在本研究中，使用特异性的shRNA敲低了PERK通路的两个下游信号组分——具有细胞保护作用的钙调磷酸酶以及促凋亡的CHOP。这两种组分以相反的方式调控原代皮层神经元在内质网应激诱导后发生神经突萎缩的易感性。
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摘要
摘要
内质网（ER）中未折叠蛋白的积聚，由任何应激条件引起，会通过激活特化的感受器触发未折叠蛋白反应（UPR）。UPR 首先试图恢复稳态；但如果损伤持续存在，该信号通路将诱导细胞凋亡。
越来越多的证据表明，持续且未解决的内质网应激参与多种病理状态，包括神经退行性疾病。由于未折叠蛋白反应（UPR）通过在细胞保护和细胞凋亡过程之间转换来调控细胞命运，因此了解定义这一转变的关键事件及其调控因素至关重要。
最近，我们证明了异常的 GM2 神经节苷脂积聚会导致内质网 Ca2+ 含量减少，从而激活 PERK（PKR 样内质网激酶），即未折叠蛋白反应（UPR）的感受器之一。此外，PERK 信号通路参与了由 GM2 积聚诱导的神经突萎缩和细胞凋亡。在这方面，我们建立了一个实验系统，可对 PERK 下游组分的表达进行分子水平的调控，从而改变神经元发生神经突萎缩的易感性。
我们在大鼠皮层神经元培养物中进行了钙调磷酸酶（具有细胞保护作用）和CHOP（促凋亡）表达的敲低。细胞感染了由慢病毒递送的特异性shRNA，随后在不同时间点用GM2处理，固定后使用抗MAP2（微管相关蛋白2）抗体进行免疫染色。随后利用荧光显微镜记录细胞图像，并通过公共领域的图像处理软件ImageJ评估总 neurite（神经突）生长情况。抑制这些PERK信号通路组分的表达明显能够加速或延缓内质网应激所诱导的神经突萎缩。
该方法可用于内质网应激的细胞系统模型，以评估神经元对神经突萎缩的易感性。
引言
内质网（ER）应激是指任何损害该细胞器蛋白质折叠能力的扰动。未折叠蛋白在内质网腔内的积累会激活一种称为未折叠蛋白反应（UPR）的信号转导级联反应。这一复杂的信号通路由三种应激感受器协调：PERK（类似RNA依赖性蛋白激酶的内质网激酶）、IRE1（依赖肌醇的酶1）和ATF6（活化转录因子6）。这些通路共同作用以恢复稳态；但如果应激持续存在，UPR最终将通过凋亡诱导细胞死亡1。
PERK 是一种内质网跨膜蛋白，在内质网应激时可介导真核起始因子-2α（eIF2α）的磷酸化，从而降低全局蛋白质合成，减少内质网中的蛋白质负荷2。我们已证明，钙调磷酸酶A/B（CNA/B）——一种异源二聚体Ca2+依赖性磷酸酶——可直接结合PERK的胞质结构域，增强其自磷酸化，显著加强蛋白质翻译的抑制作用并降低细胞活力3,4。有趣的是，CNA/B在哺乳动物脑组织中含量丰富，并包含两种CN A亚基的同工型：α和β。
在持续的内质网应激下，PERK信号通路是唯一保持激活状态的未折叠蛋白反应（UPR）分支，因而介导了促存活和促凋亡两种细胞反应。在慢性应激阶段，一个主要的下游事件是转录因子CHOP（CCAAT/增强子结合蛋白同....
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方案
动物实验操作均按照美国国立卫生研究院《实验动物护理与使用指南》批准的方案进行。本研究已获得INIMEC-CONICET-UNC动物护理与伦理委员会（CICUAL）的批准（决议编号：014/2017 B 和 006/2017 A）。
1. 大鼠原代皮层神经元培养
- 麻醉E18天的Wistar孕鼠，使用CO₂2 含有80% CO的培养室220% O₂2 暴露60秒后，通过脱位颈椎处死。
- 在超净工作台中执行以下步骤。使用3号镊子和直头尖细弹簧剪刀从胚胎中取出脑组织。材料表) 加入细胞培养皿中的Hanks溶液。
- 在20倍放大镜下使用5号精细镊子解剖组织，将额叶皮层与脑膜分离。将额叶皮层转移至15 mL锥形管中，加入3–4 mL 0.25%胰蛋白酶-EDTA，在37 °C孵育15分钟，进行化学消化。
- 消化后，用3-4 mL含10%胎牛血清（FCS）的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）稀释，然后在不含Ca²⁺和Mg²⁺的磷酸盐缓冲液中洗涤3次2+/毫克2+ 游离的Hanks平衡盐溶液和0.1%葡萄糖通过离心（3000 g，5分钟）去除。
- 使用1000 µL枪头在DMEM加10% FCS中上下吹打10次，机械解离组织材料表
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结果
在此，我们探讨在内质网应激细胞模型中，沉默 PERK 下游的两个组分是否影响未折叠蛋白反应（UPR）的转换阶段。为实现这一目标，我们针对 CN-Aα 基因和 CHOP 基因分别设计两种特异性的 shRNA 序列进行沉默表1在原代神经元细胞培养中孵育1天10通过蛋白质印迹法分析表达图1 和 图2). 在敲低细胞中，ER应激介导的CN-Aα和CHOP升高受到明显抑制，而在对照细胞（shRNA乱序序列）中则无此现象。需要注意的是，在该处理条件下，基础水平的CN表达未受影响。
我们还通过原代神经元培养物的MAP2免疫染色，检测了GM2累积诱导的内质网应激与神经元变性之间可能存在的关联（图3 和 图4）。<.......
