简化早产新生兔经皮气管内药物递送方法

摘要

经皮气管内注射可实现自主呼吸期间有效的肺内药物递送。单次和多次注射均具有良好的耐受性，对存活率无影响。该技术操作简便，可用于研究物质对新生兔肺发育的影响以及预防肺损伤的作用。

摘要

经气管（IT）给药可将药物直接递送至肺部，从而最大化潜在的肺部治疗效果，并最小化全身药物暴露。该经皮技术操作简便，可在早产兔出生后立即实现向其肺部进行经气管给药。新生幼兔在仰卧位、颈部伸展前，先通过吸入异氟烷进行麻醉。确认并固定喉部后，经皮将一根26号（G）导管插入气管。气管插管完成后，将连接于汉密尔顿注射器的30 G钝头针插入经气管导管，用于在自主呼吸过程中向气管内精确递送指定体积的药物。经气管注射完成后，撤出针头和导管，幼兔随后从麻醉中恢复。经皮经气管注射可将大部分注入物质递送至肺部，且干预后3小时时，大部分药物仍保留在肺内。该注射方法自出生当天起耐受性良好，可连续多日重复操作，且不影响存活率。该技术可用于研究药物对早产兔肺发育的影响，以及在预防新生儿肺损伤中的作用。

引言

早产后的慢性新生儿肺部疾病（CNLD）在相当数量的婴儿中仍然持续发生¹。现代新生儿护理的进步已显著提高了存活率，并减少了早产后的大多数严重并发症。尽管神经系统、胃肠道和眼科并发症已有所减少，但在过去20年中，呼吸系统并发症却基本未见改善，近一半在妊娠28周前出生的婴儿会发展为肺部疾病。

早产、炎症、氧化损伤以及呼吸机相关性损伤均在早产儿慢性肺部疾病（CNLD）的病理生理过程及早产后的不良呼吸结局中起重要作用^2,3,4。尽管现代新生儿护理已取得显著进展，但目前仍缺乏有效的治疗方法来干预或预防CNLD的发生^5,6。

为了预防和治疗新生儿慢性肺部疾病（CNLD），需要开发新的方法和干预措施。肺内给药是一种有吸引力的干预手段，可将药物直接递送至肺部，从而可能改变新生儿呼吸系统疾病的病程。肺内药物治疗的优势在于将活性成分直接递送至肺部，从而最大限度减少药物在非靶器官中的蓄积^7,8，并可能降低全身性不良反应。尽管肺内表面活性物质替代治疗已有20多年的历史，但尚未有其他肺内给药疗法被证实可改善新生儿呼吸系统预后。最近有研究报道，布地奈德与表面活性物质联合治疗可改善早产儿出生后接受机械通气的肺部预后^9,10。然而，目前对气管内（IT）药物治疗的功能和结构效应仍了解甚少，新疗法的发现也极为有限，且在新生儿期采用气管内给药的价值仍不明确。因此，需要借助动物模型来识别潜在的有效药物，并推动针对CNLD的亟需疗法的开发。

研究新生儿肺部疾病的动物实验通常采用大鼠和小鼠等小型动物模型^11,12,13。兔模型的额外优势在于可实现早产分娩，从而更接近模拟未成熟人类肺的结构与功能¹⁴。然而，早产兔的局限性在于难以进入气道，从而限制了肺内干预措施的实施。尽管成年兔和啮齿类动物模型可通过经口途径进行气管插管，但由于新生仔兔体型较小且上气道解剖结构特殊，这些技术在新生仔兔中实施困难^15,16。因此，需要采用替代方法以实现对新生仔兔气管的药物递送。

