通过珠粒上Galectin-3与U1 snRNP复合物对剪接活性的互补作用

摘要

本文描述了以下实验步骤：（a）从核提取物中去除U1 snRNP，同时伴随剪接活性的丧失；（b）通过与共价连接抗半乳糖凝集素-3抗体的磁珠结合的半乳糖凝集素-3—U1 snRNP颗粒，在U1耗竭的提取物中重建剪接活性。

摘要

经典的耗竭-重建实验表明，半乳糖凝集素-3（galectin-3）是核提取物中必需的剪接因子。本文探讨了galectin-3进入剪接通路的机制。将HeLa细胞核提取物在12%–32%甘油梯度中进行沉降，可获得富含内源性约10S颗粒的组分，该颗粒包含galectin-3和U1 snRNP。本文现描述一种耗竭核提取物中U1 snRNP并同时丧失剪接活性的实验方案。在U1耗竭的提取物中，剪接活性可通过固定在琼脂糖珠上的galectin-3–U1 snRNP复合物恢复，该珠子共价偶联了抗galectin-3抗体。结果表明，galectin-3–U1 snRNP–前体mRNA三元复合物是一种功能性E复合物，可生成剪接反应的中间产物和终产物，且galectin-3通过与U1 snRNP的结合进入剪接通路。利用珠子上亲和或免疫筛选的复合物来重建特定剪接因子耗竭提取物中的剪接活性，这一策略可能普遍适用于其他系统。

引言

大多数真核生物信使RNA（mRNA）的生成涉及在细胞核中进行的前体mRNA剪接过程，该过程通过切除内含子并将外显子连接起来完成¹。两类核糖核蛋白复合物（RNPs）通过剪接体复合物介导前体信使RNA向成熟mRNA的加工。第一类为新生前体信使RNP，它在转录过程中由异质性核RNP蛋白及其他RNA结合蛋白（包括部分SR家族成员）结合形成，产生hnRNP复合物²。第二类为富含尿嘧啶的小核RNP（U snRNP，包含U1、U2、U4、U5和U6 snRNA），其与U特异性蛋白和核心蛋白相关联^3,4。在内含子被切除、外显子被连接形成成熟mRNP的动态重排过程中，U snRNP以有序的方式与前体信使RNP的特定区域相互作用⁵。许多其他核蛋白也参与这些加工事件⁶。

半乳糖凝集素-1（Gal1）和半乳糖凝集素-3（Gal3）是剪接通路中的两个必需因子，这一点已在去除-重建研究中得到证实^7,8。从具有剪接活性的核提取物（NE）中同时去除这两种半乳糖凝集素，会导致剪接体组装和剪....

方案

1. 一般操作的注意事项

1. 确保所有化学品（缓冲液组分、酶等）均无核糖核酸酶（RNase）污染。将所有 commercially 购买的试剂瓶与常规实验室使用区分开。实验操作的每一步均需佩戴手套。仅使用经过烘烤处理（见下文步骤 1.2）的玻璃器皿和工具，以及经过预处理（见下文步骤 1.3）的溶液。
2. 将所有玻璃器皿（烧杯、锥形瓶、试剂瓶、移液管等）在 177 °C 下至少烘烤 4 小时。其他工具（药匙、磁力搅拌子等）需先用铝箔包裹，再在相同条件下进行烘烤。
3. 用双蒸水（ddH₂O）配制 0.1%（体积/体积）的焦碳酸二乙酯（DEPC）溶液。使用磁力搅拌子搅拌过夜，然后进行高压灭菌。使用经 DEPC 处理的 H₂O 配制所有含 Tris 的溶液，随后使用瓶顶式真空滤器过滤除菌。配制其他不含 Tris 的溶液时，使用普通的 ddH₂O，然后加入 DEPC 至终浓度 0.1%（体积/体积），再进行高压灭菌。
   注意：本组实验步骤中所用缓冲液按字母顺序列于表 1中。

缓冲液名称	成分
硼酸盐缓冲液	0.2 M 硼酸钠，pH....

