小鼠孤雌单倍体胚胎干细胞作为精子替代物的应用

摘要

本文旨在展示利用孤雌生殖单倍体胚胎干细胞作为精子替代物，用于构建半克隆胚胎的方法。

摘要

在具有有性生殖的生物中，生殖细胞是发育成新个体的全能细胞的来源。在小鼠中，精子与卵母细胞受精形成全能性的合子。最近，多项研究报道单倍体胚胎干细胞（haESCs）可替代配子基因组并参与胚胎发育，最终产生小鼠。本文介绍了一种利用孤雌生殖来源的haESCs作为精子替代物，通过胞质内注射到卵母细胞中构建胚胎的实验方案。该方案包括将haESCs制备为精子替代物、将haESC染色体注射入卵母细胞以及半克隆胚胎的培养等步骤。这些胚胎经胚胎移植后可产下具有生育能力的半克隆小鼠。使用haESCs作为精子替代物有助于生殖系基因组编辑、胚胎发育研究以及基因组印记机制的探究。

引言

在哺乳动物中，配子是唯一能够将遗传信息传递给下一代的细胞。卵母细胞与精子融合形成二倍体受精卵，进而发育为成体动物。因此，配子基因组中的突变可遗传给后代，并推动物种的遗传变异¹。生殖系突变的引入已被用于制备转基因动物，以开展多种生物学研究，包括基因功能表征和疾病模型构建。卵母细胞和精子均为终末分化且高度特化的细胞，已停止增殖。因此，直接对配子进行遗传操作在技术上具有挑战性，需采用专门的方法。可通过将遗传修饰的小鼠胚胎干细胞（ESCs）注射入囊胚，使其整合至发育中的胚胎并定植于生殖系，从而实现对小鼠生殖系的遗传改造。此外，利用基因组编辑技术（包括CRISPR/Cas9系统）对受精卵进行遗传修饰的方法也已得到广泛应用²。

最近，一项杰出的方法被报道，该方法将孤雌或孤雄单倍体胚胎干细胞（haESCs）作为配子基因组的替代物^3,4,5,6,7,8。haESCs 是从孤雌或孤雄来源的单倍体囊胚的内细胞团中建立的干细胞系，具有一套完整的单倍染色体组^4,7,9,10。研究表明，将孤雌或孤雄来源的 haESCs 通过胞质内注射导入卵母细胞后，均可参与半克隆小鼠的基因组构建。与其他方法不同，由于 haESCs 具备自我更新能力，其基因组可在体外培养过程中直接进行遗传修饰。通过以 haESCs 替代精子将遗传修饰引入生殖系，是生物学研究中一种重要的手段。该方法使得分别来源于孤雌或孤雄 haESCs 的母源或父源基因组能够被独立地培养和操作。随后，haESCs 可作为配子基因组的替代物，这一策略在基因组印记、等位基因特异性表达以及亲本特异性生物学过程的研究中具有显著优势。

在小鼠中，正常胚胎发育需要母源和父源的基因组信息¹¹。因此，当将野生型孤雌激活的单倍体胚胎干细胞（phaESCs）注射入卵母细胞以替代精子基因组时，无法获得足月出生的仔鼠^5,8。为了克服这一发育阻滞，需要将孤雌激活的单倍体胚胎干细胞中母源基因组的基因组印记校正为父源构型。这可以通过对差异甲基化区域（DMRs）进行操作来实现。迄今为止，已有研究通过靶向敲除H19-DMR、Gtl2-Dlk1 IG-DMR 和 Rasgrf1-DMR，以抑制 phaESCs 中母源表达的基因^3,5,8,12。这些研究表明，同时敲除H19-DMR 和 IG-DMR 足以将母源印记转变为可替代精子染色体的父源印记构型。将携带这两个 DMR 缺失的 phaESCs 通过胞质内注射注入卵母细胞后，可获得半克隆仔鼠，其出生率占移植的2细胞胚胎的5.1%至15.5%。

本方案基于应用同时缺失H19-DMR和IG-DMR的孤雄单倍体胚胎干细胞（phaESCs），我们将此类细胞称为双敲除孤雄单倍体胚胎干细胞（DKO-phaESCs）。我们提供了详细的实验步骤，包括在phaESCs中对基因组印记进行修饰以建立DKO-phaESC细胞系，将DKO-phaESCs注入卵母细胞以替代精子基因组，培养半克隆胚胎至囊胚阶段，以及获得半克隆小鼠。本方案可为需要精确直接操控父源基因组并生成半克隆胚胎和半克隆小鼠的研究人员提供参考。

方案

所有动物实验均在许可证 ZH152/17 下进行，遵循苏黎世州伦理委员会和苏黎世联邦理工学院分子健康科学研究所 EPIC 动物设施的标准与规定。

注意：本实验方案从在 phaESC 中删除 H19 和 IG-DMR 开始。有关建立 phaESC 细胞系的详细信息，请参阅已发表的文献^10,13。本方案（步骤 1–14）的总体流程和时间安排见图 1A；培养基、溶液和缓冲液列于表 1。建立 DKO-phaESC 细胞系的流程（步骤 1–6）见图 1B，构建半克隆胚胎的策略（步骤 7–14）见图 1C。

1. 在 phaESCs 中转染质粒以删除 H19-DMR 和 IG-DMR

1. 制备用于共表达 Cas9 核酸酶和引导 RNA 以靶向删除 H19-DMR 和 IG-DMR 的 CRISPR/Cas9 质粒。将四对引导 RNA 寡核苷酸（H19-DMR-gRNA1-F, R；H19-DMR-gRNA2-F, R；IG-DMR-gRNA1-F, R；IG-DMR-gRNA2-F, R，见表 2）连接至 pX330 质粒中。
   注意：有关这四种 CRISPR/Cas9 质粒制备的详细步骤，请参考已发表的实验方案¹⁴。此外，适用于通用小鼠品系的质粒也可通过资源库获取（材料表）。
2. 在 37 °C 条件下孵育 10 分钟，用 1 mL 0.2% 明胶溶液包被 6 孔板的一个孔的表面。
3. 将 2 × 10⁵ 个野生型 phaESC 接种于明胶包被的孔中，使用不含抗生素的 haESC 培养基，并在 37 °C、5% CO₂ 条件下培养 1 天。
   注意：培养基中省略抗生素以提高后续脂质体转染的效率。本实验使用第 10 代的野生型 phaESC。建议使用早期代次的 phaESC，但已有成功使用不同代次的报道⁸。目前尚不清楚代次与获得半克隆胚胎及小鼠效率之间的相关性。
4. 使用脂质体转染试剂，同时将 6 种质粒共转染至 6 孔板的一个孔中的 phaESC（来自步骤 1.3）：50 ng 携带 CAG-EGFP 转基因的 piggyBac 质粒、50 ng piggyBac 转座酶质粒，以及来自步骤 1.1 的 4 种 CRISPR/Cas9 质粒各 600 ng。转染的具体操作请参考试剂生产商提供的说明书。
   注意：使用两种 piggyBac 质粒将一个转座子整合到 phaESC 基因组中，以实现增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的泛表达。如果不需要 GFP 标记细胞，可将这两种质粒中的一个替换为用于瞬时表达荧光蛋白的 CRISPR/Cas9 质粒（例如 pX458 质粒），以替代其中一个 pX330 质粒。随后可通过瞬时 EGFP 表达对转染细胞进行分选。
5. 转染两天后，吸除培养基，并加入 800 µL 胰蛋白酶溶液。
6. 在 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育 5 分钟，然后加入 2 mL 洗涤缓冲液以终止胰蛋白酶反应，并反复吹打数次以获得单细胞悬液。
7. 将细胞悬液转移至 15 mL 离心管中。
8. 以 160 x g 离心 5 分钟，弃去上清液。
9. 用 400 µL haESC 维持缓冲液重悬细胞沉淀，并添加 15 µg/mL Hoechst 33342。
   注意：为降低 Hoechst 33342 的潜在毒性，可改用 1 µg/mL Hoechst 33342 和 50 µM 维拉帕米，替代 15 µg/mL Hoechst 33342¹⁵。
10. 在 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育细胞悬液 15 分钟。孵育结束后，将细胞悬液通过带细胞筛网帽的 5 mL 管过滤，并将管置于 4 °C 保存，待下一步（第 2 节）使用。