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讨论
我们描述了一种实验系统，该系统能够在神经元细胞模型中实现从存活到凋亡性未折叠蛋白反应（UPR）阶段转变的分子调控。
为了准确分析神经突萎缩，必须获得具有大量、细长且高度分支突起的原代神经元培养物9,11这有助于观察神经元突起的延伸情况，从而能够清晰地检测出不同处理之间的差异。需要注意的是，如果在7-8天时的原代皮层神经元培养 体外 已表现出显著的神经突起生长时，可直接用于诱导应激并进行后续分析，无需培养15天 体外 培养物。
此外，对内质网应激介导的CHOP过表达的抑制率应达到约65-70%或更高。重要的是，CN-Aα表达水平的沉默应仅影响内质网应激诱导的CN-Aα表达升高，而不改变其基础表达水平。这是为了尽量减少对与PERK信号通路无关的CN功能的影响12,13
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披露
作者无竞争性财务利益。
致谢
我们感谢 Gonzalo Quasollo 博士在成像方面提供的宝贵帮助，以及 Andrea Pellegrini 博士在细胞培养技术上的支持。
本研究得到了以下机构资助：美国国立卫生研究院（#RO1AG058778-01A1，UTHSCSA 与 Instituto Investigación Médica M y M Ferreyra 之间的子协议第 165148/165147 号）以及阿根廷国家科学技术促进局（ANPCyT，PICT 2017 #0618）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Alexa Fluor 488 抗小鼠抗体 | Thermo Fisher Scientific | #R37120 | |
| 抗CHOP抗体 | Thermo Fisher | # MA1 - 250 | |
| 抗CN-Aα | Millipore | # 07-067 | |
| 抗GM2抗体 | Matreya | #1961 | |
| 抗MAP2抗体 | Sigma Aldrich | # M2320 | |
| 抗-β-肌动蛋白抗体 | Thermo Fisher | # PA1 - 183 | |
| 抑肽酶 | Santa Cruz Biotechnology | #3595 | |
| Axiovert 200 正置荧光显微镜 | Zeiss | ||
| B27添加剂 | Life Technologies | #17504944 | |
| 杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM） | Life Technologies | #11966025 | |
| EcoRI | Promega | #R6011 | |
| 胎牛血清（FCS） | Life Technologies | #16000044 | |
| 尖头镊子 型号 #5 | Dumont | ||
| 镊子型号 #3 | Dumont | ||
| HEK 293细胞系 | ATCC | #CRL-1573 | |
| IRDye 680 CW 二抗 | LI-COR Biosciences | #92632221 | |
| IRDye 680 二抗 | LI-COR Biosciences | #92632220 | |
| IRDye 800 CW 二抗 | LI-COR Biosciences | #92632210 | |
| IRDye 800 CW 二抗 | LI-COR Biosciences | #92632211 | |
| 慢病毒包膜质粒 pMD2.G | Addgene | #12259 | |
| 慢病毒包装质粒 psPAX2 | Addgene | #12260 | |
| 慢病毒载体 pLKO.3G | Addgene | #14748 | |
| 亮抑蛋白酶肽半硫酸盐 | Santa Cruz Biotechnology | #295358 | |
| Lipofectamine LTX & Plus 试剂（质粒转染试剂） | Life Technologies | #A12621 | |
| MISSION shRNA | Sigma Aldrich | ||
| 单唾液酸神经节苷脂 GM2 | Matreya | #1502 | |
| NanoDrop 2000 核酸蛋白测定仪 | Thermo Scientific | ||
| Neurobasal 培养基 | Life Technologies | #21103049 | |
| 硝酸纤维素膜 0.45 µm | BIO-RAD | #1620115 | |
| Odyssey 近红外成像系统 | LI-COR Bioscience | ||
| OneShot Top 10 感受态细胞 | Life Technology | #C404010 | |
| Opti-MEM（低血清培养基） | Life Technologies | #105802 | |
| PacI | BioLabs | #R0547S | |
| 青霉素-链霉素 | Life Technologies | #15140122 | |
| 胃蛋白酶抑制剂A | Santa Cruz Biotechnology | #45036 | |
| 苯甲基磺酰氟 | Santa Cruz Biotechnology | #329-98-6 | |
| 聚-L-赖氨酸 | sigma aldrich | P#2636 | |
| 直头精细小弹簧剪 | Fine Science Tools | ||
| T4 DNA连接酶 | Promega | #M1801 | |
| 胰蛋白酶-EDTA 0.25 % | Life Technologies | #25200056 | |
| Vibra-Cell 超声波液体处理器（VCX 130） | Sonics | ||
| Wizard plus SV 小量质粒DNA纯化系统 | Promega | #A1330 |
参考文献
- Schroder, M., Kaufman, R. J. The mammalian unfolded protein response. Annual Review of Biochemistry. 74, 739-789 (2005).
- Cui, W., Li, J., Ron, D., Sha, B. The structure of the PERK kinase domain suggests the mechanism for its act....
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重印与许可
