利用靶向Cofilin的腺相关病毒操控小鼠大脑皮层区域的皮层脑电图记录

摘要

本文介绍了一种利用腺相关病毒对大脑皮层中的分子靶点进行操控的实验方案，并通过皮层脑电图记录来监测这种操控在清醒和睡眠状态下的影响。

摘要

在啮齿类动物中使用皮层脑电图（ECoG）记录对睡眠研究以及多种神经系统疾病的研究具有重要意义。腺相关病毒（AAVs）正被 increasingly 用于加深对脑环路及其功能的理解。通过 AAV 介导对特定细胞群和/或精确分子组分的操控，已极大推动了对新型睡眠调控环路/分子以及介导睡眠剥夺不良效应的关键蛋白的鉴定。例如，抑制丝状肌动蛋白切割蛋白的活性 cofilin 使用AAV可防止睡眠剥夺引起的学习记忆障碍。本文介绍了一种实验方案 描述了一种结合操控大脑皮层区域中cofilin功能与记录ECoG活动的方法，以检测皮层cofilin是否调节清醒和睡眠状态下的ECoG信号。在成年雄性和雌性小鼠中，AAV注射与ECoG和肌电图（EMG）电极植入在同一手术过程中进行。小鼠经麻醉后剃除头部毛发，皮肤消毒并切开。随后确定运动皮层的立体定位坐标，并在相应位置钻穿颅骨。将预先装有表达cofilin的AAV的套管^S3D，一种失活形式的cofilin，被缓慢定位至皮层组织。AAV输注后，将镀金螺丝（ECoG电极）旋入颅骨，并通过将镀金导线插入颈部肌肉（EMG电极）后用牙科水泥固定于颅骨。动物恢复三周，以确保cofilin得到充分表达^S3D通过免疫组织化学验证感染区域和细胞类型，并通过警觉状态的视觉识别和频谱分析来分析颅内脑电图（ECoG）。总之，这种联合方法学手段能够研究调控神经元形态和连接性的分子组分对清醒和睡眠期间大脑皮层同步活动调控的精确作用。

引言

脑电图（在啮齿类动物中通常称为皮层脑电图 [ECoG]）和肌电图（EMG）记录被广泛应用于睡眠研究，以及更广泛的神经科学、神经病学和精神病学领域。结合使用这些电生理信号，可在人类和啮齿类动物中识别警觉状态，并进一步量化各状态的持续时间及其频谱组成^1,2,3,4。此类量化方法有助于理解睡眠在神经退行性疾病及其模型^5,6,7或基因修饰^8,9等病理条件下发生的改变。例如，敲除与神经元通讯相关的不同基因被证明可在小鼠和果蝇中改变觉醒和 睡眠的持续时间^10,11,12,13。为了应对在啮齿类动物全身基因敲除研究中可能出现的发育代偿效应，并实现对基因操作更精细的 控制，一种有效调控基因表达的方法是使用腺相关病毒（AAV）。通过AAV介导的基因操作，可下调或上调特定分子靶点，并利用不同类型的启动子将操作限制在特定细胞群体中¹⁴。AAV还被广泛用作规律成簇间隔短回文重复序列（CRISPR）/Cas9技术中的递送手段^15,16。这些方法能够实现对基因操作更精确的时间和空间控制，通常伴随报告基因的表达，从而可通过免疫荧光技术对感染区域进行定量分析。

腺相关病毒（AAV）也是通过光遗传学和化学遗传学实现神经元活动细胞类型特异性操控的主要载体^17,18,19，这些技术已在近年来关于神经退行性疾病、行为、认知和睡眠的研究中被广泛应用^20,21,22。在睡眠研究中，应用光遗传学激活或抑制特定脑区（如基底前脑、下丘脑和背外侧被盖部）已被证明有助于明确这些区域在调控觉醒、慢波睡眠（又称非快速眼动睡眠）、矛盾睡眠（即快速眼动睡眠）以及猝倒中的作用^23,24,25。此外，AAV介导的操控手段有助于阐明参与睡眠剥夺不良效应的重要睡眠调控回路和分子机制^26,27,28。例如，已有研究显示，一种与睡眠剥夺所致记忆损伤相关的蛋白是cofilin^29,30。该蛋白是一种丝状肌动蛋白切割蛋白，可通过直接结合肌动蛋白并以动态方式促进肌动蛋白丝的解聚，参与肌动蛋白丝的重组过程³¹。研究表明，在小鼠中利用AAV介导的方法抑制cofilin活性，可防止睡眠剥夺引起的树突棘丢失以及突触可塑性和记忆功能缺陷 ²⁹。综上所述，这些研究凸显了AAV介导的操控手段在理解啮齿类动物睡眠调控机制及睡眠剥夺后果方面的实用性和重要性。

