本方案描述了将皮肤成纤维细胞转化为成肌细胞，并进一步分化为肌管细胞的过程。这些细胞系来源于患有神经肌肉疾病的患者，可用于研究病理机制以及测试治疗策略。
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本文内容
摘要
摘要
对肌营养不良症的病理生理学及治疗靶点的研究，因人类成肌细胞增殖能力有限而受到阻碍。尽管已建立多种小鼠模型，但这些模型要么不能真实反映人类疾病的病理生理特征，要么无法代表人类中广泛存在的突变谱。永生化人原代成肌细胞是克服这一局限性的替代方案；然而，该方法仍依赖肌肉活检，而肌肉活检具有侵入性且不易获取。相比之下，皮肤活检更容易获得，对患者的侵入性也更小。来源于皮肤活检的成纤维细胞可被永生化并转分化为成肌细胞，从而提供一种具有优良成肌潜能的细胞来源。本文中，我们描述了一种快速且直接的成纤维细胞向成肌细胞系重编程的方法。成纤维细胞通过两种慢病毒进行转导：一种为hTERT，用于永生化原代培养细胞；另一种为四环素诱导型MYOD，在添加多西环素后可诱导成纤维细胞转化为成肌细胞，并进一步形成表达晚期分化标志物的成熟肌管。这一快速转分化方案为研究神经肌肉疾病的病理机制，以及探索基于基因或药理学的创新生物疗法提供了有力工具。
引言
直接从人体组织获取的细胞模型可用于模拟多种人类遗传性疾病，其优势在于保留了原始的基因组背景，并且在许多情况下能够重现患者中观察到的相同分子和细胞特征。在神经肌肉疾病领域，肌肉活检一直是获取人源成肌细胞的重要来源，并有助于阐明疾病的病理机制。此外，它们也是研究中的重要工具，用于 体内 药物和基因治疗的测试。一方面，从肌肉组织碎片中分离成肌细胞相对容易；另一方面，由于原代成肌细胞增殖能力有限且易发生复制性衰老，其培养与维持较为困难 体外1克服这些局限性的另一种方法是通过导入人端粒酶（human telomerase）使成肌细胞永生化。hTERT）和/或细胞周期蛋白依赖性激酶4（CDK4基因2,3，同时保留骨骼肌特征4然而，原代成肌细胞的获取仍然依赖于肌肉活检，这是一种对患者具有不利影响的外科手术，而在许多情况下，患者的肌肉已处于严重的退变状态。因此，这些患者的肌肉组织中含有较大量纤维化和/或脂肪组织，所能获得的肌肉细胞数量较少，故在永生化之前需对细胞进行预先纯化。
与肌肉活检相比，皮肤活检更易于获取，且对患者的伤害更小。可在体外（in vitro）从皮肤组织碎片中分离获得原代成纤维....
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方案
所有实验和活检均在 Nationwide Children's Hospital 机构审查委员会批准下，遵循相关机构的伦理规定进行。
1. 皮肤成纤维细胞培养的启动
- 成纤维细胞培养的建立
- 将10 mL成纤维细胞培养基（表1）分装至15 mL锥形管中。皮肤活检组织应置于该培养基中并以此方式运输。活检样本可在4 °C下保存，直至处理，最好在同一天内处理。
注意：请在24–36小时内使用皮肤活检样本，以避免潜在的污染菌生长。 - 吸除管中的培养基，并用10 mL 1×PBS（室温）将活检组织清洗三次。第三次清洗后，将PBS保留在管中。
- 将PBS和皮肤组织一同倒入一个10 cm2培养皿中。
- 使用无菌手术刀将活检组织切割成尽可能小的碎片。
- 用移液器取单个皮肤碎片，滴入洁净的10 cm2培养皿中。每皿放置10至12个碎片。
- 吸除每个碎片周围的过量PBS，注意不要吸走碎片本身。
- 将培养皿盖部分打开，使皮肤碎片在空气中干燥5–20分钟。注意不要使碎片过度干燥。
- 碎片干燥后，将培养皿倾斜45度，缓慢从角落加入12 mL成纤维细胞培养基。然后将培养皿放平，小心使培养基均匀分布，避免碎片被冲起。 ....
