mM CaCl2 的 0.15 M 二甲胂酸钠缓冲液中，调节 pH 至 7.4。使用新开封玻璃安瓿瓶中的多聚甲醛和戊二醛，因为这两种固定剂在容器开启后会随时间发生氧化。
      ​警告：戊二醛具有毒性、呼吸道刺激性和腐蚀性；多聚甲醛易燃、具有致癌性、刺激性以及生殖毒性；二甲胂酸钠具有毒性和致癌性。
    2. 配制 50 mL 固定液：将 6.25 mL 的 16% 多聚甲醛、2 mL 的 50% 戊二醛和 16.75 mL 超纯水加入 25 mL pH 7.4 的含 4 mM CaCl2 的 0.3 M 二甲胂酸钠溶液中。
    3. 在向膀胱灌注前，将配制好的固定液预热至 37 °C。
    4. 用结核菌素滑动接头注射器吸取固定液，并在末端连接一根导管，使针斜面朝向远离注射器刻度的一侧。从针尖末端剪去 1–2 mm 的多余导管，注意不要暴露针尖。轻弹注射器以去除气泡，并推动活塞，在微量离心管上方排出空气并充满导管中的固定液，以便收集废液并妥善处理。
    5. 采用批准的方法麻醉并处死小鼠（例如，在麻醉下进行颈椎脱位）。将小鼠仰卧固定于解剖板上（使用橡皮筋或大头针固定四肢）。用镊子和手术剪剪开小鼠盆腔区域以暴露膀胱。小心推开周围脂肪组织，但保持膀胱原位。
    6. 用惯用手握住注射器，使针头向下，针斜面和注射器刻度朝向远离操作者的方向。将导管尖端浸入无菌润滑剂中。
    7. 将导管尖端对准尿道口，注射器筒体保持在小鼠身体上方 30–45° 角的位置。
    8. 用导管尖端施加轻微向下的压力并做极小的顺时针旋转动作，轻柔地将导管插入尿道。当导管尖端进入尿道后，逐渐将注射器向小鼠尾部方向倾斜，同时继续将导管进一步推进尿道，直至注射器筒体与工作台面平行。整个导管针杆部分（不包括基部）应完全进入小鼠体内，使导管尖端位于膀胱腔内。
    9. 缓慢注入 50–80 µL 固定液，使膀胱像气球一样膨胀。保持导管位置不变，并略微抬高注射器，使针尖向上倾斜。
    10. 用另一只手打开止血钳，将其中一个钳臂从导管针下方穿过，位于尿道交界处。部分闭合止血钳，使其刚好接触针体。
    11. 在同时完全夹紧并锁定止血钳以防止固定液流失的同时，轻柔地将导管针从膀胱中滑出。
    12. 握住止血钳使其与工作台面平行，膀胱位于其上方。轻轻提起后，在止血钳下方（膀胱对侧）剪断组织，将膀胱连同止血钳一起取下。
    13. 将带有止血钳的膀胱放入含有预热固定液的 Falcon 管中。确保膀胱完全浸没于液体中，且未贴附在管壁上。于 4 °C 下孵育 24 小时。
  2. 膀胱组织处理及扫描电子显微镜（SEM）成像
    1. 使用洁净的双面剃须刀片沿矢状面将膀胱纵向切成两半，再沿与止血钳相切的方向做第二次切割，以释放膀胱。得到两个半膀胱“杯状”结构。若膀胱外表面仍有残留脂肪组织，应轻柔去除。
    2. 用 0.15 M、pH 7.4 的二甲胂酸钠缓冲液清洗膀胱半片三次，每次 10 分钟。
    3. 在室温下用含 1% 四氧化锇的 0.15 M 二甲胂酸钠缓冲液对组织染色 1 小时。四氧化锇对光敏感，因此需用铝箔包裹染色容器以保持避光环境。
      ​警告：四氧化锇具有毒性并对皮肤有腐蚀性。该步骤应在通风橱内戴手套操作。
    4. 用超纯水清洗膀胱半片三次，每次 10 分钟。在此过程中，水面上有时可见四氧化锇油状物。应吸除或用滤纸吸走该油层，以防止干燥步骤中的污染。
    5. 将组织浸入梯度乙醇溶液（50%、70%、90%、100%、100%）中进行脱水，每步 10 分钟。
    6. 使用临界点干燥仪对固定组织进行干燥，以最慢速度完成 12 次 CO2 交换。除排气步骤设为快速外，其余所有设置均设为慢速。
    7. 用洁净的双面剃须刀片再次将每个膀胱半片对半切开，共得到 4 块组织，以减少样本曲率，提高镀膜效率，便于 SEM 成像，并暴露可能在干燥过程中卷曲的组织区域。
    8. 将膀胱组织块粘附在铝载台的导电碳胶带上，并用牙签在底部接触点处涂抹少量银导电胶，注意避免胶水过多而沿毛细作用渗入膀胱内表面。
    9. 使用高真空溅射镀膜仪对样品载台进行 6 nm 厚的铱镀膜。若样品仍存在充电现象，应确保用银导电漆涂出导电通路，并额外再镀 4 nm 铱层。
    10. 使用扫描电子显微镜对样品进行成像。尽管成像条件可能因所用显微镜而异，但在 Zeiss Merlin FE-SEM 上使用 Everhart-Thornley（SE2）电子探测器时，加速电压 3 KeV、束流 200 pA、工作距离 12–13 mm 的参数组合效果良好。

