研究空化增强治疗

摘要

本实验方案可用于在细胞培养装置中实时测量空化活性，旨在探究实现成功药物递送和/或其他生物效应所需的条件。

摘要

人们对超声波治疗应用的兴趣日益浓厚，潜在的临床应用范围从癌症到阿尔茨海默病。空化——即在超声场中气泡的形成及其后续运动——是支撑多种此类治疗的关键现象。然而，关于空化促进治疗效应的具体作用机制仍存在较大不确定性，且亟需开发可在临床实施的可靠监测技术。特别是，不同研究之间在报告产生治疗效应的有效暴露参数及其相应声学发射特征方面存在显著差异。本文旨在提供一套使用广泛可得组件进行空化介导生物效应研究的设计指南和实验方案，并 包含实时声学监测。希望该方案能够推动声学监测更广泛地应用于治疗性超声实验中，并促进不同研究之间暴露条件及其与相关生物效应关联性的更便捷比较。

引言

超声（US）因其安全性高、无创、可在患者床旁便捷实施以及成本效益良好，已被广泛用作诊断成像技术¹。除了其诊断和监测能力外，超声在治疗应用方面也具有巨大潜力。早期研究探索了其在溶栓、DNA转染和药物递送中的应用^2,3,4，目前治疗性超声已成为一个非常活跃的研究领域，应用包括肿瘤治疗^5,6,7、免疫治疗^8,9、血脑屏障（BBB）破坏^10,11,12、溶栓^13,14,15以及细菌感染治疗^16,17。支撑这些应用的一个关键现象是空化效应：由于流体压力变化引起的气体空腔的成核、生长和振荡^18,19。

空化产生生物学效应的机制多种多样。例如，在外加超声场作用下，气泡振荡具有高度非线性特征，可在周围液体中引发微流，从而增强药物对流²⁰，并对气泡附近组织施加剪切应力。当气泡靠近边界时，这种现象尤为显著，会导致气泡非球形振荡，可能通过剪切力诱导的通透性增加促进药物摄取^21,22,23,24。在较高声压下，气泡振幅更大，振荡更剧烈，并发生快速塌陷，产生直接的机械应力²⁵，常伴随激波生成，进而形成较大的压力梯度 ，可破坏组织并提高其通透性^26,27。靠近表面的气泡塌陷还可能形成高速液体微射流^28,29,30。这些微射流可穿透组织，可能形成孔隙或诱发二次应力波^31,32。生物膜在组织和细胞水平上的通透性增加，通常被称为“声促渗透”（sonophoresis），主要用于描述超声诱导的皮肤通透性增强^33,34；或称为“声孔效应”（sonoporation），主要用于描述因细胞膜上形成孔隙而导致的细胞膜可逆性通透^35,36。

振荡气泡周围液体中的黏性吸收可产生显著的加热效应³⁷此外，这种高度非线性的振荡会产生高于驱动超声频率的声辐射 导致周围组织吸收增加并进一步加热³⁸气泡坍缩还可能伴随有化学效应，这是由于气泡核心瞬时产生的高温和高压所致，例如高活性物质的生成以及电磁辐射，后者被称为声致发光。³²这些效应已被研究用于评估递送过程中对相关细胞通路的潜在损伤和/或激活³⁹ 并在一种称为声动力疗法的方法中，用于局部激活光敏药物^40,41,42,43.

许多超声介导的生物效应可能仅通过调控超声场参数（压力振幅、频率、脉冲长度和重复频率以及暴露时间）即可引发，但在生物组织中可靠地产生 空化效应通常需要较高的输入能量，因而带来更高的损伤风险。引入外源性或人工的空化核可显著降低产生上述广泛效应所需的输入能量，并进一步引入仅使用超声无法实现的额外效应。空化核包括气体微泡^26,44、液滴^45,46,47以及固体颗粒^48,49,50，其中纳米尺度的空化核因其在延长循环时间、改善血管外渗及延长空化活性方面的优势，正成为一个新兴的研究领域^49,51,52,53。

最常用的成核剂是气体微泡（MBs），最初被用作诊断成像中的对比剂。它们的直径通常为1-2微米，核心由分子量较高且在周围介质中水溶性较低的气体组成。核心外部包裹着一层保护性的脂质、蛋白质或聚合物外壳，最常见的是由 磷脂⁵⁴当暴露于超声场时，微泡的可压缩性使其发生体积振荡，从而产生 强烈的声学散射，这是微泡作为对比剂成功应用的原因。如前所述，这些振荡还会产生上述机械、热和化学效应，可在治疗应用中加以利用。微泡的包被过程还提供了一种将药物包裹于微泡结构内部，以及将药物和/或靶向分子连接到微泡表面的机制。该技术有助于实现药物的触发释放，从而降低全身毒性⁵⁵最近还发现，微泡表面的物质可能转移到生物结构上，通过所谓的“声学印迹”（sonoprinting）增强药物递送。^56,57,58.

