本文介绍了Grafix（梯度固定）技术的应用，该技术是在交联剂存在下进行甘油梯度离心，用于鉴定剪接体复合物上短暂结合的剪接因子之间的相互作用。
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方法文章
利用Grafix技术检测瞬时相互作用蛋白 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） 剪接体亚复合物
本文内容
摘要
摘要
前体mRNA剪接是一个高度动态的过程，在剪接体亚复合物的组装、RNA加工以及复合物组分释放过程中涉及多种分子重排。甘油梯度离心法已被用于分离蛋白质或核糖核蛋白（RiboNucleoProtein, RNP）复合物，以进行功能与结构研究。本文中，我们描述了Grafix（梯度固定法）的应用，该方法最初开发用于纯化并稳定大分子复合物，以便进行单颗粒冷冻电子显微镜分析，可用于鉴定剪接因子与剪接体复合物之间短暂的相互作用。该方法基于将样品在固定剂浓度逐渐增加的条件下进行离心，从而稳定复合物。将酵母总提取物加样至甘油梯度后进行离心，回收的各组分通过点印迹（dot blot）分析，以鉴定剪接体亚复合物，并确定各个剪接因子的存在情况。
引言
剪接是一个高度动态的过程，需要多种因子以协调的方式结合并释放。这些剪接因子包括RNA结合蛋白、ATP酶、解旋酶、蛋白激酶和磷酸酶、泛素连接酶等1,2,3；为了实现分子重排，其中一些因子仅短暂地结合到剪接体亚复合物上，这使得这些RNP中间复合物的分离与鉴定极具挑战性。
本文中，我们采用Grafix方法4,5，以稳定酵母剪接因子Cwc24与Bact复合物之间的相互作用6，从而鉴定同时结合该亚复合物的其他因子，并确定泛素连接酶Prp19是否在剪接激活及第一次转酯反应发生之前，参与Cwc24与Nineteen（NTC）复合物以及内含子5’端的结合或释放过程。在甘油梯度中沿浓度梯度逐步增加交联剂浓度的优势在于，可避免不同复合物之间的交联4,5，从而防止聚集体的形成。
该方法被用作蛋白质共免疫沉淀和拉下实验的补充，后者尽管能够分离较大的复合物，但在维持大型动态复合物中的瞬时相互作用方面可能并不可靠7,8。在甘油梯度中使用固定试剂可稳定这些因子的结合，从而确认特定蛋白质与剪接亚复合物之间的相互作用。由于所选用的交联剂在化学上是不可逆的，因此在梯度离心后，通过点印迹法对回收组分中的蛋白质进行分析。
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方案
1. 酵母总提取物的制备
- 培养表达与TAP标签融合的剪接因子之一的酵母细胞9 在1 L YNB-葡萄糖培养基（酵母氮源基础培养基添加2% m/v葡萄糖）中，加入适当的氨基酸或核苷酸碱基，本实验中为腺嘌呤（20 µg/mL）、亮氨酸（30 µg/mL）、色氨酸（30 µg/mL），培养至OD600 = 1.0.
- 通过在三个500 mL离心瓶中以17,000 x g离心，收集1 L培养液中的细胞 g 4 °C下离心10分钟，用10 mL冷的无菌水洗涤两次。
- 将收集的酵母细胞重悬于相当于细胞体积1/10的预冷缓冲液A（10 mmol L⁻¹ Tris-HCl，pH 7.4，含1 mmol L⁻¹ EDTA）中。-1 HEPES pH = 7.9, 1.5 mmol L-1 MgCl₂2，50 mmol L-1 KCl，5% v/v 甘油，0.5 mmol L-1 DTT，无EDTA蛋白酶抑制剂混合物
- 将细胞悬液用移液器吸取后，直接滴加50 µL至液氮中，形成小液滴并迅速冷冻。
警告：液氮接触皮肤或眼睛可造成损伤。操作时应使用适当的防护设备。
注意：此处可暂停实验流程。细胞悬液的冷冻液滴可保存于 -80 °C。 - 使用球磨仪通过六个循环以20 Hz/s频率研磨3分钟制备酵母细胞裂解液。
注意：每个循环后，将装有冷冻细胞的容器浸入液氮中，以防止融化。此步骤可暂停。冷冻提取物可在 -80 °C 下保存。也可使用匀浆器裂解原生质体来制备酵母剪接提取物。10，或使用研钵和研杵11,12. - 将装有提取物的试管置于室温水中，偶尔摇动，使其融化。
- 在 45,000 x g 条件下离心提取物 g 4 °C下孵育1小时。
- 采用BCA法测定澄清上清液中的蛋白质含量13.
