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方法文章

直接重编程人类成纤维细胞为成肌细胞以研究神经肌肉疾病疗法

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DOI：

10.3791/61991

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2021年4月3日

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1Center for Gene Therapy, The Research Institute at Nationwide Children’s Hospital, 2Center for Cardiovascular Research, The Research Institute at Nationwide Children’s Hospital, 3The Heart Center, Nationwide Children’s Hospital, 4Division of Genetic and Genomic Medicine, Nationwide Children’s Hospital, 5Department of Human Genetics, The University of Utah School of Medicine, 6Department of Pediatrics, The Ohio State University

本文内容

摘要

本方案描述了将皮肤成纤维细胞转化为成肌细胞，并进一步分化为肌管细胞的过程。这些细胞系来源于患有神经肌肉疾病的患者，可用于研究病理机制以及测试治疗策略。

摘要

对肌营养不良症的病理生理学及治疗靶点的研究，因人类成肌细胞增殖能力有限而受到阻碍。尽管已建立多种小鼠模型，但这些模型要么不能真实反映人类疾病的病理生理特征，要么无法代表人类中广泛存在的突变谱。永生化人原代成肌细胞是克服这一局限性的替代方案；然而，该方法仍依赖肌肉活检，而肌肉活检具有侵入性且不易获取。相比之下，皮肤活检更容易获得，对患者的侵入性也更小。来源于皮肤活检的成纤维细胞可被永生化并转分化为成肌细胞，从而提供一种具有优良成肌潜能的细胞来源。本文中，我们描述了一种快速且直接的成纤维细胞向成肌细胞系重编程的方法。成纤维细胞通过两种慢病毒进行转导：一种为hTERT，用于永生化原代培养细胞；另一种为四环素诱导型MYOD，在添加多西环素后可诱导成纤维细胞转化为成肌细胞，并进一步形成表达晚期分化标志物的成熟肌管。这一快速转分化方案为研究神经肌肉疾病的病理机制，以及探索基于基因或药理学的创新生物疗法提供了有力工具。

引言

直接从人体组织获取的细胞模型可用于模拟多种人类遗传性疾病，其优势在于保留了原始的基因组背景，并且在许多情况下能够重现患者中观察到的相同分子和细胞特征。在神经肌肉疾病领域，肌肉活检一直是获取人源成肌细胞的重要来源，并有助于阐明疾病的病理机制。此外，它们也是研究中的重要工具，用于 体内 药物和基因治疗的测试。一方面，从肌肉组织碎片中分离成肌细胞相对容易；另一方面，由于原代成肌细胞增殖能力有限且易发生复制性衰老，其培养与维持较为困难 体外1克服这些局限性的另一种方法是通过导入人端粒酶（human telomerase）使成肌细胞永生化。hTERT）和/或细胞周期蛋白依赖性激酶4（CDK4基因2,3，同时保留骨骼肌特征4然而，原代成肌细胞的获取仍然依赖于肌肉活检，这是一种对患者具有不利影响的外科手术，而在许多情况下，患者的肌肉已处于严重的退变状态。因此，这些患者的肌肉组织中含有较大量纤维化和/或脂肪组织，所能获得的肌肉细胞数量较少，故在永生化之前需对细胞进行预先纯化。

与肌肉活检相比，皮肤活检更易于获取，且对患者的伤害更小。可在体外（in vitro）从皮肤组织碎片中分离获得原代成纤维细胞。尽管成纤维细胞并非神经肌肉疾病相关突变的主要受累细胞，但其可被转分化为成肌细胞。这一过程可通过导入Myod基因实现，该基因编码一种成肌调节转录因子5。在本论文中，我们描述了从建立成纤维细胞培养到获得分化后的肌管细胞的完整转分化成肌细胞实验方案（该方法的代表性流程图如图1所示）。

治疗策略的临床前测试依赖于携带与人类患者相似突变的细胞和动物模型。尽管随着CRISPR/Cas96等基因编辑技术的发展，动物模型的构建已变得更加可行，但仍具有挑战性且成本较高。因此，来源于患者的细胞系成为一种易于获取的模型选择，可用于涵盖杜氏肌营养不良症（DMD）等疾病中广泛存在的各类突变。获取和建立细胞模型对于此类疾病的个体化治疗研发至关重要。