2. 使用流式细胞仪对转染的phaESC进行单细胞铺板

1. 在分选转染的phaESCs前一天，将经照射的小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）以4 × 10⁵细胞/毫升的密度接种于明胶包被的96孔板中⁴ 细胞/厘米²² 在MEF培养基中。通常准备6个培养板以建立具有靶向缺失的phaESC细胞系。将培养板置于37 °C、5% CO₂的培养箱中孵育。₂ 大气
   注意：经辐照的MEF可从商业途径获得。我们使用来自DR4小鼠E12.5胚胎的MEF。尽管人孤雌激活胚胎干细胞（haESC）可在明胶包被的培养板上无需MEF生长，但我们建议使用MEF以提高分选后单个haESC的存活率。
2. 分选当天，吸出96孔板中的MEF培养基，每孔加入120 µL新鲜的haESC培养基 良好。将培养板置于37 °C、5% CO₂条件下培养。₂ 大气
3. 根据制造商的说明，设置配备100 µm喷嘴的细胞分选仪。使用355 nm紫外激光和488 nm蓝色激光分别激发Hoechst 33342和EGFP荧光。
   注意：也可使用405 nm激发检测Hoechst 33342。
4. 使用步骤1.10中获得的5 mL离心管，根据EGFP表达情况设门，分选处于G1/S期的单倍体细胞，并将单个细胞分选至步骤2.2中的96孔板各孔中。
   注意：Hoechst 33342 染色检测通常可区分出三个细胞峰，其DNA含量分别为1n、2n和4n，分别对应处于G1期的单倍体细胞、处于G2/M期的单倍体细胞与处于G1期的二倍体细胞的混合群体，以及处于G2/M期的二倍体细胞。处于G1/S期的单倍体细胞表现为Hoechst 33342荧光强度较低的峰。代表性结果及分选门控如图所示 图2A.
5. 铺板后，将96孔板置于37 °C、5% CO₂培养箱中孵育。₂ 大气

3. 转染的 phaESC 亚克隆

1. 单细胞铺板后第三天，可在显微镜下观察到96孔板多个孔中出现克隆。标记仅生长单个克隆的孔。
   注意：根据我们的经验，单个克隆可在96孔板20%–40%的孔中观察到。
2. 单细胞铺板后第4天，将含有单个克隆的孔中的培养基更换为一半新鲜的人胚胎干细胞（haESC）培养基。
3. 传代前一天（单细胞铺板后第4或第5天），在明胶包被的96孔板中以4 × 10⁴ cells/cm²的密度接种经照射的MEF细胞，并加入MEF培养基。将培养板置于37 °C、5% CO₂的培养箱中孵育。
4. 单细胞铺板后第5或第6天，选择96孔板中直径大于150 µm的单个克隆所在的孔。
   注意：为建立具有目标DMR缺失的phESC细胞系，建议优选约100个孔。
5. 吸除所选孔中的培养基，每孔加入30 µL胰酶。将96孔板置于37 °C、5% CO₂的培养箱中孵育5分钟。随后每孔加入30 µL洗涤缓冲液以终止胰酶消化。
6. 每孔加入140 µL haESC培养基，并反复吹打数次以获得单细胞悬液。
7. 吸除第3.3步中准备的96孔板各孔中的MEF培养基。
8. 将第3.6步中每个孔的phESC细胞转移至第3.7步中新准备的96孔板的对应新孔中。
9. 将含有phESC亚克隆的96孔板置于37 °C、5% CO₂的培养箱中孵育。
10. 次日，吸除各孔中的全部培养基，每孔加入120 µL新鲜haESC培养基。将培养板置于37 °C、5% CO₂的培养箱中继续孵育。
11. 在细胞达到传代密度的前一天，于明胶包被的24孔板中以4 × 10⁴ cells/cm²的密度接种经照射的MEF细胞，并加入MEF培养基。将培养板置于37 °C、5% CO₂的培养箱中孵育。
12. 当phESC细胞生长至适合传代的汇合度时，吸除培养基并每孔加入30 µL胰酶。将96孔板在37 °C下孵育5分钟。
13. 每孔加入90 µL洗涤缓冲液以终止胰酶反应，并反复吹打数次以获得单细胞悬液。
14. 吸除第3.11步中24孔板各孔的MEF培养基，并每孔加入600 µL新鲜haESC培养基。
15. 将第3.13步中每个孔的phESC亚克隆悬液转移60 µL至第3.14步的24孔板新孔中。剩余的phESC亚克隆悬液保留用于第4步的DNA提取和基因型鉴定。
16. 将含有phESC亚克隆的24孔板置于37 °C、5% CO₂的培养箱中孵育。
17. 在细胞培养物达到传代密度的前一天，于明胶包被的6孔板中以4 × 10⁴ cells/cm²的密度接种经照射的MEF细胞，并加入MEF培养基。将培养板置于37 °C、5% CO₂的培养箱中孵育。
18. 当phESC细胞生长至适合传代的汇合度时，吸除培养基并每孔加入250 µL胰酶。将24孔板在37 °C下孵育5分钟。
    注意：在第4.9步完成基因型鉴定后，仅需对同时缺失H19-DMR和IG-DMR的phESC细胞系进行传代。
19. 每孔加入750 µL洗涤缓冲液以终止胰酶反应，反复吹打数次以获得单细胞悬液，并将细胞悬液转移至15 mL离心管中。
20. 以160 x g离心5分钟，弃上清，将细胞沉淀重悬于2 mL haESC培养基中。
21. 吸除第3.17步中6孔板各孔的MEF培养基，将第3.20步中每根离心管的phESC细胞悬液转移至新的孔中。将培养板置于37 °C、5% CO₂的培养箱中孵育。
22. 通过重复第3.17至3.21步操作，并逐步增大培养板规格以及胰酶、洗涤缓冲液和haESC培养基的体积，扩增细胞克隆。为第5步准备每个亚克隆phESC细胞系的T25培养瓶。
    注意：建议在进入第5步前，将每个亚克隆的phESC细胞系取一份300 µL加入冻存液中，冻存于液氮中作为储备。