- 制备提取物的等分试样，用液氮速冻后于 -80 °C 保存。
注意：此处可暂停本实验方案。
2. 甘油梯度制备
- 在缓冲液A中配制两种甘油溶液，一种含10% v/v甘油，另一种含30% v/v甘油。
- 向30% v/v甘油溶液中加入交联剂戊二醛，使其终浓度为0.1% v/v，混匀至均匀。
注意：操作戊二醛时应在通风橱内进行，并使用适当的个人防护装备。 - 在12 mL离心管（14 x 89 mm）底部加入6 mL预冷的10% v/v甘油溶液。
- 使用连接长针头的注射器（针头为Gradient Master装置配套提供），将6 mL预冷的含戊二醛的30% v/v甘油溶液加至离心管底部，紧接在10% v/v甘油溶液下方。
备注：也可将10% v/v甘油溶液小心地铺加在30% v/v甘油/戊二醛溶液的上层。 - 使用Gradient Master装置生成连续密度梯度。
备注：在Gradient Master装置中，将离心管放入合适的支架中，按照制造商推荐的参数（时间/角度/转速）进行短暂旋转。本实验中使用的参数为：2分25秒/81.5°/11 rpm。 - 在加入细胞提取物前，小心地在梯度上层加入200 μL的7% v/v甘油/缓冲液A缓冲层。
备注：缓冲层的甘油浓度必须低于用于构建线性梯度的最低甘油溶液浓度。
3. 提取物离心
- 在每个含垫层的12 mL线性10%–30%甘油梯度戊二醛离心管顶部上样约2 mg总蛋白。
- 将离心管放入预冷的摆桶转子中。
注意：在超速离心前应轻柔操作离心管，避免梯度混合。 - 在4 °C条件下，以194,000 × g 离心16小时。
- 使用改良的EconoSystem或小心移液，将每根12 mL离心管中的样品分装为24个500 μL的组分。
注意：改良的EconoSystem由蠕动泵、紫外检测器和连接穿孔装置的组分收集器组成。可通过检测280 nm处的吸光度监测沉降谱型。 - 通过蠕动泵使用40%（v/v）甘油溶液，将10%–30%甘油梯度从离心管推入组分收集器中。
注意：此步骤可暂停。将各组分储存于-80 °C，直至使用。 - 将每组分50 μL直接上样至点印迹或槽印迹装置中的硝酸纤维素膜上。使用CBP抗体（1:6,000，用于检测TAP标签中的CBP部分）进行免疫印迹检测，并以辣根过氧化物酶标记的抗兔IgG抗体（1:15,000）作为二抗。
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结果
为了分析Cwc24-TAP的沉降特征，并确定Grafix方法是否能有效稳定其与剪接亚复合物的结合，我们对表达Cwc24-TAP的酵母细胞总提取物进行了甘油梯度离心分离，分离过程中分别在有或无戊二醛（作为交联剂）的条件下进行。随后，通过槽印迹法检测24个500 μL的组分样品，并使用针对TAP标签中CBP区域的抗体进行检测。结果显示，在无交联剂存在时，Cwc24主要集中于第5至第13组分（图1B），对应分子量约为80至200 MDa14的复合物。然而，在存在交联剂的情况下，Cwc24在梯度中的位置向梯度底部的组分偏移，对应更大分子量的复合物（图1）。这些结果表明，戊二醛能够稳定Cwc24与剪接复合物的结合。
为了确定保留 Cwc24 的复合物是否对应于由 snRNP U2、U5、U6 和 NTC 复合物组成的 Bact 复合物，我们将 Cwc24 的沉降行为与 U5 snRNP 亚基 Prp8 和 NTC 亚基 Prp...
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讨论
可使用交联剂来稳定蛋白质-蛋白质以及核糖核酸-蛋白质之间的相互作用。重要的是，所形成的复合物必须足够稳定，以耐受在甘油梯度中的超速离心。此外，缓冲条件应允许相互作用的发生，同时具有足够的严谨性以避免非特异性结合。在本实验中，我们采用了先前已建立的适用于体外剪接反应的缓冲液体系15。
离心速度和时间应根据所分析的复合物进行优化。我们测试了不同的沉降条件，在4 °C下以94,000 × g 和194,000 × g 离心16小时，结果相似。这些对照实验对于确定所分析复合物不发生沉淀的条件至关重要。
我们还测试了不同的印迹方法，包括直接将样品滴加到膜上、使用狭缝印迹或点印迹系统，结果表明点印迹具有更高的可重复性。
使用戊二醛作为交联剂的一个主要局限性在于其交联反应不可逆。因此，蛋白质在SDS-PAGE后无法通过免疫印迹进行分析，只能通过天然凝胶电泳或点印迹法检测。然而，可逆的交联剂（如甲醛）也具...
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披露
作者不存在利益冲突。
致谢
本工作由圣保罗研究基金会（FAPESP）资助（项目编号：15/06477-9）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 抗钙调蛋白结合蛋白表位抗体 | Millipore | 07-482 | |
| 兔IgG ECL检测抗体 | GE Healthcare | NA934 | |
| EconoSystem | Bio-Rad | 1-800-424-6723 | 所使用的EconoSystem组件：蠕动泵、紫外检测器和组分收集器 |
| 无EDTA蛋白酶抑制剂混合物 | Roche | 11873580001 | |
| 组分回收系统 | Beckman Coulter | 270-331580 | 与EconoSystem组件连接的穿孔装置，用于收集离心管中的组分 |
| 梯度制备仪 Model 107ip | Biocomp | 107-201M | |
| 混合研磨仪 MM 200 | Retsch | 207460001 | 球磨仪设备 |
| 转子 F12-6x500Lex | Thermo Scientific | 096-062375 | |
| Sorvall RC 6 Plus 离心机 | Thermo Scientific | 36-101-0816 | |
| 摆桶式转子 P40ST | Hitachi | ||
| 超速离心机 CP 80 NX | Hitachi | 901069 | |
| 超透明离心管（14 × 89 mm） | Beckman Coulter | 344059 |
参考文献
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- Kastner, B., et al. GraFix: sample preparation for single-particle electron cryomicroscopy. Nature Methods. 5 (1), 53-55 (2008).
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重印与许可