结果

接种后，可在尿液中检测到尿路致病性大肠杆菌（UPEC）滴度（图2B）。若未将尿液样本接种至含有卡那霉素的选择性培养基上，内源性小鼠尿液微生物群可能过度生长，从而污染样本。UPEC菌尿水平在第1天通常较高，并可能在第一周内升高，随后在后期时间点下降（图2C）。约65%-80%的小鼠在感染后28天（dpi）时尿液中已无法检测到UPEC（图2C，绿色圆圈）。这些小鼠可用于模型的后续步骤。仍持续出现菌尿的小鼠（图2C，红色椭圆）应从实验中剔除。

两次连续的 G. vaginalis 暴露间隔 12 小时（图 3A）或 1 周（图 3B）可导致胞内储存库中的 UPEC 释放，从而引发反复性菌尿。与 PBS 对照组相比，暴露于 G. vaginalis 的小鼠其 UPEC 菌尿水平（Mann-Whitney 检验）以及表现出 UPEC 复发性尿路感染（rUTI）的小鼠比例（Fisher 精确检验）均显著升高。尿液细胞学分析在表现出 UPEC 释放的 G. vaginalis 暴露小鼠尿液中检测到中性粒细胞（PMNs）（图 3C）。在两次暴露间隔为 1 周的模型中，与 PBS 组相比，G. vaginalis 暴露小鼠膀胱组织中的 UPEC 滴度较低（图 3D），这可能是由于 UPEC 从储存库中释放后被清除所致。

通过扫描电镜观察原位固定的膀胱组织，显示经PBS处理的对照组小鼠膀胱表面由大量表层伞状尿路上皮细胞覆盖图4A）。尿路上皮脱落表现为表层伞状细胞丢失，揭示出暴露于相应处理的小鼠体内更深层的较小移行上皮细胞 G. vaginalis (图4B）。在UPEC接种后早期、胞内存活库形成初期，可在尿路上皮上观察到UPEC，并可见其从脱落细胞中伸出丝状结构（图4C).

细菌生长测定：琼脂平板上的菌落形成、稀释系列、小鼠感染时间线、数据图表。
图 2。I期（储库形成期）期间尿液中UPEC滴度的监测。 （A）菌落形成单位（CFU）涂布实验示意图。（B）LB+卡那霉素培养基上尿液样本中UPEC滴度的代表性图像。黑色圆圈标示应计数的尿液样本点，用于计算CFU/mL。（C）C57BL/6小鼠尿液中UPEC菌尿的时间进程。每条线代表一只单独的小鼠，追踪其尿液中UPEC滴度随时间的变化。虚线表示检测下限（1000 CFU/mL）。红色椭圆标示出20只小鼠中的4只未能清除UPEC菌尿，因此不适用于G. vaginalis诱导的复发性尿路感染模型。相反，绿色圆圈标示出已清除UPEC菌尿并进入后续实验阶段的小鼠。（D）用于生成C图所示曲线的数据表格。黄色表示可检测到CFU；绿色表示未检测到CFU。（E）根据尿液中UPEC CFU不再被检测到的时间点（“清除日”），将小鼠随机分配至不同暴露组。D图左侧列中的小鼠编号与E图中所列编号一致。请点击此处查看该图的放大版本。

