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方法文章

慢病毒递送特异性shRNA对内质网应激神经元的分子调控

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DOI：

10.3791/61974

⸱

2021年4月24日

 ,  , 
1Instituto de Investigación Médica M y M Ferreyra, INIMEC-CONICET, Universidad Nacional de Córdoba

本文内容

摘要

在本研究中，使用特异性的shRNA敲低了PERK通路的两个下游信号组分——具有细胞保护作用的钙调磷酸酶以及促凋亡的CHOP。这两种组分以相反的方式调控原代皮层神经元在内质网应激诱导后发生神经突萎缩的易感性。

摘要

内质网（ER）中未折叠蛋白的积聚，由任何应激条件引起，会通过激活特化的感受器触发未折叠蛋白反应（UPR）。UPR 首先试图恢复稳态；但如果损伤持续存在，该信号通路将诱导细胞凋亡。

越来越多的证据表明，持续且未解决的内质网应激参与多种病理状态，包括神经退行性疾病。由于未折叠蛋白反应（UPR）通过在细胞保护和细胞凋亡过程之间转换来调控细胞命运，因此了解定义这一转变的关键事件及其调控因素至关重要。

最近，我们证明了异常的 GM2 神经节苷脂积聚会导致内质网 Ca2+ 含量减少，从而激活 PERK（PKR 样内质网激酶），即未折叠蛋白反应（UPR）的感受器之一。此外，PERK 信号通路参与了由 GM2 积聚诱导的神经突萎缩和细胞凋亡。在这方面，我们建立了一个实验系统，可对 PERK 下游组分的表达进行分子水平的调控，从而改变神经元发生神经突萎缩的易感性。

我们在大鼠皮层神经元培养物中进行了钙调磷酸酶（具有细胞保护作用）和CHOP（促凋亡）表达的敲低。细胞感染了由慢病毒递送的特异性shRNA，随后在不同时间点用GM2处理，固定后使用抗MAP2（微管相关蛋白2）抗体进行免疫染色。随后利用荧光显微镜记录细胞图像，并通过公共领域的图像处理软件ImageJ评估总 neurite（神经突）生长情况。抑制这些PERK信号通路组分的表达明显能够加速或延缓内质网应激所诱导的神经突萎缩。

该方法可用于内质网应激的细胞系统模型，以评估神经元对神经突萎缩的易感性。

引言

内质网（ER）应激是指任何损害该细胞器蛋白质折叠能力的扰动。未折叠蛋白在内质网腔内的积累会激活一种称为未折叠蛋白反应（UPR）的信号转导级联反应。这一复杂的信号通路由三种应激感受器协调：PERK（类似RNA依赖性蛋白激酶的内质网激酶）、IRE1（依赖肌醇的酶1）和ATF6（活化转录因子6）。这些通路共同作用以恢复稳态；但如果应激持续存在，UPR最终将通过凋亡诱导细胞死亡1。

PERK 是一种内质网跨膜蛋白，在内质网应激时可介导真核起始因子-2α（eIF2α）的磷酸化，从而降低全局蛋白质合成，减少内质网中的蛋白质负荷2。我们已证明，钙调磷酸酶A/B（CNA/B）——一种异源二聚体Ca2+依赖性磷酸酶——可直接结合PERK的胞质结构域，增强其自磷酸化，显著加强蛋白质翻译的抑制作用并降低细胞活力3,4。有趣的是，CNA/B在哺乳动物脑组织中含量丰富，并包含两种CN A亚基的同工型：α和β。

在持续的内质网应激下，PERK信号通路是唯一保持激活状态的未折叠蛋白反应（UPR）分支，因而介导了促存活和促凋亡两种细胞反应。在慢性应激阶段，一个主要的下游事件是转录因子CHOP（CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白）的诱导表达5。慢性内质网应激也被 increasingly 认识为多种病理性疾病（包括神经退行性疾病）的共同致病因素6。因此，理解UPR如何促进细胞保护性信号传导而非细胞死亡至关重要7。然而，目前对于调控这两种UPR阶段之间转换的精确机制仍知之甚少。