监测超声介导的空化活性可以深入了解其在体外和体内的生物学效应，并有望实现对这些效应的调节与优化。目前应用最广泛的两种空化活性监测方法为：i）光学方法，采用超高速视频显微技术；以及 ii） 在体内通常不可行; 以及 ii) 声学方法，用于记录 振荡和/或溃灭气泡所产生的二次辐射声场。声学信号的幅度和频率成分均包含有关气泡行为的信息。研究表明，在较低的超声入射振幅下，低浓度气泡主要产生谐波发射（驱动频率的整数倍）。⁵⁹随着驱动压力的增加，气泡发射谱中还可能包含称为次谐波和超谐波的分数成分。⁶⁰ 表明更强的非线性行为，以及宽带噪声，这 表明存在惯性空化。整数倍谐波是主要指标 气泡振荡的非线性效应，但也可能由实验系统中任何位置的非线性因素引起，例如非线性传播所致。相比之下，分数谐波和宽带噪声与气泡动力学高度相关。

气泡行为与检测到的声学发射之间的关系可能受到多种因素的复杂影响，包括入射超声场、成核环境以及检测通路的特性⁶⁰。尽管如此，通过识别声学频谱中频率和能量的变化趋势，仍可获得有关气泡行为及其与细胞相互作用的重要信息。这些数据还可提供有价值的信息，用于建立临床治疗监测技术的基础。为了充分挖掘这些信息的潜力，需要开发出可靠、可转化且可重复的实验方法。

目前，在设计系统和开展研究以支持空化辅助治疗技术开发的报道方案中，存在显著差异。在装置方面，已采用多种设计方法。多个研究团队使用了平行板腔室^56,61,62,63，这些腔室或是定制构建，或是商业可得（例如 OptiCell，ThermoFisher Scientific）。Hu 等人 （2013）开发了一种与超声辐照模块和实时共聚焦成像相结合的细胞腔室⁶⁴；Carogo 等人（2015）使用了一个系统，该系统包含一个商用细胞培养皿和一个定制的 PDMS 盖子，以便在超声暴露期间将装置浸入水浴中⁶⁵；Pereno 等人（2018）则使用了一种由多层声流体谐振器构成的装置，可同时对气泡动力学及气泡-细胞相互作用进行光学和声学表征⁶⁶。定制化和特定应用设计的使用，使超声场及其他环境暴露条件的表征变得复杂，导致不同研究之间的比较困难。例如，在实现成功声孔效应的超声参数方面存在显著差异，包括中心频率范围从 0.02 到 15 MHz，占空比从 1% 到连续波，以及负压范围从 0.1 到 20 MPa^{23,64,67,68,69,70}（表 1）。同样，在与特定生物效应相关的频谱成分（如谐波、次谐波等）方面也存在较大差异。

因此，本研究的目的是提供一个易于重复的系统设计与实施框架，用于体外研究空化诱导的细胞生物效应，并特别包含空化监测能力。

方案

1. 系统设计原则

注意：本节介绍用于构建超声暴露与空化监测系统的的设计原理。这些原理以两种现有的声学转染（SAT）系统为例进行说明（见图1）。每个系统均由细胞暴露腔室、超声源以及作为被动空化检测器（PCD）的单阵元换能器组成，所有组件均集成于一个台式测试腔室内。这些设计基于Carugo等（2015）先前描述的系统开发成果⁶⁵。