在本文中，我们描述了经皮穿刺针气管造口术的使用，以实现气管插管和药物输送。

方案

所有涉及IT注射的实验均已获得鲁汶大学动物伦理委员会的许可，并严格遵守鲁汶大学关于动物福利与护理的各项指南。

1. 准备

1. 收集完成IT注射所需的所有材料（表1）。
2. 确保麻醉舱的排气口打开并连接至废气清除装置，以防止研究人员接触异氟烷。

2. 仔鼠分娩

注意：兔仔（新西兰白兔-佛兰德巨兔杂交种）在妊娠第28天（足月为31天）通过剖宫产娩出，此时处于肺发育的囊泡期，方法如我们课题组先前所述¹⁷。可将兔仔置于常氧环境中以研究早产后的肺发育，或置于高氧环境中以研究急性肺损伤。

1. 使用2 mL注射器和26 G针头，向母鼠股四头肌注射1 mL氯胺酮（100 mg/mL）和1 mL赛拉嗪（2%）进行镇静。待母鼠深度镇静后，将其仰卧位置于手术台上。通过深而缓慢的呼吸、下颌张力降低以及对耳部夹捏无反应来确认麻醉充分。
2. 使用电动剃须刀剃除腹部中央区域的毛发，并用含碘溶液对术区进行消毒。
3. 通过耳缘静脉注射1 mL T61进行静脉推注，处死母鼠。
4. 立即沿中线切开皮肤、肌鞘和腹壁肌肉，进入腹腔。
5. 延长切口以暴露双角子宫。
6. 使用剪刀立即切开子宫，通过子宫切口取出每只仔鼠。快速娩出仔鼠对于确保其存活至关重要。
7. 娩出后，使用纸巾擦干每只仔鼠，此操作既可干燥其体表，也可刺激其呼吸和活动。
8. 将擦干后的仔鼠放入预热（36 °C）、加湿（相对湿度50%）的培养箱中。
9. 给予1小时恢复时间，使其适应宫外环境。所有存活的仔鼠将被随机分配至预设的处理组。

3. 麻醉

1. 用异氟烷（2.5%，2.5 最低肺泡有效浓度（MAC），2 L/min）充满诱导室
2. 将仔兔放入诱导室，直至达到足够的麻醉深度（自发运动减少、对疼痛刺激的足底反射减弱、呼吸频率降低）。
   ​注意：在妊娠第28天时，仔兔的眼睛尚未睁开（如本实验所示），因此无需使用眼膏以防止角膜干燥。若在后期进行气管内注射，则应对睁开的眼睛涂抹眼膏。

4. 气管内注射的定位

1. 将幼鼠仰卧位固定于操作台上，伸展颈部，并将鼻部插入鼻罩以持续给予麻醉。
2. 使用无弹性的粘性胶带将幼鼠的四肢固定在操作台上。
3. 辨认气管和喉部软骨环，其在气管上段胸廓入口上方表现为皮下正中可见的深色结构。
4. 用酒精溶液（80% 乙醇溶液）对气管区域皮肤进行消毒。
5. 操作者用非优势手使用Allis钳夹住并稳定喉部。

5. 进行气管内注射（ 图1）

1. 用26 G静脉套管（建议使用惯用手）进行气管插管，同时用Allis钳固定气管。
   注意：为确保操作无菌，每只幼鼠应使用新的无菌套管。
2. 在甲状软骨水平，以45°角刺穿皮肤插入套管。
3. 缓慢推进套管及针芯，直至套管进入气管，当针头穿透气管进入气道腔时，会感觉到轻微的"落空感"。
4. 一旦带针芯的套管进入气管腔内，停止推进针芯，保持针芯不动，将塑料套管沿针芯推入气管。切勿将塑料套管推进超过>10 mm，否则可能导致仅选择性地插入左或右主支气管。
5. 从套管中撤出针芯，保留塑料套管鞘在气管内。
6. 使用Hamilton注射器和30 G钝针向套管内注入少量生理盐水（0.9% NaCl，5 µL），以确认套管在气管内的位置。盐水注入后，移除Hamilton注射器及针头。观察塑料套管内的气液界面；若套管内气-液面随自主呼吸而移动，则表明套管已正确置于气道内。
7. 使用30 G钝头针将所需剂量的物质抽入Hamilton注射器中。
8. 将连接Hamilton注射器的30 G钝头针插入气管内的塑料套管中，并在5–10秒内缓慢将物质注入气管。
9. 从塑料套管中移除Hamilton注射器针头，再将塑料套管从气管中取出。