4. 带有MEFs的亚克隆phaESC细胞系的首次基因分型

1. 为了从步骤3.15中剩余的细胞悬液中提取基因组DNA，向96孔板的每个孔中加入200 µL裂解缓冲液。将细胞悬液转移至1.5 mL离心管中。用额外的200 µL裂解缓冲液冲洗每个孔，以回收所有残留的细胞，并收集至同一1.5 mL离心管中。
2. 将1.5 mL离心管在55 °C孵育3小时，并进行混匀。
3. 孵育结束后，向每个1.5 mL离心管中加入460 µL异丙醇，轻轻混匀，直至可见DNA沉淀析出。
4. 在≥ 10,000 x g条件下离心5分钟，弃去上清液。用200 µL 70%乙醇洗涤DNA沉淀。
5. 在≥ 10,000 x g条件下再次离心5分钟，弃去上清液。
6. 将离心管在空气中干燥10分钟，然后将DNA重悬于20 µL水中。
7. 使用耐热DNA聚合酶进行聚合酶链式反应（PCR），操作遵循制造商的说明书。
   注：PCR所用引物对列于表2，具体如下：H19-DMR-P1和P3（407 bp，用于缺失型H19-DMR）；H19-DMR-P2和P3（623 bp，用于野生型H19-DMR）；IG-DMR-P1和P3（319 bp，用于缺失型IG-DMR）；IG-DMR-P2和P3（492 bp，用于野生型IG-DMR）。所有引物对的PCR扩增程序如下：98 °C 30秒，35个循环（98 °C 10秒，56 °C 20秒，72 °C 30秒），72 °C延伸5分钟。H19-DMR和IG-DMR缺失所扩增出的DNA片段长度存在一定变异，这是由于CRISPR/Cas9介导的编辑过程中伴随非同源末端连接所致。PhaESCs在含有野生型H19-DMR和IG-DMR DNA的小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）上培养，因此用于扩增野生型DNA片段的引物对H19-DMR-P2/P3和IG-DMR-P2/P3无诊断意义。然而，这些引物对作为对照被包含在实验中，应在所有反应中均产生条带。
8. 通过琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物。有关电泳操作的详细步骤，请参考已发表的实验方案¹⁶。
9. 鉴定同时缺失H19-DMR和IG-DMR的细胞系。电泳结果的代表性图像见图2B。
   注：在本研究中，共筛选了135株亚克隆的phaESC细胞系，其中鉴定出8株同时缺失H19-DMR和IG-DMR的细胞系。

5. 亚克隆 phaESC 细胞系的单倍体细胞纯化

1. 当步骤 3.22 中 T25 培养瓶内的亚克隆 phaESC 培养物密度达到传代要求时，吸除培养基，加入 1.5 mL 胰蛋白酶。将培养瓶在 37 °C 下孵育 5 分钟，然后加入 4.5 mL 洗涤缓冲液，反复吹打数次以获得单细胞悬液。
2. 将每份细胞悬液转移至 15 mL 离心管中，在 160 × g 条件下离心 5 分钟。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于 400 µL 含 15 µg/mL Hoechst 33342 的 haESC 维持缓冲液中。
3. 将细胞悬液在 37 °C 下孵育 15 分钟。孵育结束后，通过带细胞筛网帽的 5 mL 离心管过滤细胞悬液。用额外的 400 µL haESC 维持缓冲液冲洗筛网帽，并将残留细胞收集至同一 5 mL 离心管中。将离心管置于 4 °C 保存，待分选时使用。
4. 根据制造商说明，使用 100 µm 喷嘴配置流式细胞仪。
   注：Hoechst 33342 可通过 405 nm 激发检测。此处使用 355 nm 紫外激光检测 Hoechst 33342。
5. 将细胞悬液（来自步骤 5.3）和另一含有 2 mL haESC 维持缓冲液的新 15 mL 离心管放入流式细胞仪，用于收集分选后的细胞。
6. 开始分析，并设置分选门以收集处于 G1/S 期的单倍体细胞。参考 图 2A 中的直方图来识别 G1/S 期 phaESC 群体。
   注：部分亚克隆 phaESC 细胞系可能因完全二倍体化或在步骤 2 中错误接种了二倍体细胞而不再含有单倍体细胞。若在 G1/S 期未观察到单倍体细胞，则无需分选，直接进入下一个样本。在本实验中，8 个亚克隆 phaESC 细胞系中有 5 个含有单倍体细胞，3 个仅含二倍体细胞。
7. 细胞分选完成后，沿 15 mL 收集管管壁加入 5 mL 洗涤缓冲液。在 160 × g 条件下离心 5 分钟，弃去上清液。
8. 根据分选后细胞数量选择合适尺寸的培养板。分别使用 96 孔板、24 孔板和 12 孔板中的单个孔培养 1,000–40,000 个、40,000–200,000 个和 200,000–400,000 个细胞，并分别将细胞沉淀重悬于 120 µL、600 µL 和 1.2 mL haESC 培养基中。
   注：应以高密度接种细胞，因为低汇合度可能导致分选后细胞死亡。从本步骤起，phaESC 将在明胶包被的培养孔中培养，不使用 MEF 饲养层，以便于后续步骤 6 的基因分型以及从步骤 9 开始的胞质内注射应用。
9. 将细胞悬液转移至适当大小的明胶包被孔中后，将培养板置于 37 °C、5% CO₂ 的培养箱中孵育。
10. 通过重复步骤 3.18 至 3.21，逐步扩大培养规模，同时增加培养板尺寸以及胰蛋白酶、洗涤缓冲液和 haESC 培养基的用量。细胞继续在明胶包被的培养孔中、无 MEF 饲养层的条件下培养。
11. 对每个亚克隆 phaESC 细胞系，分别准备一个 24 孔板中的培养孔用于步骤 6，以及一个 6 孔板中的培养孔用于步骤 9。
    注：在进入步骤 9 之前，应将每个亚克隆 phaESC 细胞系的部分细胞与 300 µL 冻存液混合，作为冻存株保存于液氮储存罐中。

6. 无饲养层细胞条件下对亚克隆 phaESC 系进行第二次基因分型

注意：进行第二轮基因分型以确认亚克隆的 phaESC 细胞系在去除 MEF 细胞后，H19 和 IG-DMR 均已发生缺失，且不存在野生型等位基因。

1. 在显微镜下确认第5.11步中24孔板各孔的培养物无小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）污染。
   注意：若观察到MEFs存在，则需继续传代培养，直至MEFs完全消失，以避免MEFs的野生型DNA污染PCR反应。
2. 吸除汇合培养物中的培养基，每孔24孔板加入400 µL裂解缓冲液。反复吹打数次后，将细胞悬液转移至1.5 mL离心管中。
3. 将1.5 mL离心管在55 °C孵育3小时，并进行混匀。
4. 孵育结束后，向1.5 mL离心管中加入400 µL异丙醇，轻轻混匀，直至可见DNA沉淀析出。
5. 在≥ 10,000 x g条件下离心5分钟，弃上清液。用200 µL 70%乙醇洗涤DNA沉淀。
6. 在≥ 10,000 x g条件下再次离心5分钟，弃去上清液。
7. 将离心管在空气中干燥10分钟，然后将DNA重悬于50 µL水中。
8. 按照第4.7步进行基因型PCR分析，并按第4.8步进行凝胶电泳，以鉴定同时缺失H19-和IG-DMR区域且不含野生型等位基因的细胞系。
   注意：典型的第二次基因型分析结果如图2B所示，供参考。在本实验中，经过单倍体细胞纯化（第5步）后筛选出的全部5个细胞系均不含野生型等位基因，仅含有H19-和IG-DMR的缺失等位基因。
9. 将经过第二次基因型筛选后获得的亚克隆phaESC细胞系用作DKO-phaESC细胞系。