1. 最大限度地提高使用便捷性。
   1. 通过使用现有的商用细胞培养装置作为接种/生长基质，使细胞暴露室与现有的培养技术和成像系统兼容。
      1. 对于SAT2，使用培养皿（直径35 mm，其中可观察区域直径为21 mm，参见 材料表).
      2. 对于SAT3，使用Transwell小室（6.5 mm直径，参见 材料表). Transwell 小室具有通透性膜，因此需置于细胞培养基中，而非水中。
2. 实现细胞暴露室的快速装载与密封。
   1. 通过将柔性聚合物盖板压合在培养皿上，形成SAT2细胞暴露腔（Carugo et al. 2015）⁶⁵）。如图所示 图1C，盖子上有一对直径为1.2 mm的孔，可通过18 G钝针注射器向腔室内加样。加样完成后，用短塑料棒密封这些加样孔（材料表).
   2. 用注射器或移液器填充SAT3室，并通过压紧密封橡胶塞/塞子进行密封。
   3. 可快速将密封的细胞暴露室装入测试腔室。腔室盖上设有细胞暴露室的固定架，轻压即可确保正确对位。使用图示系统时 图1当预先准备好多个细胞暴露腔室时，更换样品的时间可短至20秒。
   4. 尽量减小腔室内部体积，以提高系统的便携性，并减少所需水或培养基的用量。这样做还可加快在细胞暴露腔室发生空化剂意外溢出或泄漏后的恢复速度。
      注意：SAT2 的内部容积约为 0.8 L。SAT3 的内部容积约为 7.6 L，体积更大，便于装卸声源换能器或调整其构型。设备增设了一个 0.3 L 的内部腔室，以最小化耗材体积，并允许使用除水箱填充水之外的具有生物相关性的液体（如细胞培养基）。内部腔室底部采用厚度为 30 μm 的聚酯薄膜（mylar sheet），以实现最大的声波透射。
   5. 尽可能使用光学透明材料制作腔室及内部组件，以便快速观察并解决可能出现的问题（如泄漏、夹带的大气泡）。
3. 最大限度提高暴露腔室的声学透射率。
   1. 通过选择隔室壁的材料和厚度来最大化透射率。在假设壁两侧液体基本相同（例如水）的前提下，法向入射压力透射系数的幅值⁷¹ 是：
      ，其中 λ 为壁厚中的波长 L, ，以及 z_L 和 z_o 分别为壁面材料和液体的特性阻抗（密度与声速的乘积）。T = 1 表示完全透射。
   2. 对于宽频带空化监测（例如，1-8 MHz），若材料厚度小于1/10波长，大多数实验室用聚合物（例如，PDMS、PTFE、聚苯乙烯）对透射压力的改变不超过10%^th 材料中波长的条件。在高频下（例如8 MHz时的#1.5盖玻片），使用常规材料可能难以满足该条件，因此建议预测或直接校准透射频率响应。
   3. 为了将超声源信号以窄带形式传输至细胞暴露腔室，若层状材料的厚度约为该材料中半波长的整数倍，则可采用较厚的层。例如，SAT2 中的 PDMS 盖板厚度为 2.0 mm（在 1 MHz 下约等于 2 个波长，c_PDMS ~ 1000 m/s
4. 通过选择光源和细胞环境来最大化曝光区域。
   1. 为最大化暴露的细胞数量，在保持与现有培养和成像设备兼容的前提下，应尽可能扩大细胞贴附区域。
   2. 使用一个美国（US）声源，其声场覆盖细胞附着区域，并具有最小的空间变异性，可通过采用大聚焦声源的预聚焦区域（SAT2），或采用主瓣宽度与细胞附着区域直径相匹配的聚焦或透镜式声源（SAT3）。参见 材料表 针对特定来源。
   3. 通过将细胞腔室支架的机械支撑点远离入射场最强区域，以减小细胞腔室支架引入的场复杂性，或通过减小支架的散射截面，或在支架上放置吸波材料。示例如下所示 图1A 和 1D.
5. 确保可重复的暴露条件。
   1. 在固定边界处终止声场，以消除因部分填充腔室中气-液界面可能引起的变异性。在SAT2和SAT3中，通过安装声学吸收器实现（参见 材料表) 在腔室盖上，进一步有利于减少因边界反射可能引起的场复杂性。
   2. 在放大器输出端/源输入端监测并记录驱动电压，以便快速检测到微小的波动或严重的故障。使用可在目标驱动电压范围内安全操作的电压探针或其他设备。定期使用已知的稳定信号源（如波形发生器）检查电压探针的校准状态。
   3. 控制、监测并记录腔室及其内容物的温度。细胞、换能器和传播介质的反应均可能对温度敏感。在SAT2中，通过连接至水温调节系统的两处循环端口实现监测与控制，而SAT3则采用水族加热器（未示出）。根据治疗应用所需的生理条件，将水温设定至相应温度。
      注意：内部温度的变化可能由外部因素引起，也可能由超声换能器及介质自身产生的热量导致。
   4. 仔细对腔体液体进行脱气处理，以尽量减少传播路径中已有气泡导致的意外空化和/或散射。
      注意：如果未进行脱气处理（例如，由于脱气对细胞产生负面影响），则会出现较高的背景气泡活性，需对此采取适当的措施。
6. 校准完全组装好的系统。
   1. 在所有系统组件（包括细胞暴露腔室）就位的情况下，应包含一种用于测量作用于暴露细胞的压力场的方法。在SAT2和SAT3中，通过在腔室盖上设置一个开口实现该功能，以便插入针式或光纤水听器，且不干扰待测声场。测量时应尽可能靠近细胞所在位置进行。
   2. 选择一个具有敏感半径（a_rcv足够小，不会对所测压力场造成测量误差。可接受的尺寸取决于声源频率（f）和半径（a_src）以及源与场扫描之间的距离（z_rcv）。水听器尺寸选择的一般准则为： ，导致： ，其中 c 是声速⁷².
   3. 确保在系统表征所用条件下对水听器进行校准，包括第1.6节中规定的温度。具体而言，若水听器相对于扫描平面保持一定角度，则必须在该角度下进行校准，因为指向性效应可能与仅基于几何形状预期的结果存在显著差异。水听器灵敏度随温度变化的数据应由制造商提供。
   4. 扫描细胞可能暴露的整个区域。为获取适当的视野细节水平，扫描间距不得超过1/5^th 在所关注的最高频率处，波长应适当。若观察到意外的场复杂性，可考虑使用短脉冲信号（例如1-3个周期），以区分并量化直达场和散射场的贡献。
7. 整合空化监测功能。
   1. 在整体系统设计阶段即确定监测换能器的类型和放置位置，而非在后期进行改装。在实践中，这能够实现系统最大程度的紧凑性，同时不牺牲关键系统组件可靠对准的能力。
   2. 在系统中放置一个空化监测装置，使其能够以可重复的方式定位，同时尽量减少额外的设置时间或对工作流程的干扰。在SAT2中，通过将单元素压电换能器作为被动空化检测（PCD）装置安装在腔室盖上实现；而在SAT3中，则使用90°反射器将PCD集成到声源基座中。
   3. 根据实验目的选择相应的PCD形状。在 图2，非聚焦（左）和聚焦（右）器件的半幅度等高线计算结果显示出其在频率响应上的空间敏感性存在显著差异。非聚焦器件适用于大范围体积监测，且在频率变化下具有较为适中的空间变异；而聚焦器件则更适合在目标频率范围内进行径向更为集中的测量。
   4. 选择PCD中心频率和带宽以满足实验需求。通常选择中心频率至少为超声源频率的五倍，以最大程度降低对直接源发射信号的敏感性。带宽通常应尽可能最大化，以便观察到更广泛的气泡行为（包括谐波和宽带噪声）。
   5. 选择下一节所述的刺激、记录和处理方法，以实现对空化数据的分析。