UPEC 定量，Mann-Whitney 分析；图表与显微图像；膀胱感染研究。
图 3．G. vaginalis 诱发 UPEC 反复性尿路感染（rUTI）。在两次间隔 12 小时（A）或 1 周（B）的尿路暴露于 PBS（圆形）或 G. vaginalis （Gvag；方形）后，尿液中 UPEC 的滴度。每个符号代表一只独立的小鼠。绘制的是第二次暴露后 1–3 天内每只小鼠检测到的最高 CFU/mL UPEC 值。未检测到菌尿的小鼠数据绘制在检测限处（虚线）。 （C）尿液细胞学分析，显示 UPEC（箭头）和多形核（PMN）细胞（箭头）。比例尺 = 20 μm。（D）在两次间隔 1 周的尿路暴露后第 3 天采集的膀胱组织中的 UPEC 滴度。每个符号代表一只不同的小鼠，零值绘制在检测限处（虚线）。在 A、B 和 D 中，方框表示第一和第三四分位数，中位数以线标记，须线从最小值延伸至最大值。Mann-Whitney U 检验 * P < 0.05；** P < 0.01；**** P < 0.0001。请点击此处查看本图的放大版本。

植物表面结构的扫描电镜观察；细胞模式的显微图像分析。
图 4．原位固定的膀胱组织扫描电镜分析。 膀胱组织取自经两次PBS（A）或 G. vaginalis（C）暴露（间隔12小时）后3小时的小鼠。虚线标示单个尿路上皮细胞，G. vaginalis 暴露组膀胱中细胞更小，原因是表层的大细胞已脱落，暴露出下方的移行上皮。 （B）在模型第一阶段，初始接种UPEC后6小时采集的膀胱组织，显示尿路上皮脱落及细胞外UPEC。 （D）膀胱表面存在的不溶性脂肪滴示例。主图比例尺为20 μm，插图为2 μm。 请点击此处查看本图的放大版本。

讨论

在此模型中，第一个关键步骤是鉴定在初次尿路感染（UTI）阶段未能清除UPEC菌尿的小鼠。这些小鼠必须从实验中剔除，否则会干扰后续暴露于G. vaginalis后UPEC菌尿发生率的评估。在初次接种UPEC后，应每周采集尿液以监测细菌清除情况。约65–80%的C57BL/6小鼠可在4周内清除UTI89kanR感染。其他近交系小鼠对UPEC的清除能力及储菌库形成倾向各不相同42,43，因此可能不适用于本模型。第二个关键点是，已有实证研究表明，需进行两次连续的G. vaginalis接种（间隔12小时或1周），才能诱导出显著高于对照组（仅暴露于PBS）背景自发储菌库形成的储菌库。两次接种之间的其他时间间隔尚未经过测试，但可能产生类似结果。需要注意的是，仅在两次G. vaginalis暴露间隔1周的模型中观察到UPEC膀胱滴度的降低39。虽然可给予超过两次的暴露，但实验证据表明，仅重复导管插入操作本身就会增加储菌库的形成，这可能干扰结果解读，或需要增加动物数量以区分暴露组与对照组之间的差异。最后，原位 膀胱固定方法包含多个关键步骤。操作者需具备一定技能，以确保固定液保留在夹闭的膀胱内。膀胱塌陷将增加扫描电镜（SEM）成像的难度。向膀胱内注入固定液时必须格外轻柔，因为携带固定液的导管刮擦尿路上皮可能独立于G. vaginalis诱导的效应而引发尿路上皮脱落。固定液混合物中提及的所有浓度均为终浓度。若配比不当，可能导致固定不足，或细胞发生肿胀或收缩。固定液应预热至生理温度，以避免细胞和组织受到温度冲击。预热还可略微提高固定剂穿过质膜的扩散速率。尽管在用于扫描电镜分析的样品制备中，常可省略锇染色步骤，但在此方案中该步骤至关重要，用于稳定脂质并防止在临界点干燥过程中细胞膜开裂。