在已研究的个性化治疗策略中，外显子跳跃技术是针对不同类型肌营养不良症的有前景的方法之一7,8。该策略旨在产生一种长度较短但具有功能的蛋白质，其原理是通过掩盖突变外显子在剪接体中的识别信号，使其在最终的信使RNA中被排除。这一技术极具前景，已获得美国食品药品监督管理局（FDA）对杜氏肌营养不良症（DMD）治疗的批准。因此，本实验方案还描述了使用两种不同的外显子跳跃相关技术转染成肌细胞的方法：反义寡核苷酸（AON）和U7小核RNA-腺相关病毒（AAV）。AON转染是初步筛选多种设计用于促进外显子跳跃序列的有效工具9。然而，AON的作用是短暂的。为了实现反义序列的持续表达，我们还探索了将小核RNA（snRNA）与AAV相结合的方法，从而实现核内定位并整合入剪接机制10。U7是一种参与组蛋白mRNA加工的小核RNA，可通过基因工程改造使其结合特定蛋白，从而被重新定向至剪接体并递送反义序列11。将修饰后的U7 snRNA与AAV载体联合使用，可克服AON的局限性，实现反义序列的长期表达，并提高对目标组织的转导效率12。本方案采用来源于DMD患者的细胞，以展示外显子跳跃策略的应用。

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方案

所有实验和活检均在 Nationwide Children's Hospital 机构审查委员会批准下，遵循相关机构的伦理规定进行。

1. 皮肤成纤维细胞培养的启动

  1. 成纤维细胞培养的建立
    1. 将10 mL成纤维细胞培养基（表1）分装至15 mL锥形管中。皮肤活检组织应置于该培养基中并以此方式运输。活检样本可在4 °C下保存，直至处理，最好在同一天内处理。
      注意：请在24–36小时内使用皮肤活检样本，以避免潜在的污染菌生长。
    2. 吸除管中的培养基，并用10 mL 1×PBS（室温）将活检组织清洗三次。第三次清洗后，将PBS保留在管中。
    3. 将PBS和皮肤组织一同倒入一个10 cm2培养皿中。
    4. 使用无菌手术刀将活检组织切割成尽可能小的碎片。
    5. 用移液器取单个皮肤碎片，滴入洁净的10 cm2培养皿中。每皿放置10至12个碎片。
    6. 吸除每个碎片周围的过量PBS，注意不要吸走碎片本身。
    7. 将培养皿盖部分打开，使皮肤碎片在空气中干燥5–20分钟。注意不要使碎片过度干燥。
    8. 碎片干燥后，将培养皿倾斜45度，缓慢从角落加入12 mL成纤维细胞培养基。然后将培养皿放平，小心使培养基均匀分布，避免碎片被冲起。
    9. 将培养皿放入培养箱（37 °C，5% CO2）中。5–7天后更换培养基，之后每周更换一次。
    10. 观察从组织碎片中迁移出的成纤维细胞（图2），待细胞融合后，将细胞传代至75 cm2培养瓶中。吸除培养基，用PBS清洗细胞，加入1 mL 0.25%胰蛋白酶。在37 °C下孵育5分钟，或直至所有细胞脱落。加入10 mL成纤维细胞生长培养基以终止胰蛋白酶消化，并将细胞转移至新的培养瓶中。
      ​注意：关于传代次数的命名，当从皮肤活检组织中首次迁移出的成纤维细胞被转移至新培养瓶进行扩增时，定义为P1代。
  2. 原代成纤维细胞系的冷冻保存
    1. 当75 cm2培养瓶中的细胞达到融合状态时，用10 mL 1×PBS清洗，吸除PBS。
    2. 向细胞表面加入3 mL 0.25%胰蛋白酶，将培养瓶放入培养箱中孵育5分钟。在显微镜下观察细胞是否已脱落。若未完全脱落，将培养瓶继续放回培养箱中孵育额外5分钟。
    3. 细胞完全脱落后，向培养瓶中加入7 mL成纤维细胞培养基，反复吹打使细胞重悬，将细胞悬液收集至50 mL锥形管中。
    4. 准备100 µL台盼蓝溶液，从待冻存的样品中取出100 µL，与台盼蓝混合。将混合液加入血细胞计数板，在显微镜下计数四个不同区域的细胞数。使用以下公式计算细胞总数：（计数细胞数/100）× 培养液体积。
    5. 在室温或4 °C下，以300 × g离心10分钟。
    6. 吸除上清液，将细胞重悬于适量的冻存液中：每100万细胞/管使用1 mL冻存液。反复吹打混匀，并将1 mL细胞悬液分装至各已标记的冻存管中。
    7. 将冻存管放入程序降温盒中，置于-80 °C冰箱中过夜，使冻存管以1 °C/min的速率缓慢降温。
    8. 次日将冻存管转移至液氮罐或-150 °C超低温冰箱中长期保存。