6. 操作后的恢复

1. 将幼崽从固定台上取下，并通过触觉刺激幼崽以促进其呼吸。
2. 将幼崽放回单独的笼子中，该笼子与未麻醉幼崽的笼子分开，置于温暖（36 °C）、湿润（50% 相对湿度）的培养箱内；保持头部抬高30°的体位，直至幼崽从麻醉中充分恢复并能够维持胸卧位。在幼崽完全从麻醉中恢复之前，不得将其单独留下无人看护。

结果

已发表的单次和每日重复经皮IT注射技术的代表性结果表明，IT注射（单次或多次注射）对生存率无影响，且与对照组相比，使用安慰剂（生理盐水）进行IT注射也未改变肺功能或肺结构¹⁸。

此外，我们通过一系列实验验证了该技术，这些实验采用放射性示踪剂（2-脱氧-2-[18F]氟-D-葡萄糖（FDG））及正电子发射断层扫描/计算机断层扫描（PET-CT），在注射后两个时间点（10分钟和150分钟）评估经皮气管内注射生理盐水和表面活性物质的肺部递送情况，以定量分析通过经皮气管内注射方式给予物质的分布与肺部递送效果¹⁸. 本文所述的经皮IT注射输送了大部分（>82%）的总注射示踪剂分布至肺部。此外，在妊娠第28天给药后第1天和第7天给药的两种情况下，给药3小时后大部分示踪剂仍保留在肺内。图2)¹⁸.

讨论

为成功实施气管内注射，应遵循若干关键步骤。若操作得当，经皮气管内注射法可实现早产兔体内有效且可靠的肺内药物递送。温度控制至关重要，因为新生仔兔极易发生低体温，从而对存活产生不利影响。在将仔兔放入诱导舱之前，应确保温度控制，以维持正常体温条件。在诱导舱下方放置加热垫可保证仔兔保持温暖。加热垫应在仔兔放入诱导舱前较早开启，以便舱体缓慢升温。由于诱导舱所用有机玻璃的导热性较低，应避免使用高温加热灯，否则可能在舱内尚未达到所需温度（36 °C）时即导致舱壁熔化。

需要充分的麻醉以固定动物并实现无痛注射。应避免麻醉过深以及通气不足或呼吸暂停。对于经气管注射，合适的麻醉深度为动物已镇静，但仍保持自主呼吸，并对周围刺激（如足部夹捏）有反应。

正确固定蛹的位置可使大多数情况下首次尝试即成功进行气管内注射（图1）。辅助气管内注射的关键步骤包括充分伸展颈部，同时避免任何旋转，识别并稳定喉部（在气道中线处表现为颜色较深、隆起的软骨结构）。颈部旋转会导致导管无法沿与气管相同的冠状轴推进，从而...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
麻醉
加热垫，用于防止麻醉期间动物体温下降			1
配备氧气供应的异氟烷挥发罐			1
异氟烷（Iso-Vet；1000 mg/g）	Dechra Veterinary Products NV，比利时		2% 浓度，2 升/分钟
带排气和废气清除装置的亚克力诱导室	实验室自制		1
注射体位固定
固定支架	实验室自制（由泡沫塑料制成，便于灵活调整位置）		1
连接麻醉回路的鼻罩			1
废气清除系统			1
用于固定四肢的胶带	任意品牌		1 卷
气管内注射
艾利斯组织钳			1
19 mm 长、26 号规格的导管	BD Biosciences	391349	1
Hamilton 注射器（10µl，配备 20 mm 长、钝头、30 号针头）	Hamilton Company	7638-01	1
所选药物活性成分			按实验方案要求
生理盐水（0.9% NaCl）			每只动物 5 µl
动物饲养
温湿度可控的培养箱	Okolab Srl. 定制笼式培养箱。也可使用实验室自制的笼式培养箱