本方案可进行修改，以检测其他尿路致病性大肠杆菌（UPEC）和/或阴道加德纳菌（G. vaginalis）菌株形成储库的能力，以及触发其重新出现的能力。也可添加其他实验因素，例如暴露于其他阴道细菌（如卷曲乳杆菌 Lactobacillus crispatus PVAS100）或热灭活的 G. vaginalis，这两种处理在此模型中均不引起病理变化39。在选择其他待测细菌菌株时，重要的是要证明其生长具有一致性，以便在所有实验中使用标准化的接种浓度。JCP8151BSmR 的培养已在厌氧培养箱中优化。该菌株也可能在厌氧 GasPak 系统中培养，但需进行条件优化以确保细菌生长旺盛。最后，可能可以调整模型中某些步骤的时间安排。例如，可在 UPEC 储库形成阶段的早期时间点收集尿液，以监测菌落形成单位（CFU）或宿主反应。在此模型中，尚未观察到在早期时间点（感染后3、6、12小时）采集尿液样本对感染进展或储库建立产生不利影响。已有报道显示，给予两剂 JCP8151BSmR（间隔12小时或1周）后可诱导 UPEC 储库的重新出现，但其他时间间隔尚未测试。此外，可能还可以通过将 UPEC 储库形成阶段缩短至2周（而非4周）来减少整个实验周期，因为许多小鼠在此时已清除菌尿。先前研究在探讨化学剥脱剂处理膀胱后 UPEC 重新出现的情况时，采用了1周或2周的 UPEC 储库形成期17,18。然而，缩短 UPEC 菌尿清除时间可能导致需要更多动物被处死以满足实验要求。最后，可增加膀胱扫描电镜（SEM）分析的时间点，以观察 G. vaginalis 对尿路上皮作用持续的时间。

关于故障排除，在膀胱扫描电镜（SEM）分析中有一些特别需要注意的事项。根据所使用的小鼠品系及炎症程度的不同，某些膀胱的壁可能非常薄。这类膀胱在临界点干燥过程中更容易发生卷曲，形成类似宝螺的形状。若出现这种情况，最佳处理方法是沿卷曲界面将呈壳状的膀胱纵向切开成两半，然后再进行第二次切割，以去除大部分悬垂的组织。使用聚四氟乙烯（PTFE）涂层的双刃剃须刀片进行切割效果最佳。在锇酸染色步骤中，过量脂肪有时会溶解，可能导致产生不溶性脂肪滴，这些脂肪滴在后续的清洗和脱水步骤中难以去除，并可能在干燥过程中沉积于膀胱表面。这些脂肪滴在样品表面呈分散分布的小球状或盘状结构（图4D）。为减少此类问题，应在取材时尽可能彻底清除膀胱周围的脂肪组织。在镀膜时可用铂替代铱，但镀层厚度应尽可能薄，以避免掩盖精细的结构细节。强烈建议在镀膜过程中使用旋转样品台。

该模型的一个局限性在于需要使用大量小鼠。仅有65%-80%的C57BL/6小鼠能够清除其UPEC菌尿，从而适合后续的G. vaginalis或PBS接种（见图2C）。为了获得每组10-12只小鼠（G. vaginalis接种组与PBS对照组），最初应使用约30只小鼠进行UPEC感染。此外，通常需要进行多次实验，以获得检测统计学显著性所需的生物学重复数。当两次处理间隔1周时，在PBS处理组中，有14%的小鼠出现UPEC复发（图3B）。因此，若要以0.8的检验效能（alpha=0.05，单侧检验）检测到G. vaginalis暴露组相对于PBS对照组UPEC复发性尿路感染（rUTI）的显著增加，每种处理组至少需要累计测试40只小鼠。另一个需考虑的问题是，这些实验成本较高且劳动密集。必须每周监测小鼠是否清除了UPEC，而整个实验周期为4-5周，具体时长取决于G. vaginalis是间隔12小时给予两次，还是间隔1周给予两次。扫描电镜（SEM）操作较为耗时，且成本可能较高，具体取决于显微镜的可用性及服务费用。将整个膀胱用于SEM制样可提供充足的分析材料，但缺点是每只膀胱的分析过程可能非常耗时。因此，与用于尿液和组织滴度检测的较大小鼠数量相比，能够用于SEM分析的膀胱数量可能有限。此外，由于阴影可能影响可视性，要获得膀胱曲面结构——即"杯状结构"——的高质量图像需要较高的技术熟练度。尽管膀胱SEM是观察尿路上皮脱落的有用工具，但该方法主要是定性的。由于样品被固定为圆形结构，并且固定液中含有戊二醛，因此无法通过光学显微镜检测荧光表达的细菌。此外，由于戊二醛会导致大多数抗原发生交联，而锇酸会遮蔽抗原位点并使组织变暗，免疫染色和化学染料在此过程中均不适用。尽管如此，SEM技术仍可用于无需额外探针即可定量评估的参数，例如细胞大小48,49。