2. 成纤维肌母细胞（FM）细胞系的建立

  1. 在12孔板的两个孔中以约30%的汇合度接种原代成纤维细胞（2 × 104 个细胞/孔），以确保次日细胞汇合度约为50%。
  2. 进行慢病毒转导时，在400 µL成纤维细胞培养基中加入2至5 × 109 vg（病毒基因组颗粒）的hTERT-嘌呤霉素慢病毒；在第二个孔中仅加入400 µL成纤维细胞培养基。次日添加1 mL培养基。
    注：用于慢病毒生产的质粒来自发表Chaouch et al, 2009论文的研究团队。这些质粒在Aure et al, 200713中对hTERT质粒、以及Barde et al, 200614中对用于MyoD质粒构建的Tet-on系统均有单独描述。这些质粒通过与法国Genethon签署材料转移协议获得（请联系Vincent Mouly博士获取这些质粒 - vincent.mouly@upmc.fr）。简而言之，hTERT质粒包含由CMV启动子驱动的hTERT变体1，而嘌呤霉素抗性基因由PGK启动子驱动。MyoD质粒包含由CMV启动子驱动的MyoD变体1，受阻遏蛋白rtTA2调控，该质粒还包含由SV40启动子驱动的潮霉素抗性基因。
    慢病毒采用常规慢病毒生产方法制备（参见Wang和McManus在JoVe中的实验方案15）。简要而言，通过氯化钙沉淀法将MDL辅助质粒、Rev辅助质粒、SVS-G辅助质粒与hTERT或MyoD质粒共同转染。48小时后收集上清液，并在之后连续三天继续收集。所有上清液经超速离心浓缩。沉淀物重悬于Tris-HCl + NaCl + EDTA缓冲液中。病毒滴度通过标准慢病毒qPCR检测进行评估。
  3. 一至两天后，将细胞转移至6孔板，培养至细胞汇合度达60–70%。
  4. 在成纤维细胞培养基中添加1 µg/mL嘌呤霉素，每孔加入2 mL。
  5. 持续对细胞进行筛选，直至对照孔中所有细胞死亡（最长可达12天），每2–3天更换一次培养基。将细胞从6孔板传代至两个10 cm2培养皿中以进一步扩增。
  6. 筛选完成后冻存成纤维细胞。标记为F(hTer)。
  7. 在12孔板的两个孔中，以约30%汇合度接种表达hTERT的成纤维细胞（F(hTer)），使用成纤维细胞培养基培养，以确保次日细胞汇合度约为50%。
  8. 进行慢病毒转导时，将2至5 × 109 vg的MyoD-潮霉素B慢病毒加入400 µL成纤维细胞培养基中混匀，加入相应孔中；在第三个孔中加入400 µL成纤维细胞培养基。次日每孔加入1 mL培养基。
  9. 一至两天后，将细胞转移至6孔板，培养至汇合度达60–70%。
  10. 在成纤维细胞生长培养基中添加潮霉素B（400 µg/mL），每孔加入2 mL。
  11. 持续对细胞进行筛选，直至对照孔中所有细胞死亡（最长可达12天），每2–3天更换一次培养基。
  12. 筛选完成后冻存成纤维细胞。标记为FM，后接细胞编号/名称。