7. 小鼠超数排卵

1. 为获得MII期卵母细胞，于卵母细胞采集前63–65小时，对每只B6D2F1雌性小鼠（4–5周龄）进行腹腔注射5 IU孕马血清促性腺激素（PMSG）溶液以诱导超数排卵。
   注意：本方案推荐使用B6D2F1品系小鼠，因为B6D2F1卵母细胞对胞质内注射耐受性良好，且操作后具有较高的发育潜能¹⁷。
2. 注射PMSG后48小时，对每只小鼠腹腔注射5 IU人绒毛膜促性腺激素溶液。

8. 卵母细胞采集

1. 准备一个4孔板，在其中一个孔中加入700 µL透明质酸酶培养基，其余3个孔各加入700 µL M2培养基。另外，准备一个6 cm培养皿，加入7 mL M2培养基，以及一个中心小室培养皿，加入900 µL M16培养基。将该培养板和培养皿置于37 °C、5% CO₂环境中预热。
2. 在胞质内注射当天上午约8点，通过颈椎脱臼或吸入CO₂的方法处死已超排的雌鼠（来自步骤7.2）。使用镊子和剪刀解剖取出输卵管，并将输卵管置于含M2培养基的6 cm培养皿中。
3. 用30 G针头撕开输卵管的壶腹部，释放卵丘-卵母细胞复合体（COCs）。将COCs转移至预热的透明质酸酶培养基中，并在37 °C、5% CO₂环境中孵育。
4. 2–3分钟后，用口控移液器收集去除卵丘细胞的卵母细胞，并将其依次转移至4孔板其余3个含有新鲜M2培养基的孔中，清洗3次。
5. 挑选具有第一极体的中期II（MII）卵母细胞，转移至含M16培养基的中心小室培养皿中，并将培养板置于37 °C、5% CO₂环境中保存，直至步骤12进行胞质内注射时使用。

9. DKO-phaESCs的处理与收集

1. 在进行胞质内注射前一天，于6孔板的一个孔中培养DKO-phaESC细胞，使其在无MEF饲养层条件下达到60–80%汇合度（从步骤5.11开始）。
2. 为诱导细胞周期停滞于M期，完全吸除培养基，并加入2 mL含有0.05 mg/mL脱秋水仙碱的haESC培养基。
3. 经脱秋水仙碱处理8小时后，吸除培养基，加入800 µL胰蛋白酶。
4. 将培养板置于37 °C、5% CO₂环境中孵育5分钟，随后加入2 mL洗涤缓冲液以终止胰蛋白酶反应，并反复吹打数次，获得单细胞悬液。
5. 将细胞悬液转移至15 mL离心管中，在160 x g条件下离心5分钟，弃去上清液。
6. 用含15 µg/mL Hoechst 33342的400 µL haESC维持缓冲液重悬细胞沉淀。
7. 将细胞悬液置于37 °C、5% CO₂环境中孵育15分钟。孵育结束后，通过带细胞滤网帽的5 mL离心管过滤细胞悬液，随后将离心管置于4 °C保存，直至步骤10进行细胞分选。

10. M期阻滞的DKO-phaESCs的纯化

1. 根据制造商的说明，使用100 µm喷嘴设置流式细胞仪。
   注意：Hoechst 33342可通过405 nm激发检测。此处使用355 nm紫外激光检测Hoechst 33342。
2. 准备步骤9.7中获得的M期阻滞的DKO-phaESCs，并开始分析。针对经秋水仙胺处理的样品，选择合适的分选门以收集单倍体M期细胞（2n）。
   注意：经秋水仙胺处理后，预期出现两个细胞群体，分别对应于单倍体和二倍体M期阻滞细胞，如图3B所示。秋水仙胺处理后的细胞周期阻滞是完全的，因此不会观察到单倍体1n DNA峰。这一点非常重要，因为单倍体M期细胞与二倍体G1期细胞具有相同的DNA含量（2n），会导致峰重叠。
3. 准备一个含有2 mL haESC维持缓冲液的15 mL离心管，用于在流式细胞仪中收集分选后的细胞。开始细胞分选。
4. 细胞分选完成后，沿收集管管壁加入5 mL洗涤缓冲液。在160 × g条件下离心5分钟，弃去上清液。
5. 用适量的haESC维持缓冲液重悬细胞，使最终细胞浓度为5 × 10⁵ 个细胞/mL。
6. 将细胞悬液转移至1.5 mL离心管中。在进行第12步胞质内注射前，将离心管置于冰上保存。

11. 固定电极和显微注射毛细管的制备

注意：进行胞质内注射（步骤12）时，需要若干固定用和显微注射用移液管（图4A）。这些移液管可根据定制需求向商业供应商购买，或使用显微移液管拉制仪和显微操作仪将合适的玻璃毛细管自行制备而成。

1. 使用拉针仪拉制硼硅酸盐玻璃毛细管。拉制无丝硼硅酸盐玻璃毛细管（0.78 × 1.00 × 80 mm）时，可采用以下参数进行火焰水平拉制 拉制仪（材料表）作为参考，但其他仪器和玻璃毛细管类型可能参数不同：持针电极的设置为加热 510（斜率测试 480）、拉力 0、速度 150、时间 175 和压力 200；显微注射电极的设置为加热 510（斜率测试 480）、拉力 90、速度 140、时间 125 和压力 200。
   注意：最佳参数需根据实际情况单独确定，因为湿度、微电极拉制仪的型号以及玻璃毛细管的批次等多种因素均可能影响注射针的形状。应力求获得具有平缓锥度的细长形状。
2. 持握电极的制备
   1. 将步骤11.1中制备好的拉制毛细管固定于显微操作仪上，将毛细管置于玻璃珠上方 在灯丝上并降低毛细管，使其与玻璃珠接触 在加热灯丝的同时。
   2. 关闭加热并从玻璃珠上取下，使毛细管断裂 使其外径为60–100 µm。
   3. 将毛细管尖端水平放置 面对 玻璃珠 开启 丝状结构。
   4. 将玻璃丝加热，使毛细管尖端内径熔化至10–20 µm。
   5. 移动毛细管，使玻璃珠 在距毛细管尖端约1 mm处定位，避免接触。加热丝材，使毛细管弯曲成20°角。将毛细管从显微操作仪上取下，此毛细管称为持卵管。
      注意：为了测量毛细管的尺寸，建议在显微操作仪中安装目镜测微尺。
3. 显微注射移液管的制备
   1. 将步骤11.1中制备好的拉制毛细管安装至显微操作仪上，将毛细管置于玻璃珠上方 在灯丝上并降低毛细管，使其与玻璃珠接触 加热灯丝时。
   2. 关闭加热并从玻璃珠上取下，使毛细管断裂 在其外径为6 µm的位置。
   3. 将毛细管移动，使玻璃珠位于距离毛细管尖端约1 mm处，但不接触。加热灯丝，使毛细管向上弯曲成20°角。从微加工仪上取下显微注射针，存放在安全盒中以备后续使用。
      注意：微注射移液管的制备规格如下：外径 6 µm；内径 4.5–5 µm；弯曲度 角度，20°。确定显微注射移液管的最佳设计对于胞质内注射的成功至关重要。内径过大可能导致供体 DKO-phESC 的质膜无法破裂（见讨论部分）；而内径过窄则可能阻碍供体 DKO-phESC 的顺畅吸取。一个弯曲 角度 < 30° 更适合作为较大的弯曲角度 角度会阻碍压电脉冲的效果。