此处提供了一种实验方案 描述了一种结合使用AAV在野生型（WT）小鼠大脑皮层区域调控cofilin功能，同时进行ECoG和EMG电极植入与记录的技术。更具体而言，使用血清型9的AAV（AAV9）表达小鼠cofilin的磷酸化模拟形式（cofilin^S3D），使其失活^32,33，注射至运动皮层（M1 和 M2）。在注射部位直接植入颅外皮层脑电（ECoG）电极，以确保记录感染细胞的同步皮层活动。术后三周，在无干扰条件下进行持续24小时的ECoG/EMG记录，以确保动物充分恢复、适应，并实现高水平的cofilin表达。^S3D 表达。随后，该记录将用于警觉状态的识别和ECoG谱分析，具体方法如先前研究所述。^11,34该方法可特异性揭示皮层cofilin如何调节小鼠的清醒与睡眠状态下的ECoG信号。结合电生理记录与AAV介导的基因操作，特别适用于研究各类分子成分在特定脑功能中的作用，且可应用于两性野生型及基因修饰小鼠，甚至其他物种中感兴趣的皮层（及皮层下）脑区。

方案

所有方法均经 Recherche CIUSSS-NIM 的 Comité d'éthique de l'expérimentation animale 批准，并符合加拿大动物护理委员会的指南。有关本方案中使用的试剂、设备和材料，请参见材料表。

1. 手术准备

1. 制备ECoG和EMG电极
   1. 为每只动物准备三个ECoG电极：使用电烙铁，在镀金螺钉的螺帽上放置少量无铅焊料，并用该无铅焊料将一段长4 mm、直径0.2 mm的金线（无绝缘层）焊接到螺帽顶部（图1A）。准备两个金线垂直向上的电极，以及一个金线与垂直方向成45°角的电极。
   2. 为每只动物准备两个EMG电极：将一根直径0.2 mm的金线剪成1.5 cm长，另一根剪成2 cm长。将这两根导线弯曲，使其顺应颅骨至颈部肌肉的弧度，但保留一段直线端用于焊接至连接器（图1B）。
   3. 为每只动物准备一个连接器：使用一个6通道连接器（5 mm × 8 mm × 8 mm + 3 mm金属针），在6个金属针中的5个上添加无铅焊料（中间一个针不加；图1C）。用胶带覆盖连接器顶部，以防止碎屑或水分渗入。
2. 制备AAV和注射泵
   1. 通过将储存的AAV原液（此处为含非离子表面活性剂[0.001%]的磷酸盐缓冲盐水溶液中的AAV）用无菌生理盐水稀释，制备待测AAV（此处为AAV₉-CaMKIIα0.4-cofilin^S3D-HA）和/或对照AAV（此处为AAV₉-CaMKIIα0.4-eGFP），以获得所需的病毒滴度（通常为10^12-13基因组拷贝[GC]/mL）以及处理所需数量小鼠的总体积。
      注：每只小鼠每个皮层区域注射1 μL，需准备2 μL体积。
   2. 将一支10 μL注射器固定在注射泵上，并用蒸馏水充满。
   3. 使用1 mL注射器和21 G针头，将一段长约60 cm的PE50管充满蒸馏水。重要的是，注水后保留21 G针头和注射器在原位。将PE50管连接至注射泵；一端保留21 G针头/注射器，另一端连接至10 μL注射器。
   4. 当管路连接至10 μL注射器后，移除另一端的针头，并推动10 μL注射器的活塞，用水填充针头移除后留下的空隙。
      ​注：确保无气泡存在，且管路完全充满水。
   5. 在移除针头的一端安装一根28 G的套管。使用10 μL注射器将水推入套管，使其完全充满。将套管牢固固定在立体定位仪机械臂上。
3. 动物准备
   注：本实验所用约12周龄的C57BL6/J雄性和雌性小鼠，已在单笼饲养条件下适应至少2周，并维持12小时光照：12小时黑暗循环，自由摄食饮水，并提供木质立方体供其活动。
   1. 仔细称量小鼠体重，并通过腹腔注射给予氯胺酮/赛拉嗪混合物（120/10 mg/kg）进行麻醉。等待约10分钟，直至达到深度麻醉状态。
   2. 使用毛发修剪器，将耳朵后部至两眼之间前额区域的毛发剃除。
      注：剃毛时务必小心，避免剪到胡须（可用手指保护胡须），因为胡须修剪会改变感觉输入和ECoG活动^35,36。
   3. 在每只眼睛上涂抹适量眼用软膏，以防角膜脱水。在手术过程中定期通过夹捏后肢脚趾检查麻醉深度。若出现脚趾夹捏反射，则给予0.5–1.5%异氟烷以维持深度麻醉。