3. 转分化实验方案

  1. 将转导的 FM 细胞以 30-40% 的融合度接种至 10 cm2 培养皿中。在 12 孔板中，接种 6 × 104 个细胞（具体数量取决于所用细胞系）。
    注意：进行免疫染色时，需将细胞接种于经 Matrigel 包被的玻璃盖玻片或腔室载玻片上。用 DMEM 培养基按 1:10 比例稀释 Matrigel，加入足以覆盖表面的体积，在室温下静置 1 小时。在接种细胞前，吸除 Matrigel 溶液。
  2. 进行成肌细胞诱导时，当成纤维细胞达到 70% 融合度（图 3A），用 PBS 冲洗细胞表面，并加入新鲜的成肌细胞培养基，补充 8 µg/mL 新鲜的多西环素。
    注意：当融合度超过 80% 时，分化效果会受到影响。
  3. 两到三天后，细胞融合度达到 90-95%，形态发生改变（图 3B）。用 PBS 冲洗细胞表面，加入新鲜的分化培养基，补充 8 µg/mL 新鲜的多西环素。
  4. 继续每 2-3 天更换一次培养基，不进行传代，直至肌管形成（通过形态学确认）（图 3C）。
  5. 开始肌管分化后 7 至 10 天，细胞应已完全分化，可能开始脱落或死亡。在发生此现象前，收获肌管用于后续分析。
    注意：肌管形成的进程因细胞系而异。肌肉相关蛋白的突变可能影响成肌潜能。当肌管边缘变得明亮并呈现白色时，表明其开始脱落（图 4）。
  6. 收获肌管时，收集培养基并转移至 50 mL 锥形管中。培养基中可能含有已脱落的肌管。
  7. 用 5 mL PBS 冲洗肌管，并将 PBS 转移至 50 mL 管中。
  8. 向细胞表面加入 3 mL 0.25% 胰蛋白酶。将培养皿放入培养箱中孵育 5 分钟。在显微镜下检查细胞是否已脱落。若未脱落，将其放回培养箱中继续孵育 5 分钟。
  9. 一旦细胞脱落，向培养皿中加入 7 mL 成纤维细胞培养基，反复吹打以重悬细胞。将细胞收集至 50 mL 锥形管中。
  10. 在 4 °C 条件下，以 1,200 × g 离心 7 分钟。
  11. 小心吸除上清液，避免扰动沉淀。将沉淀物储存于 -80 °C，直至进一步处理。

4. 分化肌管的免疫染色

注意：进行免疫染色时，应将细胞接种于玻璃盖玻片或腔室载玻片中，具体操作如上所述。

  1. 肌管完全分化后，吸去培养基，并用 PBS 轻轻冲洗载玻片，然后吸去 PBS。
  2. 加入新鲜的 4% 多聚甲醛（每孔 500 µL，适用于 12 孔板），室温孵育 10 分钟，然后吸去多聚甲醛。
  3. 用 1 mL PBS 冲洗。
  4. 加入 0.2 M 甘氨酸，室温孵育 10 分钟，然后吸去甘氨酸。
  5. 用含 0.5% TritonX-100 的 PBS（每孔 300 µL，适用于 12 孔板）进行通透处理，轻轻振荡孵育 10 分钟。
  6. 每孔加入 300 µL 封闭液，轻轻振荡孵育 10 分钟。
  7. 将一抗用封闭液按 1:50 稀释，每孔加入 300 µL，室温孵育 2 小时，期间轻轻振荡。
  8. 用 PBS 每孔 1 mL 轻轻振荡冲洗三次，每次 5 分钟。
  9. 将二抗用封闭液按 1:500 稀释，每孔加入 300 µL，室温孵育 1 小时，期间轻轻振荡，并用铝箔包裹培养板避光。
  10. 用 PBS 每孔 1 mL 轻轻振荡冲洗三次，每次 5 分钟。
  11. 将 DAPI 用 PBS 稀释后孵育 10 分钟，然后用 PBS 每孔 1 mL 冲洗三次。
  12. 在载玻片上滴加一滴封片剂，用镊子取下盖玻片，将其有样本的一面朝下覆盖在封片剂液滴上。
  13. 将载玻片倒置在纸巾上，轻轻按压以去除气泡和多余的封片剂。
  14. 用指甲油封边，4 °C 避光保存直至成像。