12. DKO-phaESCs 的胞质内注射

1. 在进行胞质内注射前（从步骤12.2开始），通过将5 mL M2培养基加入含有0.6 g聚乙烯吡咯烷酮（PVP）的50 mL离心管中，并在4 °C条件下于摇床上震荡2天，制备PVP溶液。待PVP完全溶解后，将溶液经无菌滤膜过滤，并在4 °C下保存。
2. 在进行胞质内注射当天，准备一个中心井培养皿，加入900 µL KSOM培养基，并在37 °C、5% CO₂环境中预热培养皿。
3. 通过在倒置的10 cm培养皿盖上排列5 µL PVP溶液液滴和20 µL M2培养基液滴，制备显微操作培养皿。用矿物油覆盖液滴，并将培养皿置于注射显微镜的载物台上。
   注：推荐的显微操作培养皿排列方式见图4B。
4. 将固定吸管安装到显微操作仪上。使用微加载吸头将氟碳油注入显微注射吸管中，并将其安装至压电驱动装置上。
5. 将显微注射吸管浸入PVP溶液液滴中，反复上下吸取数次，使玻璃表面被PVP包被，从而降低粘附性。向显微注射吸管中吸入少量PVP溶液，然后将吸管移至M2培养基液滴中。
6. 将固定吸管浸入M2培养基中，并将焦点对准液滴底部的吸管末端。
7. 从步骤10.6中转移约2 µL DKO-phaESC悬液至M2培养基液滴中。
8. 使用口控移液器将来自步骤8.5的10个MII期卵母细胞转移至同一M2培养基液滴中。
9. 进行注射时，旋转M2培养基液滴中的卵母细胞，使透明带下方的卵周隙朝向显微注射吸管，且MII期纺锤体不在显微注射吸管的路径上（图4A）。通过固定吸管施加负压固定卵母细胞。
   注：MII期纺锤体在形态上表现为卵质的隆起，称为“隆包”（hump），通常位于第一极体附近。MII期板包含附着染色体的减数分裂纺锤体。应避免显微注射吸管接触MII期板，因为对纺锤体和染色体的机械损伤可能干扰胚胎发育。
10. 通过施加轻微负压，将一个DKO-phaESC吸入显微注射吸管尖端。通过反复吹打使DKO-phaESC的质膜破裂，以避免完整细胞的注射（图3C；参见讨论部分）。
    注：若吹打未能使DKO-phaESC的质膜破裂，则弃去该细胞，并重新加载另一个DKO-phaESC。
11. 将显微注射吸管接触卵母细胞的透明带，并在显微注射吸管内施加少量负压。
12. 施加压电脉冲（强度20，频率4），同时推动显微注射吸管尖端穿透透明带进入卵周隙。确认包含纺锤体和染色体的MII期板不在显微注射吸管的路径上。
    注：根据经验调整参数，使用最低有效压电脉冲穿透透明带，以最大程度减少对卵膜的损伤。
13. 从显微注射吸管中排出透明带碎片，并将DKO-phaESC定位在吸管尖端边缘。
14. 用显微注射吸管穿透卵母细胞，使卵膜延伸至细胞对侧。
    注：避免触碰MII期板，以防损伤纺锤体和染色体。
15. 施加一次压电脉冲（强度6，频率1）以刺穿卵膜。确保卵膜沿显微注射吸管杆部松弛展开。
    注：根据经验确定刺破卵膜所需的最低压电脉冲参数，以最小化对卵母细胞的损伤。
16. 将含有极少量培养基的DKO-phaESC注入卵质中，并平稳地将显微注射吸管从卵母细胞中撤出。
17. 释放已注射的卵母细胞，使其脱离固定吸管，并将其移至微滴边缘以便后续收集。
18. 对M2培养基液滴中的其余MII期卵母细胞重复步骤12.9至12.17的注射操作。
    注：避免将卵母细胞在培养箱外停留超过20分钟。根据我们的经验，经过适当训练后，一组10个卵母细胞的操作可在15分钟内顺利完成。
19. 将注射后的卵母细胞批次从M2培养基液滴转移至预热的含KSOM培养基的中心井培养皿中。
20. 将培养皿在37 °C、5% CO₂环境中孵育1小时。
21. 对额外的MII期卵母细胞组重复步骤12.5和12.20的操作，以获得足够数量的注射卵母细胞。

13. 重构半克隆胚胎的激活

1. 准备两个中心孔培养皿，每个加入900 µL KSOM培养基和激活培养基。准备一个4孔板，每孔加入700 µL KSOM培养基。将培养皿和培养板置于37 °C、5% CO₂环境中预热。
2. 在KSOM培养基中孵育1小时后，将第12.21步中注射后的卵母细胞转移至含有激活培养基的预热中心孔培养皿中。
3. 将培养皿置于37 °C、5% CO₂环境中孵育6小时以完成激活。
4. 激活后，可观察到部分半克隆胚胎形成三个极体，分别为卵母细胞的第一极体和第二极体，以及来自DKO-phaESC的假极体（图3E）。
5. 将胚胎转移至4孔板中新鲜KSOM培养基的孔中，清洗3次。
6. 将胚胎转移至含有KSOM培养基的中心孔培养皿中，并置于37 °C、5% CO₂环境中继续培养以促进后续发育。

14. 重构半克隆胚胎的发育

1. 在步骤13.6的KSOM培养基中培养1天后，多个半克隆胚胎达到2细胞阶段（图5A）。
2. 为了进一步进行植入前胚胎的体外发育，将半克隆胚胎继续在37 °C、5% CO₂环境中置于KSOM培养基中培养。在第2天将半克隆胚胎转移至新鲜KSOM培养基中。到第4天，部分胚胎将达到囊胚阶段（图5A）。
3. 为获得半克隆小鼠，将步骤14.1中的2细胞胚胎移植至假孕受体雌鼠的输卵管中。通过在胚胎移植前一天将雌鼠与输精管结扎雄鼠交配来获得假孕雌鼠，并在胚胎移植当天早晨根据是否存在明显可见的阴栓进行筛选（交配后0.5天（dpc））。约在19.5 dpc时，受体雌鼠自然产下足月仔鼠（图5B）。

结果

本实验方案的目的是利用孤雄单倍体胚胎干细胞（haESC）替代精子，获得半克隆胚胎和小鼠。为此，我们构建并使用了一株携带CAG-EGFP转基因的DKO-phaESC细胞系，将其通过胞质内注射注入MII期卵母细胞。为了获得具有父源印记特征的合适phaESC细胞系，我们利用Cas9核酸酶进行了基因工程改造。单倍体胚胎干细胞系包含单倍体和二倍体细胞，这是由于单倍体胚胎干细胞固有地倾向于发生二倍体化¹⁰。单倍体染色体组是成功替代精子基因组的前提条件。通过流式细胞术分析DNA含量，可显示单倍体和二倍体细胞在G0/G1期、S期以及G2/M期的分布情况（图2A）。