- 将10 mL成纤维细胞培养基（表1）分装至15 mL锥形管中。皮肤活检组织应置于该培养基中并以此方式运输。活检样本可在4 °C下保存，直至处理，最好在同一天内处理。
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结果
本方案展示了如何建立人皮肤来源的成纤维细胞培养物，并将其转化为成肌细胞，进而分化为肌管细胞。此类细胞系对于神经肌肉疾病的研究极为有用， 体外 潜在疗法的测试
成纤维细胞转化过程的示意图见图1。图2A显示了一段皮肤组织及其迁移出的成纤维细胞。当成纤维细胞达到汇合状态时，应将其传代至新的培养皿中（图2B）。在更换为含多西环素的成肌细胞生长培养基之前，成纤维细胞的理想汇合度如图3A所示。细胞汇合度应约为70%，因为在转化过程中细胞仍会继续增殖。若细胞汇合度超过80%，则可能影响分化效果。成纤维细胞向成肌细胞的转化过程需要两到四天，可通过细胞形态学观察来确认。转化后的细胞会变得细长并呈平行排列，如图3B所示。加入分化培养基后，成肌细胞停止分裂，并开始融合形成多核的肌管（
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讨论
为了获得高质量的FM细胞系，某些步骤至关重要。皮肤活检样本的处理越及时，获得健康成纤维细胞的可能性就越大。成纤维细胞培养的传代次数也很重要。原代细胞的增殖能力有限，经过多次传代后会进入复制性衰老状态。因此，最好储备低传代次数的成纤维细胞，并尽可能在最早传代阶段进行细胞转化。
另一个重要步骤是获得具有最高纯度和准确定量的病毒制备物。例如，使用qPCR进行病毒基因组定量可提供合理的测量结果，但采用ddPCR（数字滴定PCR）定量更为准确。
此外，成纤维细胞达到适当的汇合度对于成肌细胞转化至关重要。如果细胞汇合度低于70%或高于80%，成肌分化可能会受到影响。若细胞过于密集，肌管将出现多层叠加，干扰染色与成像。多西环素的浓度对于Myod基因的正确激活和持续表达极为关键。每次更换培养基时，必须立即加入多西环素，因其在培养基中稀释后于4 °C保存会迅速降解。多西环素储存液应以1000倍浓度保存于-20 °C，并避免光照。解冻后的分装样品不得再次冷冻。严格遵循这些操作细节，对于确保实验的可重复性、并区分因基因突变导致的分.......
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披露
Nationwide Children's Hospital 已将本文所述的外显子2跳跃项目授权给 Audentes Therapeutics。K.M.F. 和 N.W. 因此项授权获得了特许权使用费。
致谢
我们感谢 Vincent Mouly 博士此前在该模型方面分享的知识。本研究得到了美国国立卫生研究院神经疾病和中风研究所（R01 NS043264（K.M.F. 和 R.B.W.））以及美国国立卫生研究院关节炎与肌肉骨骼和皮肤病研究所（NIAMS）（P50 AR070604-01（K.M.F.、K.M.、R.N. 和 N.W.））的资助。N.W. 获得了俄亥俄州立大学/全美儿童医院肌肉研究组和 Philippe 基金会的博士后资助。本研究还得到了机构内部自主资金的支持，其中部分外显子2跳跃研究工作也获得了 CureDuchenne（K.M.F.）和法国肌病协会的资助。IRB 编号：IRB #: IRB10-00358/ CR00005138 和 IBCSC#: IBS00000123。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 100 mm 培养皿 | Corning | 430167 | |
| 0.25% 胰蛋白酶-EDTA，含酚红 | Thermo Fisher | 2500056 | |
| 10X 磷酸盐缓冲液 (PBS) | Fisher Scientific | BP3994 | |
| 12 孔板 | Corning | 3513 | |
| 20X 转膜缓冲液 | Thermo Fisher | NP00061 | |
| 20X Tris-乙酸 SDS 电泳缓冲液 | Thermo Fisher | LA0041 | |
| 3-8% Tris-乙酸凝胶 | Thermo Fisher | EA0378BOX | |
| 75 cm² 培养瓶 | Corning | 430641U | |
| 抗生素-抗真菌素 100X | Thermo Fisher | 15240062 | |
| 抗肌球蛋白重链（肌节）抗体 | Developmental Studies Hybridome Bank | MF20 上清液 | 稀释比例 1:50 |
| 抗氧化剂 | Thermo Fisher | NP0005 | |
| BCA 蛋白定量试剂盒 | Thermo Fisher | 23227 | |
| 氯仿 | Sigma-Aldrich | C2432 | |
| DAPI | Thermo Fisher | D3571 | 稀释比例 1:1000 |
| 皂苷 | Millipore Sigma | 300410250MG | |