5. 反义寡核苷酸转染

注意：以下方案适用于6孔板的转染。对于更小或更大的培养板，请相应调整体积。转染应在成肌细胞达到100%汇合度、准备进入分化阶段时进行。

  1. 吸弃成肌细胞生长培养基，并用 1 mL PBS 洗涤细胞。
  2. 每孔加入 500 µL OptiMEM 培养基，在 37 °C 下孵育 1 小时。
  3. 将反义寡核苷酸（AON）用 100 µL OptiMEM 稀释至所需终浓度（例如 50 nM、100 nM、200 nM、500 nM），室温孵育 5 分钟。
    注意：本方案已针对 2'-O-甲基磷酸硫代酯修饰的 AON 进行优化。
  4. 将脂质体转染试剂（lipofectamine）与 OptiMEM 混合（终体积为 100 µL），使 DNA 与脂质体转染试剂的终比例为 1:1（µg DNA : µL lipofectamine），室温孵育 5 分钟。
  5. 将稀释后的脂质体转染试剂与稀释后的 AON 混合，轻轻吹打混匀，室温孵育 20 分钟以形成复合物。避免产生气泡。
  6. 向各孔中加入 200 µL 脂质体转染试剂与 AON 的混合液，在 37 °C、5% CO2 条件下过夜孵育细胞。
  7. 次日移除转染混合物，每孔加入 2 mL 含有多西环素的预热分化培养基。
  8. 至少在分化三天后收集细胞用于 RNA 提取，或在七至二十一天后收集用于蛋白质分析。
    ​注意：检测目标基因 RNA 和/或蛋白质表达所需的分化天数可能因基因或细胞系而异。对于 DMD 基因，其 mRNA 可在分化三天内检测到，而抗肌萎缩蛋白（dystrophin）的检测则至少需要七天。具体时间取决于所用细胞系。高浓度的 AON 和转染试剂可能影响细胞的转分化过程。

6. AAV1-U7 转导

注意：本方案已针对6孔板进行优化。请根据培养表面积按比例调整体积。转导操作应在成肌细胞达到100%汇合且已准备好进入分化阶段时进行。AAV1是转导培养成肌细胞效率最高的腺相关病毒血清型。

  1. 吸去成肌细胞生长培养基，并用 1 mL PBS 清洗细胞。
  2. 将 0.5–1 × 1011 个 AAV1-U7 病毒颗粒溶于 700 µL 含多西环素的预热分化培养基中。
    ​注意：我们使用 qPCR 测定病毒浓度。所用病毒量可能因定量方法不同而有所差异，应事先通过报告基因检测确定最佳用量。
  3. 将病毒混合液均匀滴加至孔中。
  4. 次日，加入 1.3 mL 含多西环素的预热分化培养基。
  5. 至少三天后收集细胞用于 RNA 提取，若进行蛋白质分析，则在七至二十一天后收集。

7. RNA 提取

注意：此步骤中使用的所有材料均应为无RNase的。

  1. 每份细胞沉淀中加入 500 µL TRIzol，反复吹打数次，确保细胞充分且均匀地裂解。
  2. 将细胞裂解液转移至 1.5 mL 离心管中，在室温下孵育 5 分钟。
  3. 加入 100 µL 氯仿，手动振荡 15 秒，室温孵育 5 分钟。
  4. 在 4 °C 下以 12,000 × g 离心 15 分钟，收集上层水相，并转移至新的 1.5 mL 离心管中。
  5. 按水相体积加入等体积的 100% 乙醇，通过移液器吹打混匀。
    注意：我们建议使用柱法进行纯化和浓缩。
  6. 将样品转移至 Zymo-Spin IC 柱（置于收集管中），在 12,000 × g 下离心 30 秒，弃去穿流液。
  7. 如需在柱上进行 DNase I 消化，先用 400 µL RNA Wash Buffer 预洗涤柱子，在 12,000 × g 下离心 30 秒，弃去穿流液。
  8. 每份样品配制 40 µL DNase 反应混合液，将 5 µL DNase I 与 35 µL DNA Digestion Buffer 混合均匀。
  9. 将混合液直接加至柱基质中，在室温下孵育 15 分钟。
  10. 向柱中加入 400 µL RNA Prep Buffer，在 12,000 × g 下离心 30 秒，弃去穿流液。
  11. 向柱中加入 700 µL RNA Wash Buffer，在 12,000 × g 下离心 30 秒，弃去穿流液。
  12. 向柱中加入 400 µL RNA Wash Buffer，在 12,000 × g 下离心 2 分钟，以确保彻底去除洗涤缓冲液。小心将柱子转移至无 RNase 的 1.5 mL 离心管中。
  13. 直接向柱基质中加入 15 µL 无核酸酶水，孵育 5 分钟后在 12,000 × g 下离心 1 分钟。
    注意：收集洗脱的 RNA，再次加回到柱子中以提高得率，然后在 12,000 × g 下离心 1 分钟。
  14. 将样品置于冰上，并使用 Nanodrop 进行定量。
  15. 将样品储存在 -80 °C 条件下。