为建立DKO-phaESC细胞系，将野生型phaESC细胞系转染携带piggyBac转座子的载体以实现EGFP的稳定表达，同时转染CRISPR/Cas9质粒以敲除H19和IG-DMR区域。为排除二倍体ES细胞并仅分离表达EGFP的单倍体ES细胞，设定了特定的分选门控（图2A）。随后将单个EGFP阳性的单倍体细胞接种至96孔板的各个孔中，以获得亚克隆。使用MEF饲养层细胞以提高转染后phaESC的贴壁效率和存活率。在细胞扩增后，通过PCR进行初步基因型鉴定，筛选出两个DMR区域均发生缺失的亚克隆。在去除MEF饲养层后，再次进行基因型鉴定，以确认H19-DMR和IG-DMR位点均无野生型等位基因的存在（图2B）。在总共135个亚克隆中，我们获得了5个单倍体DKO-phESC细胞系，这些细胞系携带缺失的等位基因，且在H19-DMR和IG-DMR位点均未检测到野生型等位基因。

为了通过显微镜下观察绿色荧光来研究DKO-phaESC对半克隆胚胎的贡献，将CAG-EGFP转基因导入DKO-phaESC中（图3A）。进行胞质内注射时，使用秋水仙胺处理DKO-phaESC，使其停滞在M期，从而使DKO-phaESC的细胞周期与MII期卵母细胞同步。流式细胞术分析显示，经秋水仙胺处理后出现两个细胞群体，分别对应于停滞在G2/M期的单倍体（2n）和二倍体细胞（4n）（图3B）。未检测到1n单倍体峰，表明细胞周期阻滞基本完全。随后分选处于M期的单倍体ESC并注射入卵母细胞。具体操作为：将单个DKO-phaESC吸入显微注射针头，并注入MII期卵母细胞的胞质中（图3C）。通过将细胞移至显微注射针尖端，使其质膜破裂。

注射后，由于DKO-phaESC的细胞质已分散到卵母细胞较大的细胞质中，因此在构建的半克隆胚胎中几乎检测不到EGFP表达（图3D）。在极少数情况下，可在卵细胞质内观察到一个圆形的强EGFP表达区域，这可能是由于意外注入了完整的DKO-phaESC所致。未能破裂DKO-phaESC细胞膜的情况很可能无法支持胚胎的进一步发育，应予以避免。注射后1小时，通过氯化锶处理激活胚胎¹⁸。激活开始6小时后，在显微镜下可观察到最多3个极体（图3E），这些极体分别对应于卵母细胞的第一和第二极体，以及来自DKO-phaESC的一个拟极体⁷。此外，在微分干涉差显微镜下可观察到两个原核，其形态类似于精子正常受精后合子的原核期阶段。

为验证发育潜能，将半克隆胚胎培养至囊胚阶段（图5A）。此外，将半克隆的2细胞期胚胎移植至受体雌鼠的输卵管后，成功获得了一只足月出生的小鼠（图5B）。正如预期，该半克隆胚胎来源的小鼠为雌性，因为卵母细胞及卵母细胞来源的phaESC均不携带Y染色体。该半克隆小鼠表型正常，与野生型Swiss Webster雄鼠交配后可产生健康的后代。截至目前，该半克隆小鼠已存活超过600天，未出现任何明显的健康问题。

图1：DKO-phaESC作为精子替代物应用的总体概述。（A）本实验方案各步骤的时间流程。（B）示意图展示了建立DKO-phaESC细胞系的步骤（步骤1–6）。（C）示意图展示了通过将DKO-phaESC注射至MII期卵母细胞胞质内构建半克隆胚胎的步骤（步骤7–14）。缩写：DKO = double-knockout；phaESC = parthogenetic haploid embryonic stem cell；FACS = fluorescence-activated cell sorting；MEF = mouse embryonic fibroblast。请点击此处查看该图的放大版本。

图2：通过CRISPR/Cas9介导的H19-和IG-DMR缺失建立DKO-phaESC细胞系。（A）phaESC在转染携带piggyBac质粒以实现EGFP稳定表达以及4种CRISPR/Cas9质粒后的流式细胞术分析。未转染的phaESC作为对照。DNA图谱（上图）显示单倍体和二倍体细胞的细胞周期分布。表达EGFP的G1/S期单倍体细胞由绿色门控区域指示（下图右侧）。（B）phaESC亚克隆在饲养层MEF上培养时（第一次基因分型）及去除MEF后（第二次基因分型）的基因型鉴定结果。亚克隆的phaESC细胞系1、2、3和4分别为野生型细胞、H19-DMR缺失细胞、IG-DMR缺失细胞以及同时缺失H19-和IG-DMR的细胞。DKO-phaESC细胞系5–8均具有H19-DMR和IG-DMR双缺失，且不含野生型等位基因。缩写：DKO = 双敲除；phaESC = 孤雌单倍体胚胎干细胞；DMR = 差异甲基化区域；MEF = 小鼠胚胎成纤维细胞；EGFP = 增强型绿色荧光蛋白；WT = 野生型。请点击此处查看该图的放大版本。

图3：有丝分裂阻滞的DKO-phaESC注射入MII期卵母细胞。（A）携带CAG-EGFP转基因及H19-和IG-DMR缺失的DKO-phaESC培养物的形态；比例尺 = 50 µm。（B）经demecolcine处理8小时后，DKO-phaESC的代表性流式细胞术分析结果。未经demecolcine处理的DKO-phaESC作为对照。（C）显微注射移液管中的DKO-phaESC形态。图示为单个完整DKO-phaESC在移液操作前（左）和破裂细胞膜后（右）的状态；比例尺 = 20 µm。（D）将DKO-phaESC注射入MII期卵母细胞后1小时构建的胚胎。图像为EGFP荧光与明场图像的叠加。黑色箭头指示注射完整DKO-phaESC后出现的强EGFP表达圆形斑点，此类情况应避免；比例尺 = 50 µm。（E）用氯化锶激活6小时后的半克隆胚胎的微分干涉差显微图像。白色箭头指示含有3个极体的胚胎，其中包括来自注射DKO-phaESC的一个假极体；比例尺 = 50 µm。缩写：DKO = 双敲除；phaESC = 孤雌单倍体胚胎干细胞；EGFP = 增强型绿色荧光蛋白。请点击此处查看该图的放大版本。

图4：将DKO-phaESC注射入卵母细胞胞质的实验装置示意图。（A）显示了注射移液管、固定移液管和卵母细胞在注射室中的排列方式。α，显微注射移液管的弯曲角度。（B）用于胞质内注射的显微操作培养皿中液滴的布局。缩写：DKO = 双敲除；phaESC = 孤雌生殖单倍体胚胎干细胞。请点击此处查看该图的放大版本。

图5：半克隆胚胎的发育过程。（A）体外培养中半克隆胚胎的着床前发育。在胞质内注射后的第2天，四细胞期胚胎中首次观察到EGFP表达；第4天时，囊胚中可见强烈的EGFP表达；比例尺 = 100 µm。（B）将二细胞期胚胎移植至受体雌鼠后获得的半克隆小鼠。在产后74天（dpp），该半克隆小鼠（箭头）与野生型Swiss Webster雄鼠交配后经自然分娩产下首批幼崽（星号）。本图所示的半克隆胚胎及半克隆小鼠与Aizawa等³报道的个体相同。缩写：EGFP = 增强型绿色荧光蛋白；dpp，产后天数。请点击此处查看该图的放大版本。