| 二甲基亚砜 | Sigma-Aldrich | D2438 | |
| DMEM，高糖，含 GlutaMAX 添加剂和丙酮酸钠 | Thermo Fisher | 10569044 | |
| DNase I 试剂盒 (250U) | Zymo Research Corporation | E1010 | |
| 盐酸多西环素 | Fisher Scientific | BP2653-5 | |
| Dup2 人源引物 | Fw_5' GCTGCTGAAGTTTGTTGG TTTCTC 3' | Rv_5' CTTTTGGCAGTTTTTGCC CTGT 3' | |
| 抗肌营养不良蛋白抗体 | Abcam | ab15277 | 稀释比例 1:200 |
| 胎牛血清 | Thermo Fisher | 16000 | |
| 甘氨酸 | Sigma-Aldrich | G8898 | |
| 山羊抗小鼠 Alexa Fluor 488 标记二抗 | Thermo Fisher | A11001 | 稀释比例 1:1000 |
| Halt 蛋白酶抑制剂混合液 100X | Thermo Fisher | 78430 | |
| 血细胞计数板 | Hausser Scientific | 3100 | |
| 潮霉素 B | Thermo Fisher | 10687010 | |
| IRDye 680RD 山羊抗兔 IgG (H+L) | Li-Cor | 926-68071 | 稀释比例 1:5000 |
| Lab-Tek II CC2 培养腔室载玻片系统 | Thermo Fisher | 15852 | |
| Laemmli | Bioworld | 105700201 | |
| Lipofectamine 3000 转染试剂 | Thermo Fisher | L3000008 | |
| Matrigel GFR 基底膜基质 | Corning | 354230 | |
| 甲醇 | Fisher Scientific | A412P-4 | |
| Mr. Frosty 冷冻容器 | Thermo Fisher | 51000001 | |
| 硝酸纤维素膜 0.45 µm | GE Healthcare Life Sciences | 10600002 | |
| 正常山羊血清对照 | Thermo Fisher | 10000C | |
| Odyssey 封闭缓冲液 (PBS) | Li-Cor | 927-40003 | Western 印迹封闭缓冲液 |
| Opti-MEM I 低血清培养基 | Thermo Fisher | 11058021 | |
| 多聚甲醛 | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PCR 预混液 | Thermo Fisher | K0172 | |
| 磷酸酶抑制剂 | Thermo Fisher | A32957 | |
| Precision Plus Protein 双色蛋白标准品 | Bio Rad | 1610374 | |
| 嘌呤霉素 | Thermo Fisher | A1113803 | |
| Revert 700 总蛋白染色试剂（用于 Western 印迹归一化） | Li-Cor | 926-11021 | |
| RevertAid 逆转录试剂盒 | Thermo Fisher | K1691 | |
| RNA Clean & Concentrator-25 | Zymo Research Corporation | R1018 | |
| 手术刀片 | Aspen Surgical | 372611 | |
| 骨骼肌细胞分化培养基 | Promocell | C23061 | |
| 骨骼肌细胞生长培养基 | Promocell | C23060 | |
| Triton X-100 | Acros Organics | 215682500 | |
| TRIzol 试剂 | Thermo Fisher | 15596026 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337500 | |
| 超低温冰箱 | Thermo Scientific | 7402 | |
| UltraPure 0.5M EDTA，pH 8.0 | Thermo Fisher | 15575020 | |
| Vectashield 抗荧光淬灭封片剂 | Vector Labs | H1000 |
参考文献
- Bigot, A., et al. Replicative aging down-regulates the myogenic regulatory factors in human myoblasts. Biology of the Cell. 100 (3), 189-199 (2008).
- Mamchaoui, K., et al. Immortalized pathological....
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