8. RT-PCR 分析

注意：在此步骤中，我们提供了一种用于检测肌营养不良蛋白mRNA表达的试剂建议，但也可根据需要轻松替换为其他选用的试剂。

  1. 逆转录
    1. 将所有试剂解冻后置于冰上保存。
    2. 配制反应混合液：每份加入 4 µL 的 5x 反应缓冲液、2 µL dNTP 混合液（10 mM）、1 µL RiboLock RNase 抑制剂和 1 µL RevertAid 逆转录酶。
    3. 轻轻混匀反应管，并短暂离心。
    4. 在 0.2 mL 的 PCR 管中，加入适量 RNA 样品，使每反应含 RNA 1 µg，再用无核酸酶水补至 12 µL。设置一个不含逆转录酶的反应管作为阴性对照，另设一个以无核酸酶水替代 RNA 的反应管。
    5. 每管加入 8 µL 反应混合液，总体积为 20 µL。
    6. 将反应管放入热循环仪中，于 25 °C 孵育 5 分钟，随后在 42 °C 孵育 60 分钟，最后在 70 °C 加热 5 分钟以终止反应。
    7. 将反应产物置于冰上，或于 -20 °C 长期保存。
  2. PCR
    注意：建议优先在外显子连接区域设计引物。
    1. 使用前将试剂涡旋混匀并短暂离心。
    2. 按每份样品配制主混合液：0.5 µL 正向引物（25 µM）、0.5 µL 反向引物（25 µM）、12.5 µL 2x PCR 主混合液和 8.5 µL 无核酸酶水。
    3. 将 22 µL 主混合液分装至每个样品对应的 PCR 管中。
    4. 向各 PCR 管中加入 3 µL cDNA（150 ng），阴性对照管中加入 3 µL 无核酸酶水。
    5. 涡旋混匀 PCR 管后短暂离心。
    6. 将反应管放入热循环仪，依次进行以下程序：95 °C 预变性 3 分钟，随后进行 34 个循环：95 °C 变性 30 秒，(Tm-5) °C 退火 30 秒，72 °C 延伸 (1 分钟/kb)，最后在 72 °C 延伸 5 分钟。
      注意：最佳退火温度可通过实验确定。对于推荐使用的主混合液，建议退火温度设置为比引物熔解温度低 5 °C。
    7. 取 12 µL PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳，其余样品于 -20 °C 冻存。

9. 通过蛋白质印迹法检测抗肌萎缩蛋白的表达

注意：本方案针对 dystrophin（一种大型膜蛋白）进行了优化。对于不同蛋白质，可能需要特定条件。

  1. 蛋白质提取
    1. 分化7-21天后，用5 mL PBS（含100 µL 0.5 M EDTA和50 µL蛋白酶抑制剂）收集细胞，37 °C孵育至细胞脱落。在4 °C下以1,200 x g离心5分钟。将细胞沉淀迅速浸入液氮中速冻。将沉淀储存于-80 °C或直接进行裂解步骤。
    2. 通过向基础缓冲液中加入1%皂苷（digitonin）、1%蛋白酶抑制剂、10%磷酸酶抑制剂，配制裂解缓冲液至终体积（每份细胞沉淀60 µL）。
    3. 将60 µL裂解缓冲液加入细胞沉淀中，置于冰上。超声处理5秒，冰上静置8秒。重复超声和静置步骤两次。
    4. 将样品在冰上孵育30分钟。
    5. 在4 °C下以14,000 x g离心20分钟。
    6. 将上清液转移至洁净离心管中。
    7. 按照制造商说明，使用二辛可宁酸（BCA）法对样品进行定量。
    8. 将蛋白溶液与适量Laemmli缓冲液混合，分装为每份100 µg。如有必要，用基础裂解缓冲液调整体积至25 µL。样品储存于-80 °C。
  2. Western blotting
    1. 将样品置于冰上解冻。
    2. 在100 °C变性5分钟，然后置于冰上冷却，短暂离心。
    3. 将20X Tris-乙酸SDS电泳缓冲液用200 mL dH2O稀释，并加入500 µL抗氧化剂。
    4. 取出梳子并用dH2O冲洗，制备3-8% Tris-乙酸聚丙烯酰胺凝胶。将凝胶组装至电泳装置中，内槽加入电泳缓冲液。
    5. 在凝胶孔中加入5 µL蛋白ladder和25 µL样品，外槽加入电泳缓冲液。
    6. 在4 °C下以80 V运行1小时，随后在4 °C下以120 V运行2小时。
    7. 用150 mL 20X甲醇、150 mL 20X转移缓冲液和2,700 mL dH2O配制3 L 1X转移缓冲液，并冷却至4 °C。
    8. 裁剪4张滤纸和1张硝酸纤维素膜。将滤纸和膜在盛有转移缓冲液的托盘中充分浸泡。
    9. 小心从玻璃板中取出凝胶，并与滤纸、膜和海绵一起组装至转移装置中。凝胶置于负极侧，膜置于正极侧。
    10. 在4 °C下以300 mA恒流、持续搅拌条件下过夜转移。
    11. 用10 mL封闭缓冲液在室温下轻轻振荡封闭膜1小时。
    12. 用10 mL封闭缓冲液和50 µL抗dystrophin抗体（1:200）配制一抗溶液。
    13. 弃去封闭缓冲液，加入一抗溶液。在室温下轻轻振荡孵育至少2小时，或在4 °C过夜孵育。
    14. 用含0.1% Tween的PBS轻轻振荡洗涤膜3次，每次5分钟。
    15. 用10 mL封闭液、2 µL抗兔二抗（1:5000）和20 µL 0.2% Tween配制二抗溶液。
    16. 将二抗溶液加入膜中，在室温下避光、轻轻振荡孵育1小时。
    17. 弃去二抗溶液，在避光条件下用含0.1% Tween的PBS轻轻振荡洗涤膜3次，每次5分钟。
    18. 将膜置于成像仪中进行曝光和成像。
    19. 按照制造商说明，使用Revert 700总蛋白染色试剂对膜进行总蛋白染色。
      注：Western blot检测dystrophin的表达水平取决于患者的年龄/突变类型以及细胞融合并保持附着足够长时间以积累足够dystrophin的能力。

