我们描述了由胎儿或成体神经干细胞分化而来的星形胶质细胞与少突胶质前体细胞的混合培养体系,以及体外模拟有害刺激的方法。结合基于细胞的高内涵筛选技术,可构建一个可靠且稳健的药物筛选系统。
方法文章
我们描述了由胎儿或成体神经干细胞分化而来的星形胶质细胞与少突胶质前体细胞的混合培养体系,以及体外模拟有害刺激的方法。结合基于细胞的高内涵筛选技术,可构建一个可靠且稳健的药物筛选系统。
开发用于评估复杂疾病治疗策略有效性的药物筛选技术时,主要障碍在于如何在体外简化模型与重现复杂的体内环境之间取得平衡,同时实现所有筛选策略共同的主要目标,即获得稳健且可靠的数据,以高度预测体内转化效果。
在脱髓鞘疾病领域,大多数药物筛选策略依赖于永生化细胞系或从新生动物中分离的原代少突胶质前体细胞(OPCs)的纯培养,由于缺乏与年龄相关的差异以及真实的病理状态或复杂性,导致结果存在显著偏差。
本文介绍了一种体外系统的建立方法,旨在模拟神经干细胞(NSC)来源的少突胶质前体细胞(OPC)的生理性分化与成熟过程,并可方便地进行操作以模拟脱髓鞘疾病中典型的病理条件。此外,该方法包括从胎脑和成年脑中分离细胞,构建一个包含星形胶质细胞的自发共培养系统,其中OPC可动态分化为成熟的少突胶质细胞(OL)。该模型在生理上类似于甲状腺激素介导的髓鞘形成及髓鞘修复过程,同时允许引入模拟疾病机制的病理干扰因素。我们展示了如何模拟脱髓鞘疾病的两个主要病理组分(即缺氧/缺血和炎症),重现这些因素对发育期髓鞘形成及成年期髓鞘修复的影响,并在全程中综合考虑系统内所有细胞成分的作用,重点关注OPC的分化过程。
这种自发性混合模型结合基于细胞的高内涵筛选技术,能够为针对脱髓鞘病理过程并促进再髓鞘化的治疗策略,开发出一种稳健且可靠的药物筛选系统。
在中枢神经系统(CNS)中,形成髓鞘的细胞(少突胶质细胞,OLs)及其前体细胞(少突胶质前体细胞,OPCs)负责发育期的髓鞘形成过程,该过程发生在围产期和出生后时期,同时也负责成年期的髓鞘更新与修复(再髓鞘化)1。这些细胞具有高度特化性,在解剖结构和功能上与所有其他胶质细胞及神经元成分相互作用,使其成为中枢神经系统结构与功能的基本组成部分。
脱髓鞘事件参与多种中枢神经系统损伤和疾病2,在发育期和成年期主要通过多因素机制作用于少突胶质前体细胞(OPCs)和少突胶质细胞(OLs)。未分化的前体细胞在分化因子(主要是甲状腺激素(TH))的驱动下,经历一个同步化的过程3,使OPC能够识别并响应特定刺激,从而诱导其增殖、迁移至无髓鞘轴突,并进一步分化为成熟的OLs,后者继而形成髓鞘4。所有这些过程均受到精细调控,并发生于复杂的环境中。
由于髓鞘形成、再髓鞘化和脱髓鞘过程具有复杂的特性,迫切需要一种简化且可靠的体外方法来研究其潜在机制,并针对主要的细胞参与者——少突胶质前体细胞(OPC)5,开发新的治疗策略。
为了使体外系统具有可靠性,需要考虑多个因素:细胞环境的复杂性、与年龄相关的细胞内在差异、甲状腺激素介导的生理性分化、病理机制以及数据的稳健性6。事实上,该领域尚未满足的需求是建立一种能够模拟体内条件复杂性的模型,而使用分离的纯少突胶质前体细胞(OPC)培养体系尚未成功实现这一目标。此外,脱髓鞘事件的两个主要因素——炎症和缺氧/缺血(HI)——直接涉及其他细胞成分,这些成分可能间接影响OPC的生理性分化与成熟,而这一方面无法在过于简化的体外模型中进行研究。
从一个具有高度预测性的培养体系出发,接下来更普遍的挑战是获得稳健且可靠的数据。在此背景下,基于细胞的高内涵筛选(HCS)是最合适的技术7,因为我们的目标首先是通过自动化工作流程分析整个培养样本,避免人为选择代表性视野所带来的偏差;其次,实现基于成像的高内涵数据的自动且同步生成8。
鉴于主要需求是在体外简化与模拟体内复杂性之间实现最佳平衡,本文介绍了一种高度可重复的方法,用于获取由胎儿前脑和成年脑室下区(SVZ)分离的神经干细胞(NSCs)所衍生的少突胶质前体细胞(OPCs)。该体外模型以生理性的甲状腺激素(TH)依赖方式,涵盖了从多能性NSC到成熟/髓鞘形成少突胶质细胞(OL)的整个OPC分化过程。所获得的培养体系是一个动态分化/成熟系统,可自发形成共培养环境,主要包含正在分化的OPCs和星形胶质细胞,并含有少量神经元。这种原代培养更接近复杂的体内环境,同时由于其来源于干细胞,便于进行简单操作以实现所需细胞谱系的富集。
与使用细胞系或原代少突胶质前体细胞(OPC)纯培养物的其他药物筛选策略相反,本文所述方法能够在复杂的环境中研究病理干扰因素或治疗分子的作用,同时仍聚焦于目标细胞类型。所描述的高内涵筛选(HCS)工作流程可实现对细胞活力和细胞谱系特化、谱系特异性细胞死亡以及形态学参数的分析。
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本文所述所有动物实验方案均依照欧洲共同体理事会指令(86/609/EEC)实施,并符合已发布的指南要求 实验动物护理和使用指南(NIH).