该模型相较于先前描述的方法具有多项优势。它能够研究由膀胱储存库中细菌重新激活所导致的尿路致病性大肠杆菌（UPEC）复发性尿路感染（rUTI）的机制，而非来自膀胱外源性再感染。其他因膀胱储存库释放细菌所致rUTI的模型通常使用化学试剂（如鱼精蛋白硫酸盐或壳聚糖）诱导尿路上皮脱落17,18，而这些化学物质在女性中并非rUTI的自然诱因。G. vaginalis 是一种常见的泌尿生殖道细菌，在部分女性通过导尿或耻骨上穿刺直接采集的膀胱尿液中已被检测到23,26。这一事实，结合已知的细菌性阴道病（BV，其特征为阴道内 G. vaginalis 过度增殖）与尿路感染之间的关联，提示 G. vaginalis 是临床上可能引发rUTI的诱因。最后，原位 膀胱固定法可有效保存膀胱的超微结构并减少损伤，确保膀胱各层组织不发生分离。传统的尿路上皮可视化方法通常要求操作者无菌取出膀胱，将其切开、拉伸并固定在解剖托盘上，然后将拉伸后的膀胱浸入固定液中48。该方法虽可获得非常平坦的样本，但无法保证组织被均匀或自然地拉伸，容易导致局部过度或不足拉伸（造成组织严重皱褶），并可能引起膀胱层间分离。此外，对膀胱进行拉伸和固定等物理操作本身也可能造成损伤，包括尿路上皮脱落。另一种方法是将完整的膀胱直接浸入固定液，随后包埋于石蜡中，并使用切片机获取薄切片。薄切片对于免疫组织化学实验以检测细菌和宿主蛋白定位极为重要，但无法用于观察尿路上皮表面结构。而本 扫描电镜（SEM）方法可实现对整个膀胱表面的一次性全面观察。

如上所述，该模型的未来应用包括测试其他尿路致病性大肠杆菌（UPEC）菌株，以确定它们是否形成细胞内储存库，并测试 其他 G. vaginalis 菌株，以评估它们是否引发上皮细胞脱落及UPEC释放，从而导致复发性尿路感染（rUTI）。也可测试除C57BL/6小鼠以外的其他小鼠品系，但不建议使用易于发展为慢性膀胱炎的小鼠（例如C3H背景的小鼠），因为这将导致实验中需要淘汰过多小鼠。C57BL/6小鼠的另一优势在于，目前市面上可获得多种基因敲除品系，这些品系为研究宿主因素在储存库形成和/或病原体释放过程中的作用提供了良好机会。

披露

作者声明他们与本研究无任何利益冲突。

致谢

作者感谢Lynne Foster在感染实验中的技术支持，感谢华盛顿大学细胞成像中心（WUCCI）的James Fitzpatrick提供扫描电镜（SEM）使用权限，感谢Scott Hultgren提供UTI89kanR UPEC菌株，以及感谢David Hunstad对稿件的审阅与宝贵意见。