2. 使用注射泵进行皮层内 AAV 注射

注意：所有以下步骤均需使用灭菌器械并在洁净环境中进行。手术开始前，使用70%乙醇进一步清洗灭菌器械，以及1.1节中制备的电极和锚定螺钉（非镀金螺钉）。

1. 使用耳杆将小鼠头部小心固定在立体定位仪上。
   注意：确保头部没有横向移动。
2. 轻轻将动物的舌头拉出嘴外，以防窒息，并用立体定位仪适配器固定小鼠的鼻部。
   注意： 在操作过程中需频繁监测呼吸情况。
3. 用70%乙醇对剃毛的头部区域进行消毒，用超细格拉费镊子夹住皮肤，用组织剪从耳基部沿至眼睛水平处剪开皮肤。使用四个外科夹钳将皮肤拉紧（切口每侧各两个），以暴露颅骨（见 图1D).
4. 用锋利的剪刀尖划擦颅骨表面：避开骨缝，去除骨膜，并在两个或多个方向上形成交错的划痕。清除骨碎片，并用70%乙醇干燥颅骨。
   注意：划痕和划线将有助于增强记录装置的稳定性，通过改善水泥与颅骨的粘附性（见下文）。
5. 将套管固定在立体定位仪臂上后，确定前囟的位置（即颅骨冠状缝与矢状缝的交点）； 图1D）以及λ点（即颅骨矢状缝与连接左右人字缝的直线相交处）； 图1D），并记录每个的立体定位坐标。如果两者之间的差异 当bregma和lambda的z坐标（垂直轴）相差大于0.3 mm时，使用立体定位适配器调节鼻部高度，直至bregma与lambda的z坐标位置对齐。
6. 用记号笔在颅骨上标记套管的位置（运动皮层）：中线右侧1.5 mm，前囟前方1.5 mm。使用0.7 mm钻头，在垂直于颅骨表面（与垂直轴对齐）的方向上小心钻穿套管位置的颅骨。用浸有10%聚维碘酮溶液的无菌棉签清洗钻孔后的颅骨。
7. 用10 μL注射器向后拉动活塞1 μL，使导管内吸入1 μL空气泡。加载待测AAV（此处为AAV₉-CaMKIIα0.4-Cofilin^S3D-HA）或对照 AAV（此处为 AAV₉将 AAV（-CaMKIIα0.4-eGFP）注入先前装有气泡的套管中：通过缓慢吹打混匀 AAV， 在无菌培养皿中加入1.7 μL， 用10 μL注射器缓慢拉动活塞，吸取套管内溶液1.5 μL。 在PE50管上标记气泡的位置，以便追踪注射过程。
8. 将套管与颅骨上的孔对齐，使套管垂直下降至颅骨上缘（即颅骨表面）。从颅骨表面开始，缓慢将套管下降1.5 mm（以到达颅骨表面下方1.5 mm处，即运动皮层第V层）。
   注意：务必小心，切勿将套管插入过深，以免造成脑组织不必要的损伤。
9. 启动注射泵，在40分钟内注射1 µL AAV（流速：0.025 µL/min，以尽量减少组织损伤）。通过观察PE50管中气泡的移动来监控注射进程，并根据需要进行调整。
10. 注射完成后，将套管留置5分钟，以确保药物充分扩散并防止回流。随后，缓慢而小心地抬起脑立体定位仪的机械臂，将套管从皮层中取出。