最近，我们发现，在培养的神经元中，神经节苷脂 GM2 会在内质网膜中积聚，并导致腔内钙离子耗竭。这继而激活 PERK 信号通路，介导神经突萎缩和细胞凋亡8。在本研究中，利用培养神经元中 GM2 的积聚作为内质网应激诱导神经突萎缩的细胞模型系统。具体而言，通过调控两种 PERK 相关因子 CN-Aα 和 CHOP 的表达，实现从早期/保护性事件向慢性/凋亡阶段的转换。为实现这一目的，对相应基因进行沉默处理；因此，原代皮层神经元培养物被携带特异性 shRNA 的慢病毒感染。Western 印迹分析显示，与携带乱序 shRNA 慢病毒的对照细胞相比，CN-Aα 和 CHOP 的表达水平显著降低。处理后，神经元接受不同时间的外源性 GM2 孵育，随后固定，并用抗微管相关蛋白 2（MAP2）抗体进行免疫染色9。使用落射荧光显微镜获取图像。以总细胞数量为基准，评估总的神经突生长情况。

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方案

动物实验操作均按照美国国立卫生研究院《实验动物护理与使用指南》批准的方案进行。本研究已获得INIMEC-CONICET-UNC动物护理与伦理委员会（CICUAL）的批准（决议编号：014/2017 B 和 006/2017 A）。

1. 大鼠原代皮层神经元培养

  1. 麻醉E18天的Wistar孕鼠，使用CO₂2 含有80% CO的培养室220% O₂2 暴露60秒后，通过脱位颈椎处死。
  2. 在超净工作台中执行以下步骤。使用3号镊子和直头尖细弹簧剪刀从胚胎中取出脑组织。材料表) 加入细胞培养皿中的Hanks溶液。
  3. 在20倍放大镜下使用5号精细镊子解剖组织，将额叶皮层与脑膜分离。将额叶皮层转移至15 mL锥形管中，加入3–4 mL 0.25%胰蛋白酶-EDTA，在37 °C孵育15分钟，进行化学消化。
  4. 消化后，用3-4 mL含10%胎牛血清（FCS）的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）稀释，然后在不含Ca²⁺和Mg²⁺的磷酸盐缓冲液中洗涤3次2+/毫克2+ 游离的Hanks平衡盐溶液和0.1%葡萄糖通过离心（3000 g，5分钟）去除。
  5. 使用1000 µL枪头在DMEM加10% FCS中上下吹打10次，机械解离组织材料表然后以100 × g离心1分钟，收集上清液，并用溶剂定容至1000 µL。
  6. 将细胞悬液以520个细胞/mm的密度接种于细胞培养皿中2 含10% FCS、1%青霉素/链霉素和1%必需氨基酸添加剂的2 mL DMEM（见 材料表。然后在含5% CO₂的湿润环境中37 °C孵育2 2小时。
    1. 细胞培养皿的有机物去除与聚-L-赖氨酸包被
      1. 将玻璃材料放入反应室，加入96%乙醇至刚好浸没材料，以去除有机物。然后逐滴加入68%（w/v）硝酸，直至出现黄绿色气泡。一旦出现该现象，将容器部分盖住，继续反应至不再发生爆鸣为止。
        注意：在气体抽提柜中去除有机物，以避免接触有毒气体。
      2. 在使用多聚赖氨酸包被前，用无菌Mili-Q水冲洗玻片约十次。随后将培养玻片和培养皿置于0.1 μg/μL多聚赖氨酸溶液中孵育4小时。孵育结束后，再用无菌Mili-Q水冲洗玻片约十次。
  7. 为促进神经细胞分化，将培养基更换为无血清的Neurobasal培养基，并添加无血清补充剂（材料表。将培养物置于37 °C、5% CO₂条件下培养2 直至治疗开始。

