高内涵筛选分析胎儿与成体神经干细胞来源的少突胶质前体细胞培养物的分化与成熟

摘要

我们描述了由胎儿或成体神经干细胞分化而来的星形胶质细胞与少突胶质前体细胞的混合培养体系，以及体外模拟有害刺激的方法。结合基于细胞的高内涵筛选技术，可构建一个可靠且稳健的药物筛选系统。

摘要

开发用于评估复杂疾病治疗策略有效性的药物筛选技术时，主要障碍在于如何在体外简化模型与重现复杂的体内环境之间取得平衡，同时实现所有筛选策略共同的主要目标，即获得稳健且可靠的数据，以高度预测体内转化效果。

在脱髓鞘疾病领域，大多数药物筛选策略依赖于永生化细胞系或从新生动物中分离的原代少突胶质前体细胞（OPCs）的纯培养，由于缺乏与年龄相关的差异以及真实的病理状态或复杂性，导致结果存在显著偏差。

本文介绍了一种体外系统的建立方法，旨在模拟神经干细胞（NSC）来源的少突胶质前体细胞（OPC）的生理性分化与成熟过程，并可方便地进行操作以模拟脱髓鞘疾病中典型的病理条件。此外，该方法包括从胎脑和成年脑中分离细胞，构建一个包含星形胶质细胞的自发共培养系统，其中OPC可动态分化为成熟的少突胶质细胞（OL）。该模型在生理上类似于甲状腺激素介导的髓鞘形成及髓鞘修复过程，同时允许引入模拟疾病机制的病理干扰因素。我们展示了如何模拟脱髓鞘疾病的两个主要病理组分（即缺氧/缺血和炎症），重现这些因素对发育期髓鞘形成及成年期髓鞘修复的影响，并在全程中综合考虑系统内所有细胞成分的作用，重点关注OPC的分化过程。

这种自发性混合模型结合基于细胞的高内涵筛选技术，能够为针对脱髓鞘病理过程并促进再髓鞘化的治疗策略，开发出一种稳健且可靠的药物筛选系统。

引言

在中枢神经系统（CNS）中，形成髓鞘的细胞（少突胶质细胞，OLs）及其前体细胞（少突胶质前体细胞，OPCs）负责发育期的髓鞘形成过程，该过程发生在围产期和出生后时期，同时也负责成年期的髓鞘更新与修复（再髓鞘化）¹。这些细胞具有高度特化性，在解剖结构和功能上与所有其他胶质细胞及神经元成分相互作用，使其成为中枢神经系统结构与功能的基本组成部分。

脱髓鞘事件参与多种中枢神经系统损伤和疾病²，在发育期和成年期主要通过多因素机制作用于少突胶质前体细胞（OPCs）和少突胶质细胞（OLs）。未分化的前体细胞在分化因子（主要是甲状腺激素（TH））的驱动下，经历一个同步化的过程³，使OPC能够识别并响应特定刺激，从而诱导其增殖、迁移至无髓鞘轴突，并进一步分化为成熟的OLs，后者继而形成髓鞘⁴。所有这些过程均受到精细调控，并发生于复杂的环境中。

由于髓鞘形成、再髓鞘化和脱髓鞘过程具有复杂的特性，迫切需要一种简化且可靠的体外方法来研究其潜在机制，并针对主要的细胞参与者——少突胶质前体细胞（OPC）⁵，开发新的治疗策略。

为了使体外系统具有可靠性，需要考....

方案

本文所述所有动物实验方案均依照欧洲共同体理事会指令（86/609/EEC）实施，并符合已发布的指南要求 实验动物护理和使用指南（NIH）.

1. 溶液与试剂

1. 配制标准培养基：DMEM/F12 GlutaMAX 1x；8 mmol/L HEPES；100 U/100 μg 青霉素/链霉素（1% P/S）；1x B27；1x N-2。
2. 配制神经球培养基：在标准培养基中加入 10 ng/mL bFGF 和 10 ng/mL EGF。
3. 配制少突球/少突前体细胞（OPC）培养基：在标准培养基中加入 10 ng/mL bFGF 和 10 ng/mL PDGF-AA。
4. 配制少突胶质细胞分化培养基：在标准培养基中加入 50 nM T3、10 ng/mL CNTF 和 1x N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）。
5. 配制非酶解离缓冲液：向非酶解离缓冲液中加入 1% P/S，并保持冰上低温。
6. 配制蔗糖溶液：HBSS，含 0.3 g/mL 蔗糖。
7. 配制 BSA 洗涤液：EBSS，含 40 mg/mL BSA 和 0.02 mL/L HEPES。
8. 配制酶解离缓冲液：HBSS，含 5.4 mg/mL D-葡萄糖、15 mmol/L HEPES、1.33 mg/mL 胰蛋白酶、0.7 mg/mL 透明质酸酶和 8....