明胶溶液
组分	储存浓度	体积 / 质量	终浓度
水	-	500 mL	-
明胶	-	1 g	0.2%
单倍体胚胎干细胞（HaESC）培养基
组分	储存浓度	体积 / 质量	终浓度
NDiff 227	-	10 mL	-
CHIR 99021	10 mM	3 µL	3 µM
PD 0325901	10 mM	1 µL	1 µM
LIF	1 × 10⁶ IU/mL	10 µL	1,000 IU/mL
青霉素-链霉素	100x	100 µL	1x
HaESC 维持缓冲液
组分	储存浓度	体积 / 质量	终浓度
HaESC 培养基	-	1 mL	-
HEPES 溶液	1 M	20 µL	20 mM
洗涤缓冲液
组分	储存浓度	体积 / 质量	终浓度
DMEM / F-12	-	100 mL	-
BSA 组分	7.5%	7.1 mL	0.5%
MEF 培养基
组分	储存浓度	体积 / 质量	终浓度
DMEM	-	500 mL	-
FBS	-	56 mL	10%
β-巯基乙醇	14.3 mol/L	3.9 µL	100 µM
青霉素-链霉素	100x	5.6 mL	1x
裂解缓冲液
组分	储存浓度	体积 / 质量	终浓度
水	-	8.25 mL	-
Tris-HCl (pH 8.5)	1 M	1 mL	100 mM
EDTA	0.5 M	100 µL	5 mM
SDS 溶液	10%	200 µL	0.2%
NaCl	5 M	400 µL	200 mM
蛋白酶 K	20 mg/mL	50 µL	100 µg/mL
激活培养基
组分	储存浓度	体积 / 质量	终浓度
KSOM	-	1 mL	-
氯化锶	1 M	5 µL	5 mM
EGTA	0.5 M, pH 8.0	4 µL	2 mM
PVP 溶液
组分	储存浓度	体积 / 质量	终浓度
M2 培养基	-	5 mL	-
PVP	-	0.6 g	12%
PMSG 溶液
组分	储存浓度	体积 / 质量	终浓度
PBS	-	450 µL	-
PMSG	500 IU/mL	50 µL	50 IU/mL
hCG 溶液
组分	储存浓度	体积 / 质量	终浓度
PBS	-	450 µL	-
hCG	500 IU/mL	50 µL	50 IU/mL
透明质酸酶培养基
组分	储存浓度	体积 / 质量	终浓度
M2 培养基	-	380 µL	-
透明质酸酶	10 mg/mL	20 µL	0.5 mg/mL
缩写：LIF = 白血病抑制因子；MEF = 小鼠胚胎成纤维细胞；
FBS = 胎牛血清；DMEM = 达尔伯克改良伊格尔培养基；BSA = 牛血清白蛋白；
EDTA = 乙二胺四乙酸；SDS = 十二烷基硫酸钠；EGTA = 乙二醇双(2-氨基乙醚)四乙酸；
PBS = 磷酸盐缓冲液；PVP = 聚乙烯吡咯烷酮；hCG = 人绒毛膜促性腺激素；
PMSG = 孕马血清促性腺激素。

表1：培养基、缓冲液和溶液的配方。

名称	序列 (5' 至 3')		应用
H19-DMR-P1	GTG GTT AGT TCT ATA TGG GG		基因分型
H19-DMR-P2	AGA TGG GGT CAT TCT TTT CC		基因分型
H19-DMR-P3	TCT TAC AGT CTG GTC TTG GT		基因分型
IG-DMR-P1	TGT GCA GCA GCA AAG CTA AG		基因分型
IG-DMR-P2	CCA CAA AAA CCT CCC TTT CA		基因分型
IG-DMR-P3	ATA CGA TAC GGC AAC CAA CG		基因分型
H19-DMR-gRNA1-F	CAC CCA TGA ACT CAG AAG AGA CTG		gRNA
H19-DMR-gRNA1-R	AAA CCA GTC TCT TCT GAG TTC ATG		gRNA
H19-DMR-gRNA2-F	CAC CAG GTG AGA ACC ACT GCT GAG		gRNA
H19-DMR-gRNA2-R	AAA CCT CAG CAG TGG TTC TCA CCT		gRNA
IG-DMR-gRNA1-F	CAC CCG TAC AGA GCT CCA TGG CAC		gRNA
IG-DMR-gRNA1-R	AAA CGT GCC ATG GAG CTC TGT ACG		gRNA
IG-DMR-gRNA2-F	CAC CCT GCT TAG AGG TAC TAC GCT		gRNA
IG-DMR-gRNA2-R	AAA CAG CGT AGT ACC TCT AAG CAG		gRNA

表2：寡核苷酸列表。

讨论

哺乳动物的体细胞核移植（SCNT）克隆技术始于20世纪90年代^19,20,21。这些进展是在30年前对两栖动物进行克隆研究的基础上发展而来的²²。这一较长的延迟反映了哺乳动物胚胎学和基因组印记研究的困难。哺乳动物SCNT技术的发展为利用人孤雌激活胚胎干细胞（haESC）替代精子的应用奠定了基础，本实验方案对此进行了详细说明。

细胞周期同步化是体细胞核移植（SCNT）成功的重要因素²³。在本方案中，向卵母细胞注射孤雄单倍体胚胎干细胞（haESC）同样需要考虑这一因素。将供体基因组引入受体时，必须使细胞周期阶段相匹配，以避免染色体断裂或非整倍性，从而导致胚胎发育失败。半克隆技术更为复杂，因为需要两个基因组与一个胞质体之间保持兼容性。先前有研究报道，将处于M期阻滞的孤雄单倍体胚胎干细胞注入卵母细胞，其产生的半克隆胚胎发育率优于G1期孤雄单倍体胚胎干细胞的注射⁷。该研究提示M期是适用于半克隆技术的细胞周期同步化节点。因此，本研究中将phaESC通过秋水仙胺处理在中期（metaphase）实现有丝分裂阻滞，并将其注入自然停滞于减数分裂II期中期（MII期）的卵母细胞胞质中。重要的是，小鼠胚胎干细胞可通过该方法高效实现M期阻滞，从而实现供体与受体细胞周期的高度同步。

在有丝分裂过程中，核膜破裂，形成纺锤体，复制的染色体附着于其上。将M期的DKO-phaESC注射后，姐妹染色单体被分至假极体和受精卵中⁷（图3E）。因此，来自一个DKO-phaESC的单套染色体可贡献于半克隆胚胎的形成。确保DKO-phaESC染色体的姐妹染色单体在注射后能够正确分离至关重要。完整的DKO-phaESC质膜会阻碍其向假极体的分离。我们确实观察到极少数情况下DKO-phaESC的质膜未被破坏，注射后在卵质中仍可见完整的DKO-phaESC（图3D）。因此，必须通过吹打小心去除DKO-phaESC的质膜。在注射过程中，同样重要的是避免破坏卵母细胞的减数分裂纺锤体，否则可能导致染色体分离异常并诱发非整倍性。