2. 空化监测的仪器与处理

注意：本节介绍用于收集空化监测数据的信号流组件和功能，以及实现空化活动定性与定量评估的数据处理方法。

1. 仪器设备（另见图3）。
   1. 除非应用需要定制设备，否则应从市面上广泛可得的单元素换能器中选择一个声致发光检测器（PCD），这类换能器通常用于水下目标的无损检测。这些供应商还提供配套的电缆和附件（例如SAT3中的镜面反射器）。
   2. 尽量降低PCD对超声（US）源的响应。这可以通过选择合适的PCD（中心频率和带宽）以及使用陷波滤波器或高通滤波器来实现。后者可以作为独立模块使用，也可以作为信号调理设备的一部分。
   3. 使用具有大动态范围（至少12位）的数字化仪，以尽可能多地捕获数据，最大限度减少强信号削波的可能性，并提高最弱信号的信噪比（SNR）。在比较不同设备时，应查阅其信噪比与失真指标和/或有效位数，因为这些参数能更全面地描述可实现的动态范围。同时考虑存储缓冲区的大小是否足以满足所需的数据采集长度和速率。
   4. 优化数字化仪动态范围的使用。由于PCD信号可能跨越多个数量级——既因为长时间暴露（气泡逐渐被消除），也因为在不同超声驱动水平下进行实验——因此必须确保信号调理链路能够对所有信号进行适当缩放，以便正确记录。
   5. 在信号链中加入前置放大器，以充分捕获预期的最小信号。根据我们的经验，PCD自身的噪声远低于大多数数字化仪的噪声水平，因此适度的前置放大（例如<100倍）仍可改善最终结果的信噪比。
   6. 在前置放大之前滤除超声源频率，以避免放大器饱和。
   7. 如果使用超声脉冲发生器/接收器来提供增益和/或滤波功能，则应将其设置为脉冲模式，以确认声路长度/对准情况，或检查PCD与细胞暴露腔室之间传播路径中是否存在意外散射体。
   8. 启用数据实时流式存储功能。SAT2和SAT3系统均采用12位流式USB示波器（见材料表），具有便携性和良好用户界面的优点。
   9. 确认信号链中的阻抗匹配正确，以避免增益或带宽误差。PCD设备的输出阻抗通常接近50欧姆，因此合适的验证方法是用具有50欧姆输出阻抗的波形发生器提供已知信号替代PCD，并确认数字化仪上显示的信号幅度符合预期，在输入信号变化时呈线性缩放，且关注的最大信号未出现削波现象。
2. 预处理
   1. 针对信号路径中所有已知的增益和灵敏度，校正原始电压信号，这些参数与感兴趣频率范围内数据的处理相关。
   2. 如果数据是以直流输入耦合方式记录，或表现出直流偏移，则通过直接减去偏移量或使用高通滤波器去除该偏移。
3. 计算每个记录信号的功率谱 P。
   1. 设置傅里叶变换长度 N_ft，使得超声源的基频 f₀ 是变换频率分辨率的整数倍：N_ft = nf_s/f₀，其中 n 为整数，f_s 为数字化数据的采样频率。为清晰捕捉谱特征，建议设置 n ≥ 50。例如，对于以50 MHz采样的1 MHz基频信号，N_ft 为2500，频率分辨率为0.02 MHz。
   2. 由于变换长度 N_ft 通常小于记录信号的持续时间，应使用功率谱密度（PSD）估计方法，如Welch法⁷³。频率范围 f₁-f₂ 内的功率为 ，其中 dF 为变换频率分辨率。
   3. 为表征每次暴露期间的气泡活动，估算功率谱中 f₀ 的整数倍频率（谐波）、f₀/2 的奇数倍频率（超谐波）以及宽带噪声（惯性空化）的贡献。
   4. 最简单的方法是直接选取特定频率处的功率谱值来估算谐波和超谐波含量。然而，大振幅的纯音响应可能会扩散到相邻的少数几个频率区间（例如 f0 ± 2-3），因此这些区间应包含在窄带功率计算中，并从宽带计算中排除。
   5. 通过从总功率谱中减去谐波和超谐波的贡献，估算宽带空化功率。或者，也可采用更复杂的预处理方法来估计这些成分⁷⁴。
   6. 优选根据谱特征或气泡活动类型，估算暴露持续期间累积的空化信号能量。
   7. 假设所有数据记录的持续时间相等，记为 T_r，则记录数据中的累积能量为 ，其中 M 表示记录数量。
   8. 如果记录之间存在间隙（例如在连续暴露但仅保存部分总暴露时间 T_e 的情况下），累积能量可估算为
   9. 通过将谱水平与无超声时记录的背景噪声水平进行比较，估算测量信噪比（SNR）。