3. 皮层脑电图/肌电图电极植入

1. 使用直型Kelly止血钳，将一个ECoG电极（带直金丝导线）沿垂直方向（与钻孔角度相同）缓慢旋入注射AAV的孔洞中。电极螺钉应至少留出颅骨外2.5 mm，以尽量减少对硬脑膜和大脑皮层的损伤（即电极插入深度约为颅骨表面下1.1 mm）； 图1D).
2. 用笔在颅骨上标记后部ECoG电极和参考电极的位置，坐标如下：后部电极（视觉皮层）位于中线右侧1.5 mm、人字缝前1.5 mm处；参考电极（体感皮层）位于中线右侧2.6 mm、前囟后0.7 mm处。同时，在左侧半球标记三个固定螺钉的位置（作为颅骨与牙科水泥之间的锚定点，以加固头部装置），无特定坐标要求，但应尽可能彼此远离，并远离ECoG电极。
3. 在另一电极和固定螺钉的标记位置，使用0.7 mm钻头小心钻穿颅骨。每个螺钉钻孔方向应垂直于颅骨表面（即后部电极沿垂直轴方向，其他部位则相对于垂直轴呈一定角度）。用10%聚维碘酮溶液清洗钻孔后的颅骨，并在安装螺钉前用卷成小团的精细擦拭纸堵塞孔洞，以防止出血和污染。
4. 使用直型凯利钳，拧紧 左侧半球的维护螺丝，然后拧紧 右半球的最后两个电极。确保以与钻孔相同的角度拧入螺钉，并使每颗螺钉至少保留2.5 mm的长度 颅外图1D).
   注意：为确保最终组装的稳固性及电生理信号的质量，在安装下一个螺丝时，请注意不要触碰任何已安装的螺丝。
5. 在螺丝内部环形空间的中央放置少量牙科水泥。插入一根EMG电极的弯曲端（该电极按步骤1.1.2制备） 使用Dumont #5镊子夹住弯曲端，用超细Graefe镊子提起肌肉上方的皮肤，将电极在颈部肌肉中植入约1-2 mm。然后将电极的弯曲侧和弯角部分置于牙科水泥中；对第二个EMG电极重复上述操作。
   注意：较长的肌电图（EMG）电极的直端应与前部的皮层脑电图（ECoG）电极对齐，较短的EMG电极的直端应与后部的ECoG电极对齐。确保两个EMG电极彼此不接触，且不与任何螺钉接触。
6. 用牙科水泥覆盖小鼠的ECoG电极基部和锚定螺钉基部，形成冠状轮廓。覆盖小鼠的眼睛，照射光线3-5分钟，以促进牙科水泥固化。待肌电图（EMG）电极牢固固定后，再次覆盖小鼠的眼睛，照射光线3-5分钟，以进一步促进水泥固化。
   注意：请勿将水泥涂抹在ECoG和EMG电极末端（将焊接至连接器的金线）或皮肤上。
7. 用预先混合好的丙烯酸骨水泥填充拼接区域的中央。在骨水泥固化过程中，取下固定皮肤的四个外科夹（并立即用精细擦拭纸巾清洗这些夹子）。
   注意：不要将水泥涂抹在ECoG和EMG电极的末端（将焊接至连接器的金线部分）或皮肤上。
8. 使用缝合针（13 mm 3/8 c）和合成可吸收单丝线，缝合组合装置前方和后方的皮肤，确保颅骨不外露（但避免过度牵拉皮肤）。
9. 用弯头镊子将连接器固定在蒙太奇装置上方，仔细将电极的金线与连接器的插针对齐。使用电烙铁将电极末端焊接到连接器插针上。
   注意：操作需迅速，以避免过热而损伤皮层组织。确保每个电极与对应的连接针接触良好，且电极之间无相互接触。
10. 将小鼠从立体定位仪上取下。使用预先混合好的丙烯酸树脂水泥覆盖电极与连接器引脚之间的所有连接处，填满连接器与头部之间留下的空隙。
    注意：操作时应将小鼠的连接器置于头部上方（头部保持竖直，不倾斜），以避免连接器内部渗入水泥。
11. 称重小鼠，并将其放入一个干净的笼子中（最好配备无网格盖子），置于加热垫上（单独饲养以避免头部装置受损）。定期监测动物状态，在动物苏醒时皮下注射0.1 mg/kg的丁丙诺啡，若12小时后动物仍表现出疼痛迹象（如异常姿势、眯眼等），则再次给药。
    ​注意：相对于术前体重的体重增加不应超过1.5 g。

4. 记录

1. 将小鼠单独饲养，以避免因相互理毛导致颅骨固定装置受损，以及记录导线的损坏和缠绕。
   注意：本方案中，小鼠饲养条件包括自由获取食物和水，并提供一个木制方块，且每日进行监测。
2. 术后2周将小鼠连接至记录导线，以适应导线连接环境。
3. 连续记录ECoG/EMG信号24小时（或根据研究问题调整更长或更短时间）。
   注意：ECoG/EMG信号记录使用导线、旋转连接器（允许导线自由旋转）、36通道可穿戴盒、放大器，并连接至计算机完成。信号采样频率为256 Hz（或根据研究问题设定更高频率），并使用商用软件进行记录（见材料表）。为确保足够的病毒表达，实验应在AAV注射后至少3周进行，如先前所述^29,37。
4. 记录结束后，通过颈椎脱位法（或根据免疫染色方案选择其他方法）处死小鼠，并取出脑组织用于免疫染色。

