通过质谱法研究蛋白质高级结构的二乙基焦碳酸酯共价标记

摘要

本文描述了基于焦碳酸二乙酯的共价标记实验步骤，并结合质谱检测方法。焦碳酸二乙酯可直接与目标蛋白质或蛋白质复合物混合，从而修饰溶剂可及的氨基酸残基。经过蛋白酶消化及液相色谱-质谱分析后，即可鉴定出被修饰的残基。

摘要

表征蛋白质的高级结构对于理解其功能至关重要。质谱法（MS）已成为实现这一目标的有力工具，尤其适用于难以通过传统方法研究的蛋白质体系。为了利用质谱法研究蛋白质结构，需在溶液中进行特定的化学反应，将蛋白质的结构信息编码至其质量中。其中一种特别有效的方法是使用共价修饰溶剂可及氨基酸侧链的试剂。这些反应会导致质量增加，当结合蛋白酶解和串联质谱分析时，可实现残基水平的定位。本文介绍了将二乙基焦碳酸酯（DEPC）作为共价标记试剂与质谱检测联用的相关实验方案。DEPC 是一种高亲电性分子，能够标记普通蛋白质中多达 30% 的残基，从而提供优异的结构分辨率。DEPC 已成功与质谱联用，获得了从小型单结构域蛋白质（如 β2-微球蛋白）到大型多结构域蛋白质（如单克隆抗体）的结构信息。

引言

蛋白质几乎是所有生理过程中必不可少的生物分子。蛋白质能够执行多种功能，这得益于它们所采用的结构以及与其他生物分子之间的相互作用。为了更深入地理解蛋白质功能，需要借助生物化学和生物物理工具来阐明这些重要的结构特征和相互作用。传统上，X射线晶体学、低温电子显微镜以及核磁共振（NMR）波谱学能够提供所需的原子级细节，以揭示蛋白质结构。然而，许多蛋白质体系由于结晶性能差、蛋白质获取受限、样品异质性过高或分子量限制，无法通过这些技术进行研究。因此，一些新的分析方法应运而生，以克服上述局限性。其中，质谱法是一种新兴的技术，可提供蛋白质结构信息。

质谱法（MS）通过测量分子的质荷比（m/z）来分析物质，因此必须将蛋白质的高级结构信息编码到蛋白质的质量中，才能获得所需的结构信息。目前已开发出多种编码方法，包括氢-氘交换（HDX）^1,2,3,4、化学交联（XL）^5,6和共价标记（CL）^7,8,

方案

1. 蛋白质和试剂的准备

注意：本方案包含使用 DEPC 标记蛋白质的示例工作流程。所列某些条件和试剂浓度可能因所选蛋白质的不同而有所变化。

1. 在1.5 mL微量离心管中配制所有试剂溶液。
2. 制备所需浓度的蛋白质溶液，通常浓度范围为数十 µM，置于 pH 7.4 的 10 mM 3-(N-吗啉代)丙磺酸（MOPS）缓冲液中。或者，若样品中含有可与二乙基焦碳酸酯（DEPC）发生反应的亲核性缓冲液，则将现有蛋白质溶液置换为 10 mM、pH 7.4 的 MOPS 缓冲液。也可使用其他缓冲液（如磷酸盐缓冲生理盐水），只要其不含亲核性功能基团即可。
3. 在干燥的乙腈（ACN）中配制 100 mM DEPC 溶液，用移液器移取 1.45 µL 6.9 M DEPC 储存液的 98.55 µL ACN 的
   注意：并非存在一套适用于所有蛋白质的通用浓度，但可根据组氨酸（His）和赖氨酸（Lys）残基的数量估算出最佳浓度²³例如，使用 50 µL 的 50 µM β2-微球蛋白溶液，将蛋白质与 0.2 µL 100 mM DEPC 的最终浓度为 200 µM （等于蛋白质浓度的4倍），以确保使用此通用示例时达到所需摩尔比（表1）。DEPC标记是一种2^nd....

结果

鉴定DEPC修饰位点及修饰百分比
由于共价标记导致的质量增加可在（a）完整蛋白质和（b）肽段水平上进行测量^8,9。在完整蛋白水平，可通过直接分析或对标记后的蛋白质样品进行液相色谱-质谱（LC-MS）分析，获得带有不同数量标记的蛋白质物种分布。为了获得更高分辨率的结构信息（即位点特异性标记数据），必须在肽段水平上进行测量。在完成标记和淬灭步骤后，标记的蛋白质需进行自下而上的蛋白质组学分析（即二硫键还原、烷基化、蛋白酶解消化以及液相色谱-串联质谱LC-MS/MS）。图3展示了在β-2-微球蛋白（β2m）蛋白上进行DEPC化学交联质谱（DEPC CL-MS）实验时，如何鉴定DEPC标记位点并计算其修饰水平²¹。通过MS/MS对标记肽段进行测序，从而精确定位其DEPC修饰位点，而修饰百分比则通过提取离子色谱图中的相对峰面积计算得出（见图3A

讨论

关键步骤
在实验设计中，有几个方面需要考虑，以确保获得可靠的标记结果。首先，为最大程度实现蛋白质标记，应避免使用含有强亲核基团的缓冲液（例如 Tris），因为这些缓冲液可能与 DEPC 发生反应，从而降低标记程度。此外，这类缓冲液还可能与已标记的残基发生反应，导致标记物脱落，进而造成结构信息的丢失。我们推荐使用 MOPS 作为缓冲液，但磷酸盐缓冲盐水（PBS）也可适用。其次，应避免使用二硫苏糖醇（dithiothreitol）来还原二硫键，因为该试剂中的游离巯基可与已标记的残基反应，移除 DEPC 修饰。正是由于这一化学原理，必须对还原后的二硫键进行烷基化处理，因为游离的半胱氨酸可能导致蛋白质内标记发生混乱³³。第三，使用咪唑进行淬灭的步骤（方案步骤 2.4）对于终止标记反应至关重要，以确保剩余的 DEPC 无法继续与蛋白质发生反应。

同样重要的是要认识到，DEPC标记反应是2^nd 顺序，意味着改变蛋白质或DEPC的浓度都会影响标记程度。我们通过实验发现，当蛋白质浓度在数十微摩尔每升.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1.5 mL 微量离心管	Thermo Fisher Scientific	3448
3-(N-吗啉代)丙磺酸	Millipore Sigma	M1254
3-(N-吗啉代)丙磺酸钠盐	Millipore Sigma	M9381
Acclaim PepMap RSLC C18 色谱柱	Thermo Scientific	164537	300 μm x 15 cm, C18, 2 μm, 100 A
乙腈	Fisher Scientific	A998-1
焦碳酸二乙酯	Millipore Sigma	D5758
高效液相色谱级水	Fisher Scientific	W5-1
咪唑	Millipore Sigma	I5513
固定化胰凝乳蛋白酶	ProteoChem	g4105
固定化胰蛋白酶（TPCK 处理）	Thermo Fisher Scientific	20230
碘乙酰胺	Millipore Sigma	I1149
三(2-羧乙基)膦	Millipore Sigma	C4706