本研究工作得到了美国国家科学基金会（VPO 的研究生研究奖学金 #DGE - 1143954）、华盛顿大学医学院女性传染病研究中心（NMG 的试点研究奖）、美国心脏协会（#12POST12050583，NMG；#14POST20020011，NMG）以及美国国立卫生研究院下属的国家过敏与传染病研究所（NIAID：R01 AI114635，ALL）和国家糖尿病、消化与肾脏疾病研究所（NIDDK：R21 DK092586，ALL；P50 DK064540-11，SJH，项目 II 负责人：ALL；K01 DK110225-01A1，NMG）的资助。部分动物实验在获得 NCRR 资助（C06 RR015502）的设施中完成。华盛顿大学细胞成像中心（WUCCI，扫描电子显微镜实验在此进行）及 MSJ 得到了华盛顿大学医学院、华盛顿大学与圣路易斯儿童医院儿童发现研究所（CDI-CORE-2015-505）、Barnes-Jewish 医院基金会（3770）以及国家神经疾病和中风研究所（NS086741）的支持。资助方在研究设计、数据收集与分析、发表决定或稿件撰写过程中均未参与。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
30G × 1/2 针头BD305106用于导管
5 1/2" 直型止血钳McKesson487377in situ 膀胱固定
ACE 600 溅射镀膜仪LeicaSEM 样品处理
铝制 SEM 样品台Ted Pella16111SEM 样品处理
氯化钙EMS12340in situ 膀胱固定
导电碳胶粘接片 Ted Pella16084-1SEM 样品处理
导电银漆Ted Pella16034SEM 样品处理
CPD 300 临界点干燥仪LeicaSEM 样品处理
Cytofunnel 金属夹SimportM964B尿液细胞离心分析
乙醇EMS15050SEM 样品处理
葡萄糖 SigmaG7528用于 NYCIII G. vaginalis 培养基
戊二醛EMS16320in situ 膀胱固定
Hema 3 染色试剂盒Fisher23123869尿液细胞离心分析
HEPESCellgro 25-060-Cl用于 NYCIII G. vaginalis 培养基
铱Ted Pella91120SEM 样品处理
异氟烷小鼠麻醉
卡那霉素Gibco11815024添加至 UPEC LB 选择性平板（50 µg/mL）
LB 琼脂BDDF0445174UPEC 生长平板
LB 肉汤BDDF0446173UPEC 生长培养基
Merlin 场发射扫描电镜Zeiss扫描电子显微镜
Milli-Q 超纯水系统MilliporeIQ-7000SEM 样品处理
NaCl SigmaS3014用于 NYCIII G. vaginalis 培养基
Olympus Vanox AHBT3 显微镜Olympus尿液细胞离心分析
四氧化锇EMS19170SEM 样品处理
多聚甲醛EMS15710in situ 膀胱固定
聚乙烯导管Intramedic427401用于导管
蛋白胨 #3 Fisher DF-122-17-4用于 NYCIII G. vaginalis 培养基
PTFE 涂层双刃剃刀片EMS72000用于 SEM 膀胱组织切片
Shandon 细胞离心机Thermo ScientificA78300002尿液细胞离心分析
Shandon Cytofunnel 滤膜SimportM965FWDV尿液细胞离心分析
Shandon 双孔 CytofunnelSimportM964-1D尿液细胞离心分析
Shandon 双孔细胞涂片（涂层）Thermo Scientific5991055尿液细胞离心分析
三水合二甲胂酸钠EMS12310in situ 膀胱固定
分光光度计BioChrom80-3000-45测定细菌 OD600
链霉素Gibco11860038添加至 G. vaginalis NYCIII 选择性平板（1 mg/mL）
结核菌素滑动针头注射器BD309659用于导管
酵母提取物 FisherDF0127-17-9用于 NYCIII G. vaginalis 培养基