结果

电生理记录完成后，采用免疫荧光染色确定腺相关病毒（AAV）注射所感染的脑区，并验证cofilin^S3D的表达（图2）。免疫染色可采用与先前报道类似的方法进行^29,37,38,39。该AAV表达一种与血凝素（hemagglutinin, HA）标签融合的失活形式cofilin（cofilin^S3D-HA），可通过抗HA抗体及相应的二抗（Alexa Fluor 488）进行免疫荧光检测。被感染的兴奋性神经元（本实验中通过钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶IIα [CamKIIα] 启动子靶向表达AAV所携带的外源基因）可被抗HA抗体标记。成功的感染表现为注射位点周围运动皮层神经元出现明显染色（图2A、B）。在此代表性示例中，对侧半球的大脑皮层未见明显染色。然而，由于兴奋性神经元可投射至远端脑区，对侧半球出现染色并不一定表明注射失败。对感染区域的高倍放大观察显示，细胞体及其突起均被染色，证实仅有靶向皮层区域的特定细胞被感染（图2C）。

还可使用兴奋性神经元标志物（例如囊泡型谷氨酸转运蛋白1、CaMKIIα）进行共染色，以验证细胞类型特异性。或者，如果使用不同的启动子靶向抑制性神经元或星形胶质细胞，则可对这些细胞的标志物进行共染色。在同一动物中，针对注射位点后方仍显示运动皮层抗HA染色的区域，也进行了cofilin^S3D-HA与CaMKIIα的共染色（图2D）。该区域的高倍放大图像显示，细胞明显表达cofilin^S3D-HA（Alexa Fluor 488，图2E）和CaMKIIα（Alexa Fluor 568，图2F）。cofilin^S3D-HA与CaMKIIα染色信号的叠加显示，绝大多数（即使不是全部）cofilin^S3D-HA阳性细胞也呈CaMKIIα阳性（图2G）。该结果支持病毒对兴奋性神经元具有特异性感染。

为了评估cofilin调控对ECoG活动的影响，采用ECoG和EMG信号对警觉状态（清醒、慢波睡眠、矛盾睡眠）进行视觉识别。由于小鼠的警觉状态变化迅速，分析以4秒为一时段进行²，此处为完整的24小时记录。标准分析包括睡眠结构计算和谱分析变量，此前已针对不同数据集进行过此类分析。^{11,12,13,28,34}特别是，对不同状态下的ECoG信号进行谱分析，可反映状态的组成和质量。为消除可能由电极植入深度不同等因素引起的差异，可将谱分析数据表示为相对于同一只动物所有状态总功率的相对值图3A）。鉴于ECoG高频活动的相对幅度极低，为更清晰地可视化并同时比较低频与高频段的活动，清醒状态、慢波睡眠和矛盾睡眠的相对功率谱已进行对数转换。该分析揭示了在cofilin失活条件下，不同状态间谱活动的特异性差异图3B）。更准确地说，这些结合了雄性和雌性小鼠的初步研究结果表明，失活cofilin会显著增加清醒状态下快速频率（14–30 Hz）的频谱功率，以及矛盾睡眠中慢速频率（1–4 Hz）的频谱功率，而对慢波睡眠期间的ECoG活动基本无影响。此外，cofilin失活似乎会增加小鼠间ECoG活动的变异性（尤其在清醒状态的误差线中表现明显） 图3B).

图1：ECoG/EMG 蒙太奇组件的准备及 ECoG 电极放置的代表性示例。（A）ECoG 电极：一根长 4 mm、直径 0.2 mm 的金丝（无绝缘层）通过无铅焊料焊接在镀金螺钉的头部（头部直径 1.9 mm，螺纹大径 1.14 mm，总长度 3.6 mm）。（B）EMG 电极：两根金丝（长度分别为 1.5 cm 和 2 cm）弯曲以贴合颅骨至颈部肌肉的弧度，另一端保持直线状以便焊接到连接器上。（C）6 通道连接器：在连接器（尺寸为 5 mm × 8 mm × 8 mm + 3 mm 金属针脚）的 6 个金属针脚中的 5 个上添加无铅焊料（中间一个不加），连接器顶部用胶带覆盖，以防止碎屑或水渗入。（D）左侧半球颅骨上三个固定螺钉及右侧半球三个 ECoG 电极（包括一个参考电极）的定位示例。ECoG 电极的精确立体定位坐标见步骤 2.6 和 3.2，这些坐标根据前囟（bregma）和后囟（lambda）的位置计算得出（图中以黄点标示）。缩写：ECoG = 皮层脑电图；EMG = 肌电图。请点击此处查看该图的放大版本。