3. 实验方案

1. SAT 准备
   1. 通过在 -10⁵ Pa 的负压下对填充液（通常为过滤水）脱气至少两小时，以最大程度降低传播路径中发生空化的可能性。建议使用溶解氧探头确认氧气的分压低于 10 kPa。
   2. 缓慢填充测试腔室，以尽量减少空气重新进入脱气液体。如有必要，在填充后继续对腔室进行脱气。
   3. 填充后立即清除换能器和介质容器表面的所有残留气泡，并在开始暴露实验前再次检查并清除。
   4. 确保腔室及其内容物的温度在开始暴露实验前已稳定。
   5. 让超声源功率放大器按照制造商建议预热，以确保增益和输出随时间保持稳定。
2. 暴露腔室准备
   1. 空化剂悬浮液
      1. 稀释空化剂时，应轻柔且持续搅拌，以形成均匀的悬浮液，避免夹带宏观气泡或破坏空化剂（特别是带壳微泡）。
      2. 操作微泡（MBs）时，应使用尽可能大规格的针头缓慢抽取和注入，以尽量减少加载过程中的破坏⁷⁵。SAT 系统常规使用 18 G 的钝头填充针。
3. SAT2 准备
   1. 在使用活细胞进行实验前，对 PDMS 盖板进行灭菌处理。
   2. 通过将 PDMS 盖板压合至培养皿上，形成细胞暴露腔室。
   3. 准备一支带有 18 G 钝头针的注射器，并吸入约 10 mL 液体（例如微泡悬浮液或水对照）。
   4. 将针头插入 PDMS 填充孔之一，并缓慢填充腔室，同时倾斜装置，使宏观气泡可通过开放的填充孔逸出。为获得最佳效果，应倾斜腔室，使开放孔位于填充孔上方。
   5. 填充完成后，插入一段短（4–5 mm）聚合物棒封闭开放孔。将组件放置成两个孔均处于水平方向。
   6. 在继续注入额外液体的同时拔出钝头填充针，以防止吸入空气。再用另一段聚合物棒封闭该孔。此过程完成细胞暴露腔室的密封。
   7. 目视检查腔室是否存在夹带的宏观气泡；若发现气泡，则重复步骤 3.3.3–3.3.6。
   8. 将细胞暴露腔室压合至腔室支架中。将腔室盖板安装到位并盖在腔室上方。以一定角度将盖板缓慢放下，可防止宏观气泡停留在浸没部件（吸收体、支架）表面。
   9. 决定细胞暴露腔室的朝向时，应考虑悬浮颗粒的浮力（例如上浮的气泡或下沉的纳米颗粒），以及其对细胞接触的影响。
   10. 所有操作中应尽量减少施加的力，以避免细胞生长表面弯曲或细胞脱落。
4. SAT3 准备
   1. 向 Transwell 中加入约 150 μL 液体（例如微泡悬浮液或水对照）。
   2. 小心地用橡胶塞密封 Transwell，形成细胞暴露腔室，并用干净的纸巾或擦拭布去除溢出的液体。在用于活细胞实验前，应对橡胶塞进行灭菌处理。
   3. 目视检查腔室是否存在夹带的宏观气泡；若发现气泡，应取下塞子，清除宏观气泡，并重复步骤 4.4.2。
   4. 将细胞暴露腔室压合至腔室支架中。将腔室盖板安装到位并盖在腔室上方。以一定角度将盖板缓慢放下，可防止宏观气泡停留在浸没部件（吸收体、支架）表面。
      注：如上所述，宏观气泡可能在超声暴露实验中引起多种不可重复且潜在有害的影响。最重要的是，细胞暴露腔室中夹带的宏观气泡可能引发 PCD 反应及局部细胞生物效应，这些效应并不能代表预期的治疗效果。在启动超声实验前，务必目视检查所有系统组件，发现并清除所有宏观气泡。

4. 数据采集

1. 通过使用装有对照液体（例如脱气水或细胞培养基）的细胞暴露腔室进行初步实验，建立背景性程序性细胞死亡（PCD）反应水平。
2. 在不启动超声（US）源的情况下记录PCD数据，以确定背景电子噪声水平。
3. 在以计划范围内所有驱动水平驱动超声源的同时记录PCD数据。该数据将指示声学响应中与后续待测空化剂无关的部分。
   注意：常见的实验室液体（例如PBS或细胞培养基）若未脱气，在中等压力下（例如0.5 MHz时0.5 MPa）也会发生空化现象。
4. 开始测量前，应给予足够时间使悬液与腔室温度达到热平衡。可使用细针式热电偶完成此操作。
5. 在时间和频率域中实时监测实验过程。
   1. PCD的时间域监测可揭示信号幅度是否与当前仪器设置相匹配。应避免信号削波，因其会在频率域中表现为多频谐波响应。
   2. PCD的时间域监测还可显示是否在基于超声源至暴露腔室再到PCD传播时间预期之前观察到空化信号。若出现此类信号，可能提示空化剂泄漏进入测试腔室。
   3. PCD的频率域监测可指示气泡行为类型，并可用于根据需要调整驱动水平，以实现所需的细胞刺激（例如，谐波激发时采用较低驱动水平）。
6. 为确保不遗漏最初的暴露事件，在开启超声源驱动信号之前即应启动数据采集过程。
7. 在整个实验过程中监测驱动超声源的放大器输出信号（而非波形发生器输出），以确保暴露过程按预期进行。应使用高压探头进行该测量，并确保示波器已设置为补偿探头衰减。
8. 样品暴露后，小心将其从测试腔室中取出。
   1. 取出并清洁PDMS盖板（SAT2）/橡胶塞（SAT3），以便后续使用。
   2. 根据需要转移培养皿（SAT2）/Transwell插件（SAT3）以进行后续分析（例如显微镜检查、荧光成像）。
   3. 在少量暴露实验后（例如3–5次），建议重新采集无空化剂条件下的基线空化信号，并与原始数据集进行比较，以确认腔室介质未受污染。