1. 溶液与试剂
2. 解剖与神经干细胞分离
注意:胎鼠和成年小鼠的神经干细胞(NSCs)分别从 E13.5 胎鼠前脑或 2.5 月龄成年小鼠侧脑室下区(SVZ)分离获得,具体操作参照 Ahlenius 和 Kokaia 方案9并进行了修改。
3. 原代神经球
4. 寡球体
注意:少突胶质细胞分化按照 Chen 方案10 进行,并稍作修改。
5. 包被平板
6. 细胞接种
7. OPC 分化诱导
8. 诱导炎症介导的分化阻滞
9. 诱导氧糖剥夺性细胞死亡
10. 免疫细胞化学
11. 细胞活力、谱系组成及谱系特异性细胞死亡的高内涵筛选分析
注意:高内涵筛选的代表性图像和工作流程见图2A,B。
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培养的第一阶段持续时间可能有所不同,具体取决于接种密度以及球体来源于胎儿还是成体组织。此外,少突球体的群体倍增能力低于神经球(图1B)。而且,来源于成体组织的球体生成速度较慢,通常需要2–3周才能形成少突球体,而来源于胎儿组织的则可能仅需1–2周,具体时间取决于接种密度。
接种后,可使用谱系特异性抗体监测整个培养物的分化过程。由于本实验方案的目的是研究分化的终末阶段,因此未展示0 DIV时的培养物组成。然而,在第一阶段培养中,细胞仍呈巢蛋白(nestin)阳性,代表神经前体细胞,且大多数细胞也呈NG2阳性(少突胶质前体细胞,OPCs)11。在T3介导的分化诱导后3–6天可检测到CNPase阳性细胞,对应于前少突胶质细胞(preOL)阶段;而MBP阳性细胞则在6至12 DIV之间出现(成熟少突胶质细胞,OLs;分化阶段末期的培养物组成见图2C)。
高内涵筛选(HC...
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髓鞘形成/再髓鞘化过程及脱髓鞘事件的复杂性使得建立可预测的体外系统极具挑战性。目前最常用的体外药物筛选系统主要是人类细胞系或原代纯少突胶质细胞(OL)培养,而更复杂的共培养或器官型系统正逐渐得到更多应用15。即使结合高内涵技术,纯少突胶质细胞培养在筛选平台开发中仍是首选方法16。
本文所述的自发性混合培养体系是一种有用的体外系统,能够综合考虑所有主要变量:生理性的T3介导的少突胶质前体细胞分化、对该过程产生干扰的病理因素、其他细胞组分以及与年龄相关的差异。该实验流程包含多个变量,这些变量来源于细胞的来源(动物年龄)以及类球体的形成与操作过程。事实上,一个关键步骤是在组织分离后神经干细胞(NSCs)接种时的细胞密度,因为在理想条件下,单个类球体应由单个增殖细胞产生。我们观察到分离后的NSCs倾向于聚集,并且需要依赖自身分泌的旁分泌因子,因此在t25或t75培养瓶中以10–50个细胞/µL的密度接种,是在避免细胞聚集的同时仍允许细胞通过分泌因子进行相互交流的最佳折中方案。
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作者无任何利益冲突需要披露。
由意大利大学与研究部(MIUR)国家技术集群项目IRMI(CTN01_00177_888744)以及艾米利亚-罗马涅大区Mat2Rep项目(POR-FESR 2014-2020)资助。
特别感谢 IRET 基金会为本实验工作提供的支持。
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 96孔板 - 未处理 | NUNC | 267313 | |
| B27添加剂(100倍浓缩) | GIBCO | 17504-044 | |
| 碱性成纤维细胞生长因子(bFGF) | GIBCO | PHG0024 | |
| 牛血清白蛋白(BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| 睫状神经营养因子(CNTF) | GIBCO | PHC7015 | |
| 无葡萄糖DMEM | GIBCO | A14430-01 | |
| DMEM/F12 GlutaMAX | GIBCO | 31331-028 | |
| DNase | Sigma-Aldrich | D5025-150KU | |
| EBSS | GIBCO | 14155-048 | |
| 表皮生长因子(EGF) | GIBCO | PHG6045 | |
| HBSS | GIBCO | 14170-088 | |
| HEPES | GIBCO | 15630-056 | |
| 透明质酸酶 | Sigma-Aldrich | H3884 | |
| IFN-γ | Origene | TP721239 | |
| IL-17A | Origene | TP723199 | |
| IL-1β | Origene | TP723210 | |
| IL-6 | Origene | TP723240 | |
| 层粘连蛋白 | GIBCO | 23017-051 | |
| N-乙酰-L-半胱氨酸 | Sigma-Aldrich | A9165 | |
| N2添加剂(50倍浓缩) | GIBCO | 17502-048 | |
| 非酶解离缓冲液 | GIBCO | 13150-016 | |
| PBS | GIBCO | 70011-036 | |
| 青霉素/链霉素 | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| 血小板源性生长因子(PDGF-AA) | GIBCO | PHG0035 | |
| 多聚-D,L-鸟氨酸 | Sigma-Aldrich | P4957 | |
| TGF-β1 | Origene | TP720760 | |
| TNF-α | Origene | TP723451 | |
| 三碘甲腺原氨酸 | Sigma-Aldrich | T2752-1G | |
| 胰蛋白酶 | Sigma-Aldrich | T1426 |
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