图 2：代表性免疫染色用于界定 AAV 感染区域及细胞类型。（A）示意图显示了 B 图所示冠状切片的注射位点。该位置位于前囟前方 1.1 mm 处，套管（红色显示）靶向右侧初级运动皮层（M1）的第五层。图示经 Franklin 和 Paxinos⁴⁰ 修改。（B）通过 HA 免疫染色检测神经元中 cofilin^S3D-HA 的表达，图像为位于前囟前方约 1.1 mm 处的全脑冠状切片。感染区域主要定位于右侧初级和次级运动皮层（M1 和 M2）的第五层和第六层（颗粒下层）。比例尺 = 500 µm。方框表示 C 图所示区域。（C）感染区域的高倍放大图像，显示感染细胞的染色情况，并证实 cofilin^S3D-HA 在运动皮层深层表达。比例尺 = 100 µm。（D）HA 与 CaMKIIα 的共免疫染色，用于评估细胞类型特异性，图像为位于前囟前方约 0.5 mm 处的右侧半脑冠状切片，因此位于注射位点后方（与 B 和 C 图为同一只小鼠）。感染区域定位于运动皮层（M1 和主要是 M2）。比例尺 = 500 µm。方框表示 E、F 和 G 图所示区域。（E）感染区域的高倍放大图像，显示感染细胞的染色情况，并证实 cofilin^S3D-HA 的表达。比例尺 = 100 µm。（F）感染区域的高倍放大图像，显示 CaMKIIα 阳性细胞的染色情况。比例尺 = 100 µm。（G）感染区域的高倍放大图像，显示 cofilin^S3D-HA 与 CaMKIIα 的共标记，证实感染细胞为 CaMKIIα 阳性细胞。比例尺 = 100 µm。缩写：AAV = 腺相关病毒；M1 = 初级运动皮层；M2 = 次级运动皮层；CPu = 尾状壳核（纹状体）；LV = 侧脑室；HA = 血凝素；CamKIIα = 钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶 II alpha。请点击此处查看该图的放大版本。

图3：通过病毒干预cofilin功能后获得的清醒、慢波睡眠和矛盾睡眠的代表性功率谱。 在运动皮层V层注射AAV₉-CaMKIIα0.4-cofilin^S3D-HA（病毒滴度为2.58 × 10¹³ GC/mL）或对照AAV（AAV₉-CaMKIIα0.4-eGFP，1.25 × 10¹³ GC/mL；采用测试滴度的一半以校正该对照AAV信号增强效应）的雄性（每组n = 5）和雌性（每组n = 2）小鼠进行24小时记录，并对脑皮层电图信号进行谱分析（采用快速傅里叶变换计算0.5至30 Hz频率范围内的谱功率，分辨率为0.25 Hz）。(A) 三种警觉状态期间的功率谱，以所有状态总功率为基准进行归一化表示。(B) 对相对功率谱进行对数转换，以更清晰地展示高频段的组间差异。与对照组注射相比，使用AAV₉-CaMKIIα0.4-cofilin^S3D-HA抑制运动皮层中cofilin活性可显著增加清醒期间β频段（14–30 Hz）以及矛盾睡眠期间δ频段（1–4 Hz）的脑皮层电图活动（x轴上方的红线表示Mann-Whitney U检验在频段功率上的结果，p < 0.05）。缩写：AAV = 腺相关病毒；GC = 基因组拷贝数；HA = 血凝素；CamKIIα = 钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶IIα；eGFP = 增强型绿色荧光蛋白。请点击此处查看此图的放大版本。