2. 慢病毒生产

注意：靶向 CN-Aα 亚型或 CHOP 的 3'非翻译区（3'UTR）序列的寡核苷酸，以及非靶向序列（随机序列）列于表1中。

  1. 退火时，将两条具有互补序列的单链寡核苷酸以等摩尔量混合，使用退火缓冲液（10 mM Tris-HCl，pH 7.5–8.0，50 mM NaCl，1 mM EDTA）。
  2. 在 95 °C 加热 2 分钟，然后将样品从加热块或水浴中转移至室温台面上缓慢冷却。将所得产物[带有黏性末端的短发夹 RNA（shRNA）]稀释至终浓度为 0.5 µM，分装后于 -20 °C 保存。
  3. 将 shRNA 插入片段克隆至带有绿色荧光蛋白（GFP）作为绿色荧光标记的慢病毒载体 pLKO.3G 中。具体操作如下：在无菌离心管中加入以下组分，用 EcoRI 和 PacI 限制性内切酶消化 1 µg 载体：2 µL 10× 限制性内切酶缓冲液（100 mM bis-Tris propane-HCl，pH 6.5，100 mM MgCl2，1 mg/mL 牛血清白蛋白），1 µL 浓度为 1 µg/µL 的 pLKO.3G，0.5 µL 浓度为 10 U/µL 的 EcoRI，0.5 µL PacI（10 U/µL），以及 16 µL 无菌去离子水。
    1. 用移液器轻轻混匀，于 37 °C 孵育反应 3–4 小时。
      注意：通常无需过夜消化，否则可能导致 DNA 降解。
  4. 连接时，将已消化的载体与插入片段按 3:1 的摩尔比混合，并加入 T4 DNA 连接酶及其配套的连接缓冲液（由生产商提供），于 16 °C 过夜孵育。
    注意：此时连接反应产物可暂存于 4 °C，待后续使用。
  5. 用连接产物转化 DH5α 感受态细胞（材料表）或其他合适的大肠杆菌（E. coli）菌株，操作步骤如下：
    1. 将感受态E. coli与全部连接反应液混合，在冰上静置 15 分钟，随后置于 42 °C 水浴中 2 分钟，再放回冰上冷却 15 分钟。
    2. 将热激处理后的全部反应液转移至 15 mL 离心管中，加入已预热至 37 °C 的 LB 液体培养基补足体积至 1000 µL。在摇床中于 37 °C、约 330 rpm 条件下振荡培养细菌 90 分钟。
    3. 在 4 °C 条件下以 5,000 × g 离心 5 分钟，弃去 900 µL 上清液，保留剩余上清液用于重悬菌体沉淀。将菌液均匀涂布于含氨苄青霉素（100 µg/mL）的固体 LB 培养板上。
    4. 于 37 °C 培养过夜后观察菌落生长情况。此时可将平板置于 4 °C 保存 4–5 天。
    5. 挑取单个菌落接种至含 10 mL LB 液体培养基和氨苄青霉素（100 µg/mL）的 50 mL 离心管中，于 37 °C、约 330 rpm 条件下振荡培养过夜。
    6. 在 4 °C 条件下以 5,000 × g 离心 5 分钟收集菌体，弃去上清液，保留细菌沉淀。该沉淀可于 -20 °C 保存。
  6. 根据生产商说明书，使用质粒DNA提取试剂盒从细菌沉淀中提取质粒DNA（材料表）。通过测定 260 nm 处的吸光度并乘以稀释倍数来计算 DNA 浓度，换算关系如下：A260 = 1.0 相当于 50 µg/mL 纯的双链（ds）DNA。

3. 慢病毒感染

注意：慢病毒制备操作需在 II 级生物安全柜中进行。

  1. 转染前24小时，将1-5 × 106个HEK 293细胞接种至直径100 mm的培养皿中，加入8 mL生长培养基，于37 °C、5% CO2条件下过夜培养。
  2. 取14 µg带有特定插入片段的pKLO.3G载体、10.5 µg包装质粒psPAX和3.5 µg包膜质粒pMD2.G（材料表），混合均匀。将45 µL质粒转染试剂（材料表）用700 µL低血清培养基（材料表）稀释，在室温下孵育5分钟。随后将DNA混合物与稀释后的转染试剂混合，轻轻混匀，并在室温下孵育20分钟。
  3. 与此同时，将HEK 293细胞培养皿（转染时细胞融合度约为70%）中的培养基更换为新鲜DMEM培养基。然后逐滴加入全部体积的DNA溶液，轻轻摇动培养皿。转染后无需再更换或添加培养基。
  4. 将细胞在37 °C、5% CO2条件下继续培养48–72小时，使shRNA达到最佳转导效率，并通过荧光显微镜观察GFP荧光进行检测。之后收集含慢病毒的培养上清，置于4 °C保存。
  5. 使用0.45 µm尼龙膜过滤病毒上清液，将滤过液分装为每份1 mL。随后在17,000 × g条件下离心4小时，弃去上清液，保留沉淀。让不可见的沉淀自然干燥，干燥后储存于-80 °C。
    1. 通过流式细胞术进行病毒滴度测定。将4 × 105个HEK 293细胞接种于24孔板中，于37 °C培养24小时。然后将病毒颗粒重悬于200 µL DMEM培养基（材料表）中，分别向各孔加入0.05、0.02和0.005 µL病毒液。
    2. 病毒感染培养72小时后，吸除培养基，加入0.05%胰蛋白酶溶液1 mL消化3分钟。加入1 mL含10%胎牛血清（FCS）的DMEM培养基终止消化，500 × g离心5分钟。弃去上清液，用PBS洗涤沉淀两次。
    3. 将沉淀用100 µL PBS重悬，再加入100 µL含2%多聚甲醛（PFA）的PBS溶液固定细胞。使用流式细胞仪分析细胞，测定GFP阳性细胞的百分比。记录该数据，并利用以下公式计算病毒滴度：
      病毒滴度
      GFP细胞计算公式，显示通过稀释因子分析病毒表达的方程。