参考文献

  1. Foxman, B. Urinary tract infection syndromes: occurrence, recurrence, bacteriology, risk factors, and disease burden. Infectious Disease Clinics of North America. 28 (1), 1-13 (2014).
  2. Foxman, B. Recurring urinary tract infection: incidence and risk factors. American Journal of Public Health. 80 (3), 331-333 (1990).
  3. Foxman, B. Epidemiology of urinary tract infections: incidence, morbidity, and economic costs. American Journal of Medicine. 113, Suppl 1A 5-13 (2002).
  4. Foxman, B. The epidemiology of urinary tract infection. Nature Reviews Urology. 7 (12), 653-660 (2010).
  5. Ikaheimo, R., et al. Recurrence of urinary tract infection in a primary care setting: analysis of a 1-year follow-up of 179 women. Clinical Infectious Diseases. 22 (1), 91-99 (1996).
  6. Russo, T. A., Stapleton, A., Wenderoth, S., Hooton, T. M., Stamm, W. E. Chromosomal restriction fragment length polymorphism analysis of Escherichia coli strains causing recurrent urinary tract infections in young women. Journal of Infectious Diseases. 172 (2), 440-445 (1995).
  7. Luo, Y., et al. Similarity and divergence of phylogenies, antimicrobial susceptibilities, and virulence factor profiles of Escherichia coli isolates causing recurrent urinary tract infections that persist or result from reinfection. Journal of Clinical Microbiology. 50 (12), 4002-4007 (2012).
  8. Schreiber, H. L. t, et al. Bacterial virulence phenotypes of Escherichia coli and host susceptibility determine risk for urinary tract infections. Science Translational Medicine. 9 (382), (2017).
  9. Rosen, D. A., Hooton, T. M., Stamm, W. E., Humphrey, P. A., Hultgren, S. J. Detection of intracellular bacterial communities in human urinary tract infection. PLoS Med. 4 (12), 329(2007).
  10. Elliott, T. S., Reed, L., Slack, R. C., Bishop, M. C. Bacteriology and ultrastructure of the bladder in patients with urinary tract infections. Journal of Infection. 11 (3), 191-199 (1985).
  11. Robino, L., et al. Detection of intracellular bacterial communities in a child with Escherichia coli recurrent urinary tract infections. Pathogens and Disease. 68 (3), 78-81 (2013).
  12. Robino, L., et al. Intracellular bacteria in the pathogenesis of Escherichia coli urinary tract infection in children. Clinical Infectious Diseases. 59 (11), 158-164 (2014).
  13. De Nisco, N. J., et al. Direct Detection of Tissue-Resident Bacteria and Chronic Inflammation in the Bladder Wall of Postmenopausal Women with Recurrent Urinary Tract Infection. Journal of Molecular Biology. 431 (21), 4368-4379 (2019).
  14. Mulvey, M. A., Schilling, J. D., Hultgren, S. J. Establishment of a persistent Escherichia coli reservoir during the acute phase of a bladder infection. Infection and Immunity. 69 (7), 4572-4579 (2001).
  15. Kerrn, M. B., Struve, C., Blom, J., Frimodt-Moller, N., Krogfelt, K. A. Intracellular persistence of Escherichia coli in urinary bladders from mecillinam-treated mice. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 55 (3), 383-386 (2005).
  16. Eto, D. S., Sundsbak, J. L., Mulvey, M. A. Actin-gated intracellular growth and resurgence of uropathogenic Escherichia coli. Cellular Microbiology. 8 (4), 704-717 (2006).
  17. Mysorekar, I. U., Hultgren, S. J. Mechanisms of uropathogenic Escherichia coli persistence and eradication from the urinary tract. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (38), 14170-14175 (2006).
  18. Blango, M. G., Ott, E. M., Erman, A., Veranic, P., Mulvey, M. A. Forced resurgence and targeting of intracellular uropathogenic Escherichia coli reservoirs. PLoS One. 9 (3), 93327(2014).
  19. Gilbert, N. M., Lewis, A. L. Covert pathogenesis: Transient exposures to microbes as triggers of disease. PLoS Pathogens. 15 (3), 1007586(2019).
  20. Lewis, A. L., Gilbert, N. M. Roles of the vagina and the vaginal microbiota in urinary tract infection: evidence from clinical correlations and experimental models. GMS Infectious Diseases. 8, (2020).
  21. Janulaitiene, M., et al. Prevalence and distribution of Gardnerella vaginalis subgroups in women with and without bacterial vaginosis. BMC Infectious Diseases. 17 (1), 394(2017).
  22. Fredricks, D. N. Molecular methods to describe the spectrum and dynamics of the vaginal microbiota. Anaerobe. 17 (4), 191-195 (2011).
  23. Hilt, E. E., et al. Urine is not sterile: use of enhanced urine culture techniques to detect resident bacterial flora in the adult female bladder. Journal of Clinical Microbiology. 52 (3), 871-876 (2014).
  24. Klein, S., et al. Significant increase in cultivation of Gardnerella vaginalis, Alloscardovia omnicolens, Actinotignum schaalii, and Actinomyces spp. in urine samples with total laboratory automation. European Journal of Clinical Microbiology Infect Dis. 37 (7), 1305-1311 (2018).