结果

培养的第一阶段持续时间可能有所不同，具体取决于接种密度以及球体来源于胎儿还是成体组织。此外，少突球体的群体倍增能力低于神经球（图1B）。而且，来源于成体组织的球体生成速度较慢，通常需要2–3周才能形成少突球体，而来源于胎儿组织的则可能仅需1–2周，具体时间取决于接种密度。

接种后，可使用谱系特异性抗体监测整个培养物的分化过程。由于本实验方案的目的是研究分化的终末阶段，因此未展示0 DIV时的培养物组成。然而，在第一阶段培养中，细胞仍呈巢蛋白（nestin）阳性，代表神经前体细胞，且大多数细胞也呈NG2阳性（少突胶质前体细胞，OPCs）¹¹。在T3介导的分化诱导后3–6天可检测到CNPase阳性细胞，对应于前少突胶质细胞（preOL）阶段；而MBP阳性细胞则在6至12 DIV之间出现（成熟少突胶质细胞，OLs；分化阶段末期的培养物组成见图2C）。

高内涵筛选（HC.......

讨论

髓鞘形成/再髓鞘化过程及脱髓鞘事件的复杂性使得建立可预测的体外系统极具挑战性。目前最常用的体外药物筛选系统主要是人类细胞系或原代纯少突胶质细胞（OL）培养，而更复杂的共培养或器官型系统正逐渐得到更多应用¹⁵。即使结合高内涵技术，纯少突胶质细胞培养在筛选平台开发中仍是首选方法¹⁶。

本文所述的自发性混合培养体系是一种有用的体外系统，能够综合考虑所有主要变量：生理性的T3介导的少突胶质前体细胞分化、对该过程产生干扰的病理因素、其他细胞组分以及与年龄相关的差异。该实验流程包含多个变量，这些变量来源于细胞的来源（动物年龄）以及类球体的形成与操作过程。事实上，一个关键步骤是在组织分离后神经干细胞（NSCs）接种时的细胞密度，因为在理想条件下，单个类球体应由单个增殖细胞产生。我们观察到分离后的NSCs倾向于聚集，并且需要依赖自身分泌的旁分泌因子，因此在t25或t75培养瓶中以10–50个细胞/µL的密度接种，是在避免细胞聚集的同时仍允许细胞通过分泌因子进行相互交流的最佳折中方案。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
96孔板 - 未处理	NUNC	267313
B27添加剂（100倍浓缩）	GIBCO	17504-044
碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）	GIBCO	PHG0024
牛血清白蛋白（BSA）	Sigma-Aldrich	A2153
睫状神经营养因子（CNTF）	GIBCO	PHC7015
无葡萄糖DMEM	GIBCO	A14430-01
DMEM/F12 GlutaMAX	GIBCO	31331-028
DNase	Sigma-Aldrich	D5025-150KU
EBSS	GIBCO	14155-048
表皮生长因子（EGF）	GIBCO	PHG6045
HBSS	GIBCO	14170-088
HEPES	GIBCO	15630-056
透明质酸酶	Sigma-Aldrich	H3884
IFN-γ	Origene	TP721239
IL-17A	Origene	TP723199
IL-1β	Origene	TP723210
IL-6	Origene	TP723240
层粘连蛋白	GIBCO	23017-051
N-乙酰-L-半胱氨酸	Sigma-Aldrich	A9165
N2添加剂（50倍浓缩）	GIBCO	17502-048
非酶解离缓冲液	GIBCO	13150-016
PBS	GIBCO	70011-036
青霉素/链霉素	Sigma-Aldrich	P4333
血小板源性生长因子（PDGF-AA）	GIBCO	PHG0035
多聚-D,L-鸟氨酸	Sigma-Aldrich	P4957
TGF-β1	Origene	TP720760
TNF-α	Origene	TP723451
三碘甲腺原氨酸	Sigma-Aldrich	T2752-1G
胰蛋白酶	Sigma-Aldrich	T1426