4. 采用抗MAP2抗体对神经节苷脂GM2累积诱导应激的原代神经元培养物进行免疫细胞化学分析

  1. 用靶向 CN-Aα 或 CHOP 的 3' 非翻译区（UTR）的特异性 shRNA 寡核苷酸感染原代皮层神经元培养物（体外培养 15 天），并在 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育2 1天。
    注意：7-8天的原代皮层神经元培养 体外 如果细胞表现出较高的神经突生长，也可使用该方法。
    1. 配制500 µM的神经节苷脂GM2乙醇储备液，并超声处理1小时。
    2. 向培养皿的培养基中加入 GM2 储存液，使其终浓度为 2 µM。置于 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育。2 16、24 和 48 小时。
  2. 使用部分培养物制备细胞匀浆，用于 Western 印迹分析（抗体特异性参见 材料表).
  3. 按照步骤1.4和1.5操作，然后在37 °C下用含120 mM蔗糖的4% PFA PBS溶液固定细胞20分钟，随后用PBS洗涤。此操作应在湿盒中的防滑膜上进行。之后加入通透液（PBS中含0.2% Triton X-100）处理5分钟，并用PBS洗涤。
    1. 用 PBS 稀释的 5% BSA 室温封闭 45 分钟，然后加入抗 MAP2 抗体（用封闭液按 1:800 稀释），4 °C 过夜孵育。
    2. 孵育时间结束后，用 PBS 洗涤两次，然后与二抗孵育（材料表) 1小时。然后用PBS洗涤细胞，并使用水溶性封片剂将盖玻片封于载玻片上。材料表).

5. 神经突萎缩分析

  1. 使用配备CCD相机的倒置落射荧光显微镜及20倍空气物镜（数值孔径NA 0.8）获取图像。利用ImageJ插件分析图像：将图片载入ImageJ后，点击处理 | 减去背景以去除背景信号。
  2. 点击图像 | 调整 | 阈值，或按下以下按键：Ctrl（或Cmd）+ Shift + T。此时将弹出窗口用于调节最小值，使轴突和胞体的轮廓清晰可辨。点击二值化图像（神经突和胞体呈白色），使用自由手绘选区工具删除胞体区域，所选胞体区域将重新变为黑色。
  3. 选中剩余轨迹，点击编辑 | 选区 | 创建选区。通过同时按下Ctrl（或Cmd）和T键获取感兴趣区域（ROI）并保存该选区。打开原始图像，然后在ROI管理器面板中选择之前保存的对应ROI，并将其应用至原始图像。
  4. 当ROI轨迹叠加至图像后，按下Ctrl（或Cmd）和M键（即分析 | 测量）。此时将弹出测量结果窗口，复制其中的平均值（任意单位a.u.）用于后续统计分析。
    注意：若需以µm为单位获取测量值，请点击分析 | 设置标尺，此时将弹出设置窗口。请根据所用显微镜的具体参数，正确输入标尺信息（分析 | 设置标尺）。

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结果

在此，我们探讨在内质网应激细胞模型中，沉默 PERK 下游的两个组分是否影响未折叠蛋白反应（UPR）的转换阶段。为实现这一目标，我们针对 CN-Aα 基因和 CHOP 基因分别设计两种特异性的 shRNA 序列进行沉默表1在原代神经元细胞培养中孵育1天10通过蛋白质印迹法分析表达图1 和 图2). 在敲低细胞中，ER应激介导的CN-Aα和CHOP升高受到明显抑制，而在对照细胞（shRNA乱序序列）中则无此现象。需要注意的是，在该处理条件下，基础水平的CN表达未受影响。

我们还通过原代神经元培养物的MAP2免疫染色，检测了GM2累积诱导的内质网应激与神经元变性之间可能存在的关联（图3 和 图4）。<...