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结果

本方案展示了如何建立人皮肤来源的成纤维细胞培养物，并将其转化为成肌细胞，进而分化为肌管细胞。此类细胞系对于神经肌肉疾病的研究极为有用， 体外 潜在疗法的测试

成纤维细胞转化过程的示意图见图1。图2A显示了一段皮肤组织及其迁移出的成纤维细胞。当成纤维细胞达到汇合状态时，应将其传代至新的培养皿中（图2B）。在更换为含多西环素的成肌细胞生长培养基之前，成纤维细胞的理想汇合度如图3A所示。细胞汇合度应约为70%，因为在转化过程中细胞仍会继续增殖。若细胞汇合度超过80%，则可能影响分化效果。成纤维细胞向成肌细胞的转化过程需要两到四天，可通过细胞形态学观察来确认。转化后的细胞会变得细长并呈平行排列，如图3B所示。加入分化培养基后，成肌细胞停止分裂，并开始融合形成多核的肌管（

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讨论

为了获得高质量的FM细胞系，某些步骤至关重要。皮肤活检样本的处理越及时，获得健康成纤维细胞的可能性就越大。成纤维细胞培养的传代次数也很重要。原代细胞的增殖能力有限，经过多次传代后会进入复制性衰老状态。因此，最好储备低传代次数的成纤维细胞，并尽可能在最早传代阶段进行细胞转化。

另一个重要步骤是获得具有最高纯度和准确定量的病毒制备物。例如，使用qPCR进行病毒基因组定量可提供合理的测量结果，但采用ddPCR（数字滴定PCR）定量更为准确。

此外，成纤维细胞达到适当的汇合度对于成肌细胞转化至关重要。如果细胞汇合度低于70%或高于80%，成肌分化可能会受到影响。若细胞过于密集，肌管将出现多层叠加，干扰染色与成像。多西环素的浓度对于Myod基因的正确激活和持续表达极为关键。每次更换培养基时，必须立即加入多西环素，因其在培养基中稀释后于4 °C保存会迅速降解。多西环素储存液应以1000倍浓度保存于-20 °C，并避免光照。解冻后的分装样品不得再次冷冻。严格遵循这些操作细节，对于确保实验的可重复性、并区分因基因突变导致的分...