讨论

本方案描述了一种精确且简便的方法，用于在利用腺相关病毒（AAV）操控分子靶点的同时监测皮层脑电图（ECoG）和肌电图（EMG）活动。为了实现组间充分比较，强烈建议在同一天对实验组和对照组动物进行手术操作（包括AAV注射和电极植入），并同时记录其电生理信号。为获得实验组与对照组动物之间相似的病毒表达水平，建议注射相同的病毒滴度。在本研究中，对照组AAV的病毒滴度被调整为实验组AAV的一半，以确保病毒表达水平相当。实验人员应非常谨慎地测量立体定位坐标，以确保动物间脑区/皮层靶向的一致性，减少个体差异。此外，由于注射深度是从颅骨表面计算的，而颅骨厚度随年龄和性别变化，因此应始终通过实验后组织学或免疫组织化学分析（例如图2）验证套管针的位置，以确认注射位置和深度的准确性，并在必要时调整立体定位坐标。在整个40分钟的AAV注射过程中，密切监控注射速度至关重要，以便及时发现并纠正可能的问题，如泵堵塞。某些实验步骤对于获得最佳电生理信号也极为关键。例如，在植入电极时切勿过度拧紧螺钉；螺钉应至少突出颅骨2.5 mm，以最大限度减少对大脑皮层的损伤以及胶质瘢痕的形成。随后，还需特别注意：i）避免将牙科水泥涂覆到电极末端；ii）确保电极与连接器之间快速完成焊接；iii）确保各电极之间无任何接触。

本文所述的ECoG和EMG记录方法极为成熟、操作简便，已广泛用于小鼠觉醒与睡眠的监测^2,11,13,34。连续ECoG和EMG记录可进行数天甚至数周，产生极为丰富的数据集，可用于开展多方面的分析，包括与觉醒和睡眠时长及结构相关的变量^2,11,12（例如，光照期和黑暗期内各状态所持续的时间、每种状态发作的次数、睡眠的24小时分布）、觉醒与睡眠的频谱特征^34,41（例如，不同频段的功率[类似于图3]、无标度活动）以及单个脑波的特征^42,43,44（例如，慢波的振幅和斜率）。当该方法与AAV介导的分子干预联合使用时，另一优势在于可避免转基因动物中可能出现的发育代偿效应。经过练习后，整个操作流程（包括40分钟的AAV注射）可在约90分钟内完成。由于手术具有最小侵入性，死亡率应（非常）低。

联合使用ECoG/EMG记录与AAV靶向操控具有多种其他优势和应用。例如，当立体定位注射操作充分执行时，其精确定位能力非常高且可重复，有助于明确特定脑区（和/或该区域内特定细胞类型或分子元件）在睡眠或其他生理过程调控中的具体作用。通过适当调整本方案，可轻松靶向多个不同的皮层区域。此外，使用AAV进行的靶向操控也可作用于与ECoG记录位点不同的皮层或皮层下区域。在此类情况下，AAV注射所用的颅骨钻孔可用牙科水泥（或骨蜡）固定的小型玻璃盖玻片覆盖。为了提高特异性，AAV构建体通常包含一个启动子，以实现对特定细胞类型的靶向感染¹⁴。本方案中采用了CamKIIα启动子，以特异性靶向运动皮层中的兴奋性锥体细胞^14,29,45。该策略已成功实现对运动皮层兴奋性神经元中cofilin的失活（使用cofilin^S3D）^32,33，并观察到ECoG活动的状态特异性变化（图3）。为评估感染/转导效率，后续使用者可将本AAV-ECoG方案与免疫荧光共染色方法结合，利用高倍镜图像计算双标记细胞数占目标细胞单标记总数的比例（本例中为目标CaMKIIα表达神经元）。在最近的一项研究中，采用类似于本文所述的AAV-ECoG方法，通过含有突触素（synapsin）启动子的AAV在运动皮层所有神经元中过表达脆性X智力低下相关蛋白1（FXR1），发现该操作对警觉状态分布及频谱成分具有影响²⁸。这些结果表明，利用AAV在特定脑区操控某一分子，有助于揭示其在调控特定觉醒/睡眠参数中的作用。

本方案的一个局限性在于，进行AAV注射前插入套管时会对脑组织造成微小损伤，这可能伴随炎症反应。当在皮层下区域进行AAV注射时，这一问题尤其值得关注，应始终通过设置适当的对照组来加以控制。或者，可在本方案基础上增加反应性胶质增生和/或小胶质细胞活化的定量分析（例如使用免疫荧光染色），以确保对照组与实验组之间水平相当，从而保证ECoG读数的可比性。第二个局限性在于电极与连接器之间接触不良的风险，可能导致电生理信号持续或间歇性不佳。将电极牢固地旋紧、焊接并用牙科水泥固定，可最大程度减少此类问题的发生。第三个局限性是记录期间动物需通过头部装置与线缆连接，这在一定程度上可能限制其运动及其他行为，并偶尔导致线缆损坏和信号丢失。最后，由于幼龄动物颅骨较小，安装本方案所述的头部装置可能存在困难，因此本方案更适用于成年小鼠，如先前研究所述²。