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讨论

我们描述了一种实验系统，该系统能够在神经元细胞模型中实现从存活到凋亡性未折叠蛋白反应（UPR）阶段转变的分子调控。

为了准确分析神经突萎缩，必须获得具有大量、细长且高度分支突起的原代神经元培养物9,11这有助于观察神经元突起的延伸情况，从而能够清晰地检测出不同处理之间的差异。需要注意的是，如果在7-8天时的原代皮层神经元培养 体外 已表现出显著的神经突起生长时，可直接用于诱导应激并进行后续分析，无需培养15天 体外 培养物。

此外，对内质网应激介导的CHOP过表达的抑制率应达到约65-70%或更高。重要的是，CN-Aα表达水平的沉默应仅影响内质网应激诱导的CN-Aα表达升高，而不改变其基础表达水平。这是为了尽量减少对与PERK信号通路无关的CN功能的影响12,13

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披露

作者无竞争性财务利益。

致谢

我们感谢 Gonzalo Quasollo 博士在成像方面提供的宝贵帮助，以及 Andrea Pellegrini 博士在细胞培养技术上的支持。

本研究得到了以下机构资助：美国国立卫生研究院（#RO1AG058778-01A1，UTHSCSA 与 Instituto Investigación Médica M y M Ferreyra 之间的子协议第 165148/165147 号）以及阿根廷国家科学技术促进局（ANPCyT，PICT 2017 #0618）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Alexa Fluor 488 抗小鼠抗体Thermo Fisher Scientific#R37120
抗CHOP抗体Thermo Fisher# MA1 - 250
抗CN-AαMillipore# 07-067
抗GM2抗体Matreya#1961
抗MAP2抗体Sigma Aldrich# M2320
抗-β-肌动蛋白抗体Thermo Fisher# PA1 - 183
抑肽酶Santa Cruz Biotechnology#3595
Axiovert 200 正置荧光显微镜Zeiss
B27添加剂Life Technologies#17504944
杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）Life Technologies#11966025
EcoRIPromega#R6011
胎牛血清（FCS）Life Technologies#16000044
尖头镊子 型号 #5Dumont
镊子型号 #3Dumont
HEK 293细胞系ATCC#CRL-1573
IRDye 680 CW 二抗LI-COR Biosciences#92632221
IRDye 680 二抗LI-COR Biosciences#92632220
IRDye 800 CW 二抗LI-COR Biosciences#92632210
IRDye 800 CW 二抗LI-COR Biosciences#92632211
慢病毒包膜质粒 pMD2.GAddgene#12259
慢病毒包装质粒 psPAX2Addgene#12260
慢病毒载体 pLKO.3GAddgene#14748
亮抑蛋白酶肽半硫酸盐Santa Cruz Biotechnology#295358
Lipofectamine LTX & Plus 试剂（质粒转染试剂）Life Technologies#A12621
MISSION shRNASigma Aldrich
单唾液酸神经节苷脂 GM2Matreya#1502
NanoDrop 2000 核酸蛋白测定仪Thermo Scientific
Neurobasal 培养基Life Technologies#21103049
硝酸纤维素膜 0.45 µmBIO-RAD#1620115
Odyssey 近红外成像系统LI-COR Bioscience
OneShot Top 10 感受态细胞Life Technology#C404010
Opti-MEM（低血清培养基）Life Technologies#105802
PacIBioLabs#R0547S
青霉素-链霉素Life Technologies#15140122
胃蛋白酶抑制剂ASanta Cruz Biotechnology#45036
苯甲基磺酰氟Santa Cruz Biotechnology#329-98-6
聚-L-赖氨酸sigma aldrichP#2636
直头精细小弹簧剪Fine Science Tools
T4 DNA连接酶Promega#M1801
胰蛋白酶-EDTA 0.25 %Life Technologies#25200056
Vibra-Cell 超声波液体处理器（VCX 130）Sonics
Wizard plus SV 小量质粒DNA纯化系统Promega#A1330

参考文献

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