  25. Pearce, M. M., et al. The female urinary microbiome in urgency urinary incontinence. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 213 (3), 341(2015).
  26. Pearce, M. M., et al. The female urinary microbiome: a comparison of women with and without urgency urinary incontinence. mBio. 5 (4), 01283(2014).
  27. Gottschick, C., et al. The urinary microbiota of men and women and its changes in women during bacterial vaginosis and antibiotic treatment. Microbiome. 5 (1), 99(2017).
  28. Malki, K., et al. Genomes of Gardnerella Strains Reveal an Abundance of Prophages within the Bladder Microbiome. PLoS One. 11 (11), 0166757(2016).
  29. Kramer, H., et al. Diversity of the midstream urine microbiome in adults with chronic kidney disease. International Urology and Nephrology. 50 (6), 1123-1130 (2018).
  30. Allsworth, J. E., Peipert, J. F. Prevalence of bacterial vaginosis: 2001-2004 National Health and Nutrition Examination Survey data. Obstetrics & Gynecology. 109 (1), 114-120 (2007).
  31. Ravel, J., et al. Vaginal microbiome of reproductive-age women. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, Suppl 1 4680-4687 (2011).
  32. Hillier, S. L. Diagnostic microbiology of bacterial vaginosis. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 169 (2), Pt 2 455-459 (1993).
  33. Amatya, R., Bhattarai, S., Mandal, P. K., Tuladhar, H., Karki, B. M. Urinary tract infection in vaginitis: a condition often overlooked. Nepal Medical College Journal. 15 (1), 65-67 (2013).
  34. Harmanli, O. H., Cheng, G. Y., Nyirjesy, P., Chatwani, A., Gaughan, J. P. Urinary tract infections in women with bacterial vaginosis. Obstetrics & Gynecology. 95 (5), 710-712 (2000).
  35. Sharami, S. H., Afrakhteh, M., Shakiba, M. Urinary tract infections in pregnant women with bacterial vaginosis. Journal of Obstetrics and Gynaecology. 27 (3), 252-254 (2007).
  36. Hillebrand, L., Harmanli, O. H., Whiteman, V., Khandelwal, M. Urinary tract infections in pregnant women with bacterial vaginosis. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 186 (5), 916-917 (2002).
  37. Sumati, A. H., Saritha, N. K. Association of urinary tract infection in women with bacterial vaginosis. Journal of Global Infectious Diseases. 1 (2), 151-152 (2009).
  38. Gilbert, N. M., Lewis, W. G., Lewis, A. L. Clinical features of bacterial vaginosis in a murine model of vaginal infection with Gardnerella vaginalis. PLoS One. 8 (3), 59539(2013).
  39. Gilbert, N. M., O'Brien, V. P., Lewis, A. L. Transient microbiota exposures activate dormant Escherichia coli infection in the bladder and drive severe outcomes of recurrent disease. PLoS Pathogens. 13 (3), 1006238(2017).
  40. Wright, K. J., Seed, P. C., Hultgren, S. J. Uropathogenic Escherichia coli flagella aid in efficient urinary tract colonization. Infection and Immunity. 73 (11), 7657-7668 (2005).
  41. Garofalo, C. K., et al. Escherichia coli from urine of female patients with urinary tract infections is competent for intracellular bacterial community formation. Infection and Immunity. 75 (1), 52-60 (2007).
  42. Hannan, T. J., Mysorekar, I. U., Hung, C. S., Isaacson-Schmid, M. L., Hultgren, S. J. Early severe inflammatory responses to uropathogenic E. coli predispose to chronic and recurrent urinary tract infection. PLoS Pathogens. 6 (8), 1001042(2010).
  43. Hopkins, W. J., Gendron-Fitzpatrick, A., Balish, E., Uehling, D. T. Time course and host responses to Escherichia coli urinary tract infection in genetically distinct mouse strains. Infection and Immunity. 66 (6), 2798-2802 (1998).
  44. Conover, M. S., Flores-Mireles, A. L., Hibbing, M. E., Dodson, K., Hultgren, S. J. Establishment and Characterization of UTI and CAUTI in a Mouse Model. Journal of Visualized Experiments. (100), e52892(2015).
  45. Hannan, T. J., Hunstad, D. A. A Murine Model for Escherichia coli Urinary Tract Infection. Methods in Molecular Biology. 1333, 159-175 (2016).
  46. Zychlinsky Scharff, A., Albert, M. L., Ingersoll, M. A. Urinary Tract Infection in a Small Animal Model: Transurethral Catheterization of Male and Female Mice. Journal of Visualized Experiments. (130), e54432(2017).
  47. Thai, K. H., Thathireddy, A., Hsieh, M. H. Transurethral induction of mouse urinary tract infection. Journal of Visualized Experiments. (42), e2070(2010).
  48. O'Brien, V. P., et al. A mucosal imprint left by prior Escherichia coli bladder infection sensitizes to recurrent disease. Nature Microbiology. 2, 16196(2016).
  49. O'Brien, V. P., Dorsey, D. A., Hannan, T. J., Hultgren, S. J. Host restriction of Escherichia coli recurrent urinary tract infection occurs in a bacterial strain-specific manner. PLoS Pathogens. 14 (12), 1007457(2018).

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