结合ECoG/EMG记录与AAV介导的精确靶点操控，不仅适用于睡眠神经科学领域的研究，还可应用于其他研究领域。例如，该方法可用于研究和调控癫痫动物模型中的癫痫发作事件，同时也是调节与记忆编码和巩固相关脑节律振荡的有力工具^46,47。因此，其潜在应用范围必然涵盖精神病学和神经病学的基础研究领域，包括神经退行性疾病。除了表达分子的失活形式外，AAV还可用于过表达或下调特定分子（如小干扰RNA、CRISPR/Cas9），或在全身性基因敲除（KO）模型中恢复目标分子的表达。重要的是，本实验方案所采用的双重方法同样适用于其他哺乳动物物种，例如大鼠以及昼行性啮齿类动物，这些物种是研究睡眠与神经退行性病变机制的有价值模型^48,49。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
手术准备
21 G 针头	Terumo	NN-2125R
6通道连接器	ENA AG	BPHF2-O6S-E-3.2	本手稿中使用的连接器，但已停产。请参见下方潜在替代品
	Distrelec	300-93-672	上述已停产连接器的潜在替代品
C57BL6/J 小鼠	Jackson Laboratory	000664 | B6	动物在本地繁育
Pluronic F-68			非离子型表面活性剂
直径 0.2 mm 的金丝	Delta scientific	920-862-41	无绝缘层
Hamilton 注射器（10 μL）	Fisher Scientific	14815279
输注注射泵 CMA 402	Harvard Apparatus	CMA8003110
注射套管 28 G	Plastics one	C313l-SPCL
异氟烷	Baxter	CA2L9100
氯胺酮（10 mg/mL）	SANDOZ	4550
无铅焊料	AIM	SN100C
润滑性眼用软膏	ALLERGAN	210889
PE 50 导管（薄壁）	Plastics one	C232CT
平头自攻螺钉	MORRIS	FF00CE125	ECoG 电极，镀金；尺寸：头部直径 1.9 mm，螺纹大径 1.14 mm，长度 3.6 mm
电烙铁	Weller	WES51
1 mL 注射器	BD	309659
修边器	Harvard Apparatus	72-9063
赛拉嗪（20 mg/mL）	Bayer	2169592
使用注射泵进行皮层内 AAV 注射
0.7 mm 钻头	Dremel	628
AAV9-CaMKIIα0.4-cofilinS3D-HA	UPenn 病毒核心实验室
AAV9-CaMKIIα0.4-eGFP	UPenn 病毒核心实验室
棉签	Medicom	806
钻机	Dremel	8050-N/18
超细 Graefe 镊子	Fine science tools	11150-10
立体定位臂	Stoelting	51604U
立体定位仪框架	Stoelting	51600
手术钳	Fine science tools	18050-28
组织剪刀	Magna Stainless	M4-124
ECoG/EMG 电极植入
丁丙诺啡（0.3 mg/mL）	CEVA	57133-02
弯头镊子	Fine science tools	11001-12
精密擦拭纸	Kimtech	34120
牙科丙烯酸水泥	Yates Motloid	44115
Dumont #5 镊子	Fine science tools	91150-20
超细 Graefe 镊子	Fine science tools	11150-10
Kelly 镊子	Fine science tools	13002-10
液态丙烯酸	Yates Motloid	44119
Monocryl 加缝合针 13 mm 3/8c 反向切割	Ethicon	MCP494
聚维酮碘 10%	Triad disposables	10-8208
RelyX Unicem 2 粘合性树脂水泥 A2	3M	56849
免疫荧光与 ECoG 记录
36通道可穿戴 EEG 头盒	LaMONT Medical	832-000350
CaMKII α 单克隆抗体（Cba-2）	Invitrogen	13-7300	稀释比例 1:500
导体 AWG PVC 绝缘电缆	Calmont Wire & Cables	HC-0819075R0
驴抗小鼠 IgG 二抗，Alexa Fluor 568	Invitrogen	A10037	稀释比例 1:1000
山羊抗兔 IgG 二抗，Alexa Fluor 488	Invitrogen	A-11008	稀释比例 1:500
HA 标签（C29F4）兔单克隆抗体	Cell signaling	3724	稀释比例 1:800
可编程放大器	LaMONT Medical	815-000002-S2
Stellate Harmonie	Natus	HSYS-REC-LT2
旋转连接器	Crist Instrument Company Inc.	4-TBC-9-S