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披露

Nationwide Children's Hospital 已将本文所述的外显子2跳跃项目授权给 Audentes Therapeutics。K.M.F. 和 N.W. 因此项授权获得了特许权使用费。

致谢

我们感谢 Vincent Mouly 博士此前在该模型方面分享的知识。本研究得到了美国国立卫生研究院神经疾病和中风研究所（R01 NS043264（K.M.F. 和 R.B.W.））以及美国国立卫生研究院关节炎与肌肉骨骼和皮肤病研究所（NIAMS）（P50 AR070604-01（K.M.F.、K.M.、R.N. 和 N.W.））的资助。N.W. 获得了俄亥俄州立大学/全美儿童医院肌肉研究组和 Philippe 基金会的博士后资助。本研究还得到了机构内部自主资金的支持，其中部分外显子2跳跃研究工作也获得了 CureDuchenne（K.M.F.）和法国肌病协会的资助。IRB 编号：IRB #: IRB10-00358/ CR00005138 和 IBCSC#: IBS00000123。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
100 mm 培养皿Corning430167
0.25% 胰蛋白酶-EDTA，含酚红Thermo Fisher2500056
10X 磷酸盐缓冲液 (PBS)Fisher ScientificBP3994
12 孔板Corning3513
20X 转膜缓冲液Thermo FisherNP00061
20X Tris-乙酸 SDS 电泳缓冲液Thermo FisherLA0041
3-8% Tris-乙酸凝胶Thermo FisherEA0378BOX
75 cm² 培养瓶Corning430641U
抗生素-抗真菌素 100XThermo Fisher15240062
抗肌球蛋白重链（肌节）抗体Developmental Studies Hybridome BankMF20 上清液稀释比例 1:50
抗氧化剂Thermo FisherNP0005
BCA 蛋白定量试剂盒Thermo Fisher23227
氯仿Sigma-AldrichC2432
DAPIThermo FisherD3571稀释比例 1:1000
皂苷Millipore Sigma300410250MG
二甲基亚砜Sigma-AldrichD2438
DMEM，高糖，含 GlutaMAX 添加剂和丙酮酸钠Thermo Fisher10569044
DNase I 试剂盒 (250U)Zymo Research CorporationE1010
盐酸多西环素Fisher ScientificBP2653-5
Dup2 人源引物Fw_5' GCTGCTGAAGTTTGTTGG
TTTCTC 3'		Rv_5' CTTTTGGCAGTTTTTGCC
CTGT 3'
抗肌营养不良蛋白抗体Abcamab15277稀释比例 1:200
胎牛血清Thermo Fisher16000
甘氨酸Sigma-AldrichG8898
山羊抗小鼠 Alexa Fluor 488 标记二抗Thermo FisherA11001稀释比例 1:1000
Halt 蛋白酶抑制剂混合液 100XThermo Fisher78430
血细胞计数板Hausser Scientific3100
潮霉素 BThermo Fisher10687010
IRDye 680RD 山羊抗兔 IgG (H+L)Li-Cor926-68071稀释比例 1:5000
Lab-Tek II CC2 培养腔室载玻片系统Thermo Fisher15852
LaemmliBioworld105700201
Lipofectamine 3000 转染试剂Thermo FisherL3000008
Matrigel GFR 基底膜基质Corning354230
甲醇Fisher ScientificA412P-4
Mr. Frosty 冷冻容器Thermo Fisher51000001
硝酸纤维素膜 0.45 µmGE Healthcare Life Sciences10600002
正常山羊血清对照Thermo Fisher10000C
Odyssey 封闭缓冲液 (PBS)Li-Cor927-40003Western 印迹封闭缓冲液
Opti-MEM I 低血清培养基Thermo Fisher11058021
多聚甲醛Sigma-Aldrich158127
PCR 预混液Thermo FisherK0172
磷酸酶抑制剂Thermo FisherA32957
Precision Plus Protein 双色蛋白标准品Bio Rad1610374
嘌呤霉素Thermo FisherA1113803
Revert 700 总蛋白染色试剂（用于 Western 印迹归一化）Li-Cor926-11021
RevertAid 逆转录试剂盒Thermo FisherK1691
RNA Clean & Concentrator-25Zymo Research CorporationR1018
手术刀片Aspen Surgical372611
骨骼肌细胞分化培养基PromocellC23061
骨骼肌细胞生长培养基PromocellC23060
Triton X-100Acros Organics215682500
TRIzol 试剂Thermo Fisher15596026
Tween 20Fisher ScientificBP337500
超低温冰箱Thermo Scientific7402
UltraPure 0.5M EDTA，pH 8.0Thermo Fisher15575020
Vectashield 抗荧光淬灭封片剂Vector LabsH1000

参考文献

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