结果

将不含U1 snRNP的核提取物（来自第2.2.6节的U1ΔNE）与通过抗Gal3抗体免疫沉淀得到的10S区甘油梯度中的Gal3-U1 snRNP复合物（步骤3.2.7）混合进行剪接反应。该反应体系中含有U1 snRNA（图2A，第3道），以及U1特异性蛋白U1-70K（图2B，第3道）。如预期所示，抗Gal3抗体沉淀出了Gal3蛋白（图2B，第3道）。这些组分（U1 snRNA、U1-70K蛋白和Gal3）在前免疫血清（PI）对照沉淀中均未检测到（图2A、图2B，第2道）。与作为阳性对照的未耗竭核提取物相比（图2C，第1道），U1ΔNE未表现出剪接活性（图2C

讨论

本报告提供了实验细节，证明被固定在抗Gal3包被的磁珠上的Gal3-U1 snRNP复合物能够结合pre-mRNA底物，并且该三元复合物可恢复U1 snRNP耗竭的核提取物（NE）中的剪接活性。Gal3是凝集素蛋白家族的一个成员，最初因其对半乳糖特异的碳水化合物结合活性而被分离出来²³。早期的免疫荧光和亚细胞分级研究表明Gal3可能与剪接机器的组分相关：其与snRNP的Sm核心多肽以及丝氨酸-精氨酸富集（SR）剪接因子家族在核内斑点（nuclear speckles）中共定位^24,25，并在氯化铯梯度离心中以与hnRNP和snRNP一致的密度（1.3–1.35 g/mL）沉降²⁴。随后的耗竭-重建实验进一步表明，在无细胞剪接体系中，Gal3（以及凝集素家族的另一成员galectin-1（Gal1））是必需但功能冗余的因子^7,

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
抗U1 snRNP	结合位点	Hu ENA-RNP #33471	针对U1 snRNP的人自身免疫血清
瓶顶式真空滤器	赛默飞世尔科技	Corning 431153 (0.22 μm; PES 150 ml)	用于过滤含Tris的溶液
离心机	国际设备公司	IEC Model PR-6	用于免疫沉淀中沉淀Sepharose珠
焦碳酸二乙酯（DEPC）	Sigma-Aldrich	159220-5G	用于处理配制所有溶液所用水
二甲基戊二亚胺酸（DMP）	Sigma-Aldrich	80490-5G	用于将抗体交联至Sepharose珠
电泳槽	BioRad Laboratories, Inc	Mini-Protean II	用于蛋白质的SDS-PAGE分离
乙醇胺	Sigma-Aldrich	411000-100ml	用于交联反应后的封闭
凝胶电泳系统	Hoefer, Inc	HSI SE 500系列	用于通过凝胶电泳分离snRNA
凝胶板干燥仪	BioRad	Model 224	用于干燥凝胶板以进行放射自显影
Hybond ECL膜	GE Healthcare	RPN3032D (0.2 μm; 30 cm x 3 m)	用于膜上蛋白质的免疫印迹
微量透析仪（12 x 100 μl样品容量）	Pierce	Microdialyzer System 100	用于更换核提取物的缓冲液
微量透析膜（8K截留分子量）	Pierce	66310	用于更换核提取物的缓冲液
脱脂奶粉	Spartan Stores	Spartan Instant Non-fat Dry Milk
Protein A Sepharose CL-4B	Millipore-Sigma	GE 17-0780-01	用于将抗体偶联至珠
蛋白酶K	Millipore-Sigma	P2308-5mg	用于终止剪接反应以分离RNA
RNasin	Promega	N2111	用于抑制核糖核酸酶活性
摇床/旋转器	Lab Industries, Inc	Labquake Shaker 400-110	用于偶联反应和免疫沉淀中混合蛋白质溶液
Safety-Solve	Research Products International Corp.	编号 111177	用于测定剪接底物中放射性的闪烁计数液
闪烁计数器	贝克曼仪器公司	LS6000SC	用于测定放射性的闪烁计数器
真空浓缩仪	Savant	SVC 100H	用于干燥乙醇沉淀的RNA沉淀
Transphor电泳转印装置	Hoefer, Inc	Hoefer TE系列Transphor	用于将蛋白质从SDS-PAGE转移至印迹膜