结果

图4展示了时间域和频率域PCD响应的示例，说明了三种不同的空化行为。所有数据均在SAT3上采集，使用SonoVue微泡以PBS稀释5倍，终浓度约为~2×10⁷ 个微泡/mL。本节所有示例的温度为19 ± 1 °C。超声源以0.5 MHz、2.0 ms脉冲驱动，以实现0.20（图4A和4B）、0.30（图4C和4D）和0.70 MPa（图4E和4F）的入射负压峰值。信号记录从超声脉冲t = 0时刻开始前1.4 ms启动。插图显示了记录的原始信号（红色）以及经过2 MHz高通滤波后的信号（蓝色），时间窗口中心位于超声源到细胞暴露腔室再到PCD的飞行时间点。在此时间之前的低水平响应是由于PCD直接接收到来自超声源的辐射所致，这在PCD位于超声源后方的配置中较为常见。

在最低入射压力下，PCD响应完全由0.5 MHz基波超声频率的整数谐波组成。当压力从0.20 MPa增加到0.30 MPa时，频谱中除进一步增强的整数谐波外，还出现明显的超谐波。这两个压力下的时域波形相似，尽管0.30 MPa条件下的结果在脉冲持续时间内表现出更大的变异性。在最高压力下，由于频谱中明显增强的宽带噪声，时域波形的幅度相对于较低压力呈非线性增长。这种噪声通常被认为是惯性空化所致，在本例中对应微泡（MBs）的破坏。

为了更清楚地说明这一点，图5展示了随时间变化的PCD响应。在左侧面板（图5A）中，显示了在50秒曝光时间内获得的完整光谱，期间光源每0.20秒发射一次持续2.0毫秒的脉冲。相应的总功率、谐波功率和宽带功率如右侧面板（图5B）所示。超声（US）在t = 3.0 s时开启，此时观察到大幅值的宽带响应。初始尖峰被认为对应于悬浮液中最大气泡的破裂（SonoVue具有多分散性），这在包壳气泡的空化实验中是一种常见现象，甚至在未脱气介质（例如PBS）中也是如此。

数秒后，宽带响应迅速减弱，显然是由于气泡破裂所致，此时信号主要由谐波成分构成。这表明释放出的气体和残留的微泡正在稳定地非惯性振动。在 t~50 s 时，宽带成分已下降至原始背景噪声的水平。因此，在研究不同气泡效应作用于腔室内细胞的时间尺度时，此类暴露实验具有重要意义。

气泡在超声暴露期间可能因辐射力作用而发生移动，微泡进出PCD视野范围会导致监测到的空化信号变异性增加，尤其是在处理稀释悬液时。因此，PCD的敏感区域应尽可能覆盖更多的细胞暴露表面。对具有相同中心频率的聚焦与非聚焦PCD响应的比较（参见 图2) 如图所示 图6，使用正常PBS对MBs进行20:1稀释后为SAT2。图中面板显示了时间和样品平均光谱 图6A 表明未聚焦的 PCD 具有更强的宽带响应，同时在谐波（图6B）以及超谐波功率（图6C).

需要注意的是，用于体外细胞实验的培养基通常未经脱气处理，可能会表现出增强的背景气泡活性。图7展示了供应商提供的磷酸盐缓冲液（PBS）在使用前及其经真空脱气两小时后的SAT2响应，脱气后通过光学传感器（PreSens，德国）测定其空气饱和度从92%降至46%。图7A中的光谱数据为五份独立样品在曝光时间和重复次数上的平均值，清楚地显示常规PBS中存在明显升高的超谐波信号。在三个谐波范围内累加的功率值（图7B）均处于各实验结果的标准偏差范围内。相比之下，图7C中的超谐波总和表明，常规PBS的信号水平高出近一个数量级，且样品间的变异性显著增加。这些实例表明，一种常见的细胞兼容性介质可能表现出类似微泡（MBs）存在的特征行为，从而导致误判。由于脱气处理通常会对细胞和/或空化剂的稳定性产生不利影响，因此在任何与空化相关的研究中，进行适当的对照实验至关重要。

图1：两种包含空化监测功能的超声暴露系统设计示意图：SAT3（D-F）。（A）SAT2标注组件图，移除侧壁以增强可视性。（B）完整侧壁的SAT2。（C）SAT2细胞暴露腔室，已拆解。（D）SAT3标注组件图。（E）SAT3在正常（左）和带透镜（右）配置下的示意图，用于在不同频率下匹配声束宽度。（F）SAT3细胞暴露腔室，已拆解。请点击此处查看此图的放大版本。

图2：直径为12.7 mm的非聚焦（左）和球面聚焦（右）换能器的半幅压力场等高线计算结果。在坐标原点（0,0）处的PCD元件上，2 MHz、4 MHz和8 MHz的频率分别以红色、蓝色和绿色等高线表示。非聚焦器件的最外层等高线对频率相对不敏感，但内部结构具有频率依赖性。随着频率升高，球面聚焦场的范围收缩，但在等高线内部，声场变化平滑。请点击此处查看此图的放大版本。

图3：空化信号调理与记录（蓝色箭头）、超声源激励（红线）及数据采集触发的仪器装置。 请点击此处查看该图的放大版本。

图 4：使用 PBS 稀释 5 倍的微泡（MBs）记录的时域（左）和频域（右）PCD 响应。入射峰值负压分别为 (A, B) 0.2 MPa、(C, D) 0.4 MPa、(E, F) 0.7 MPa，所有实验均在 0.5 MHz 下进行。信号记录从持续时间为 2.0 ms 的超声脉冲起始时间 t=0 之前 1.4 ms 开始。(A, C, E) 时域信号（红色）采用固定的垂直刻度显示，表明响应水平随入射压力的变化情况。插图轨迹显示了记录的信号（红色）以及在从声源到细胞暴露腔室再到 PCD 的飞行时间中心时间窗内应用 2 MHz 高通滤波器后的信号（蓝色）。(B, D, F) 分别计算 t<0 和 t>0 时的噪声和信号功率谱密度。请点击此处查看该图的放大版本。

图5：MBs 悬液在 PBS 中稀释5倍后，50秒暴露期间的频谱变化。（A）随时间变化的完整频谱，以及（B）总信号功率、谐波信号功率和宽带信号功率。驱动条件为：0.5 MHz，峰值负压0.7 MPa，脉冲持续时间2.0 ms，脉冲重复周期200 ms。请点击此处查看该图的放大版本。

图6：在正常PBS中以1:20稀释微泡条件下记录的PCD聚焦几何效应。驱动条件为：1.0 MHz，0.50 MPa峰值负压，3.0 ms脉冲持续时间，10 ms脉冲重复周期。（A）在暴露时间内及三次独立样本重复实验中取平均的全谱图。（B）3、4和5 MHz谐波的功率，以及（C）2.5、3.5和4.5 MHz超谐波的功率。粗线表示样本均值，阴影区域表示±1个标准差。 请点击此处查看此图的放大版本。

图 7：使用 PBS 记录的脱气培养基的影响。（A）在暴露时间和五个独立样本重复中取平均的全谱。（B）3、4 和 5 MHz 谐波的功率，以及（C）2.5、3.5 和 4.5 MHz 次谐波的功率。粗线表示样本均值，阴影区域表示 ±1 个标准差。驱动条件为 1.0 MHz、0.50 MPa 峰值负压、1.0 ms 脉冲持续时间、200 ms 脉冲重复周期。请点击此处查看此图的放大版本。

参数	单位	最小值	最大值
频率	MHz	0.02	15
压力（峰值负压）	MPa	0.1	20
脉冲长度	周期	1	CW
占空比	%	1	CW
暴露时间	s	10	1000

表1：促进声孔效应的已报道参数范围汇总 体外.

讨论

1981年，Apfel将任何声学测量中的关键步骤概括为：“了解你的液体，了解你的声场，了解何时发生事件”⁷⁶。在本实验方案的背景下，这些原则涵盖了换能器的校准与对准，以及水的制备和气泡处理步骤。首先，用于校准驱动换能器和/或被动空化检测（PCD）系统的水听器本身必须通过定期的外部校准或与参考标准进行内部比对，实现精确校准。同样，驱动换能器和PCD系统的响应也需要定期表征，以检测输出是否发生变化和/或灵敏度是否下降。如果系统的驱动条件和接收灵敏度未知，则无法推断出暴露条件、生物效应与声学发射之间的任何有意义的关系。与此直接相关的是，必须仔细检查换能器之间的相对位置以及与样品腔的对准情况，以确保腔内暴露条件符合预期，并且PCD的采样体积对应于目标区域。如前所述，悬浮介质的温度和气体含量会显著影响最终结果，因此在这一方面保持一致性极为重要^77,78。同样，空化剂悬液的制备、表征和操作也需要高度关注，以确保样品中存在预期的粒径分布和颗粒浓度。例如，若气泡浓度过高，将导致样品体积受到有效屏蔽，从而减弱入射超声场的作用。微泡（MB）试剂尤其容易发生破坏和融合，有关其操作的进一步指导可参见Mulvana等（2012）的研究⁷⁹。

检测空化信号时一个非常常见的问题是难以获得足够的信噪比（SNR）。这在一定程度上是由于信号本身的特性所致，如前所述，但也可能源于实验装置内部的电噪声源。检查系统各组件之间的连接，特别是涉及同轴电缆的连接，可能有助于消除部分噪声。必要时应更换或修理同轴电缆。识别并移除或关闭实验室中可能产生电噪声的其他设备（如泵）也有助于改善情况。系统组件之间不良的电学阻抗匹配可能是信噪比差的另一个原因，甚至可能对设备造成损害，因此应仔细检查。同样，应检查信号发生器和示波器的触发设置，以确认其已针对实验正确配置，而非仍处于制造商的默认设置。如果在操作过程中出现气泡严重破坏的情况（例如在SAT2中），可在出口端口连接第二个注射器，并用其轻轻抽出腔室中的液体，从而吸入悬浮液。如果需要，这种方法还可帮助消除大尺寸气泡或在超声暴露期间实现液体流动。

无法完全消除样品室内的声学反射，因此入射声场在整个区域内不会完全均匀 样品体积。如步骤1.3.2和1.3.3所述，声窗的透射性具有频率依赖性，因此在进行声发射测量时应仔细考虑所需的带宽。特别是高频成分可能会产生显著的多次反射。这也是为何在完整组装系统内对声场进行校准对于降低入射声压的不确定性至关重要。还应适当考虑对记录信号进行门控处理，以尽量减少多次反射的影响。出于使用便捷性和声学透明性的需求，常采用商用装置，但这意味着需牺牲部分光学透明性，可能影响后续成像质量，例如细胞活力或药物摄取的评估。部分商用装置所用膜材料具有多孔性，导致样品腔室与周围水浴之间无法完全隔离。同前述情况类似，可通过使用一个可定期更换内容物的较小次级腔室来降低相应的污染风险。文中提及的细胞培养装置 材料表 主要适用于细胞单层，而此类单层在超声/空化介导的生物效应方面可能无法代表真实组织。细胞与固体表面的接近程度也会影响微泡动力学行为，其影响方式可能无法反映体内实际情况，例如如引言所述，会促进微流和微射流的产生。然而，通过简单替换为其他组织模型，可克服这些局限性。

提出声学暴露装置（SATs）的目的是提供一种改进超声介导生物效应研究中声学暴露条件和声学发射可重复性的方法，从而有望促进对潜在机制的深入理解，并推动治疗监测技术的发展，以提高安全性和有效性。该系统设计为可与市售的细胞培养设备兼容，能够根据特定应用开展多种生物学检测，并支持高通量实验，避免了每次实验之间耗时的对准操作。通过标准化暴露条件表征和声学发射采集的实验方案，有望降低因系统差异带来的变异性。对于特定实验需要探索的参数范围，将取决于具体应用（期望的生物效应、细胞类型、体内实验中靶组织的深度等）以及所用空化剂的性质。由于变量众多（超声频率、压力幅值、脉冲长度、脉冲重复频率等），全面探索整个参数空间通常不具可行性。本方案的一个优势在于能够快速确定该参数空间的某些边界条件。例如，可确定产生空化信号所需的最低压力、在发生细胞脱落或死亡之前可使用的最大压力或脉冲长度，以及产生分数谐波或宽带噪声的压力阈值。建议在任何研究的初始阶段，首先开展此类初步范围测定实验。

如上所述，SAT 装置旨在用于实时监测声发射，而生物学检测则在实验之外进行。然而，对 SAT 稍作改造即可通过显微物镜直接光学观察样品腔。该改造可进一步与荧光和/或高速显微成像系统耦合，从而实现对药物摄取和气泡动力学等过程的观察。目前以电压形式呈现的 PCD 输出信号表明：i）空化行为的类型及其相对比例；ii）这些空化行为持续的时间；iii）观察到的时间累积暴露特性是否与特定生物效应相关；iv）相对强度及时间依赖性行为是否与该暴露系统先前实验的结果一致。尽管可以量化 PCD 的接收灵敏度，但若要可靠地以绝对能量为单位表征声发射，还需额外的空间信息。这可通过将 PCD 替换为阵列探头以实现被动声学映射（PAM）⁸⁰ 来达成。然而，这种方法将增加信号处理的复杂性以及所需的计算时间和计算资源。

也可整合其他用于测量膜电导率或施加物理靶向方法（例如磁场）的仪器。此外，可使用三维组织结构（如肿瘤球状体、类器官，甚至离体组织样本）替代细胞单层，将其置于声学“柔软”的凝胶基底上，以在更接近真实的组织环境中研究超声及空化介导的效应。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
吸收体	Precision Acoustics	APTFlex F28 panel	标准厚度 1.0 cm
功率放大器	E&I Ltd.	1040L	400W 功率放大器，用于驱动超声源
前置放大器	Stanford Research Systems	SR445A	固定增益多级前置放大器，用于 PCD 信号
水族箱加热器	Aquael	Ultra 50W	适用于不同尺寸水箱的不同型号
数字化仪	TiePie Engineering	HS5-110-XM	扩展内存选项：每通道 32M 点
水听器	Precision Acoustics	FOH	敏感区域直径为 0.01 mm，可最大限度减少指向性效应
微泡造影剂	Bracco	SonoVue	经 FDA 批准的微泡
PCD 反射镜（SAT3）	Olympus NDT	F-102	90 度光束反射
PCD 换能器	Olympus NDT	V320-SU	浸入式换能器，7.5MHz
PCD 防水电缆	Olympus NDT	BCU-58-1 W
PDMS（SAT2 腔室盖）	Corning	Sylgard 184	制备方法参见 Carugo 等（2015）
聚合物棒（SAT2 密封）	Zeus	PTFE 单丝
橡胶塞（SAT3 盖/密封）	VWR	391-2101	底部直径 6mm，顶部直径 8mm，红色
信号发生器	Agilent	33250	用于超声源的波形发生器
细胞暴露腔室基底（SAT2）	Ibidi	µ-Dish 35mm
细胞暴露腔室基底（SAT3）	Corning	Transwell 6.5mm
超声源（SAT3）	Sonic Concepts	H107 带中心孔	使用具备 HIFU 能力的声源，可在焦点及焦点前区域产生超过 >1MPa 的压力，从而实现更广的空间覆盖范围