在哺乳动物中，基因组印记限制了孤雌激活胚胎干细胞（phaESCs）作为精子替代物的应用。孤雌激活的haESCs具有母源性的基因组印记构型，而精子则具有父源性的印记构型。因此，在将野生型phaESCs作为精子替代物进行注射后，未能产生足月幼崽。为克服这一限制，已在phaESCs中对IG-和H19-DMR区域进行基因删除改造。对母源性Igf2-H19和Gtl2-Dlk1位点的印记表达进行修饰，足以改变基因组印记构型，从而以超过5.1%的效率（基于移植的2细胞胚胎数）获得半克隆小鼠。这些结果表明，靶向调控两个印记基因可将phaESCs的基因组转变为具有功能性的父源构型，从而在小鼠中替代精子功能。然而，该策略需要对phaESCs进行永久性的遗传修饰。作为一种替代策略，可考虑使用雄核激活的haESCs。雄核激活的haESCs来源于精子基因组，具有父源性印记。已有报道称，野生型雄核激活haESCs作为精子替代物，可在1.3%至1.9%的移植胚胎中贡献发育并产生足月幼崽^4,7,24。此外，将缺失IG-和H19-DMR的雄核激活haESCs注射后，可在20.2%的移植2细胞胚胎中获得足月幼崽²⁴。利用经修饰的雄核激活haESCs进行半克隆的效率提高，可能是因为印记在培养过程中容易变得不稳定，而关键DMR的遗传删除可纠正这些印记缺陷。

考虑到直接对卵母细胞或精子基因组进行遗传修饰存在困难，孤雌单倍体胚胎干细胞（haESCs）成为独立操控亲本基因组的有力工具。利用haESCs替代精子，为小鼠生殖系基因组编辑提供了显著优势。最近一项研究将基于CRISPR/Cas9的基因组编辑技术与haESCs相结合，用于鉴定对胚胎发育至关重要的印记区区域。¹²本研究分析了 Rasgrf1-DMR 与 H19和 免疫球蛋白- DMRs 在双母源小鼠发育中的作用，以及7个不同DMRs在双父源小鼠发育中的功能。利用haESCs替代精子的方法为开展遗传筛选提供了基础，可用于鉴定原始生殖细胞发育过程中DND1蛋白中的关键氨基酸，以及鉴定骨骼发育相关基因。^24,25,26基因组印记研究和遗传筛选以鉴定胚胎发育关键因子的相关研究相当广泛 将人孤雌胚胎干细胞应用于配子基因组的策略。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1.5 mL离心管	Eppendorf	0030 125.150	人孤雌激活胚胎干细胞培养
15 mL离心管	Greiner Bio-One	188271	人孤雌激活胚胎干细胞培养
12孔板	Thermo Scientific	150628	人孤雌激活胚胎干细胞培养
24孔板	Thermo Scientific	142475	人孤雌激活胚胎干细胞培养
6孔板	Thermo Scientific	140675	人孤雌激活胚胎干细胞培养
96孔板	Thermo Scientific	167008	人孤雌激活胚胎干细胞培养
β-巯基乙醇	Merck	M6250	人孤雌激活胚胎干细胞培养
BSA组分	Gibco	15260-037	人孤雌激活胚胎干细胞培养
CHIR 99021	Axon	1386	人孤雌激活胚胎干细胞培养
秋水仙胺溶液	Merck	D1925	人孤雌激活胚胎干细胞培养
DMEM	Gibco	41965-039	人孤雌激活胚胎干细胞培养
DMEM / F-12	Gibco	11320-033	人孤雌激活胚胎干细胞培养
DR4小鼠	The Jackson Laboratory	3208	人孤雌激活胚胎干细胞培养
EDTA	Merck	E5134	人孤雌激活胚胎干细胞培养
FBS	biowest	S1810-500	人孤雌激活胚胎干细胞培养
冻存液	amsbio	11897	人孤雌激活胚胎干细胞培养
明胶	Merck	G1890	人孤雌激活胚胎干细胞培养
HEPES溶液	Gibco	15630-056	人孤雌激活胚胎干细胞培养
经辐照的MEF细胞	Gibco	A34966	人孤雌激活胚胎干细胞培养
LIF（白血病抑制因子）	(自制)	-	人孤雌激活胚胎干细胞培养
脂质体转染试剂	Invitrogen	11668019	人孤雌激活胚胎干细胞培养
NDiff 227	Takara	Y40002	人孤雌激活胚胎干细胞培养
PD 0325901	Axon	1408	人孤雌激活胚胎干细胞培养
青霉素-链霉素	Gibco	15140-122	人孤雌激活胚胎干细胞培养
携带CAG-EGFP转基因的piggyBac质粒	Addgene	#40973	人孤雌激活胚胎干细胞培养
piggyBac转座酶质粒	System Biosciences	PB210PA-1	人孤雌激活胚胎干细胞培养
pX330质粒	Addgene	#42230	人孤雌激活胚胎干细胞培养
pX458质粒	Addgene	#48138	人孤雌激活胚胎干细胞培养
胰蛋白酶	Gibco	15090-046	人孤雌激活胚胎干细胞培养
DNA聚合酶	Thermo Scientific	F549S	基因分型
dNTP混合液	Thermo Scientific	R0192	基因分型
乙醇	Merck	100983	基因分型
盐酸	Merck	100317	基因分型
异丙醇	Merck	109634	基因分型
蛋白酶K	Axon	A3830	基因分型
SDS	Merck	71729	基因分型
氯化钠	Merck	106404	基因分型
ThermoMixer	Eppendorf	5384000012	基因分型
Tris	Merck	T1503	基因分型
5 mL离心管	Falcon	352063	流式细胞术
带细胞筛盖的5 mL离心管	Falcon	352235	流式细胞术
Hoechst 33342	Invitrogen	H3570	流式细胞术
MoFlo Astrios EQ	Beckman Coulter	B25982	流式细胞术
1 mL注射器	Codan	62.1640	超数排卵
30号半英寸针头	Merck	Z192362-100EA	超数排卵
B6D2F1小鼠	The Jackson Laboratory	100006	超数排卵
hCG	MSD动物健康	49451	超数排卵
PBS	Gibco	10010015	超数排卵
PMSG	Avivasysbio	OPPA1037 5000 IU	超数排卵
10 cm培养皿	Thermo Scientific	150350	胚胎操作
4孔板	Thermo Scientific	179830	胚胎操作
50 mL离心管	Greiner Bio-One	227261	胚胎操作
6 cm培养皿	Thermo Scientific	150288	胚胎操作
中心井培养皿	Corning	3260	胚胎操作
数字摇床	Thermo Scientific	88880020	胚胎操作
EGTA	AppliChem	A0878	胚胎操作
透明质酸酶	Merck	H4272	胚胎操作
KSOM	Merck	MR-020P-5F	胚胎操作
M16培养基	Merck	M7292	胚胎操作
M2培养基	Merck	M7167	胚胎操作
矿物油	Merck	M8410	胚胎操作
玻璃毛细管	Merck	P1049-1PAK	胚胎操作
体视显微镜	Nikon	SMZ745	胚胎操作
氯化锶	Merck	13909	胚胎操作
5 mL注射器	Codan	62.5607	显微注射
硼硅酸盐玻璃毛细管	Science product	GB100T-8P	显微注射
CellTram 4r Oil	Eppendorf	5196000030	显微注射
Fluorinert FC-770	Merck	F3556	显微注射
持卵针	BioMedical Instruments	-	显微注射
倒置显微镜	Nikon	Eclipse Ti-U	显微注射
微电极拉制仪	Narishige	MF-900	显微注射
显微注射针	BioMedical Instruments	-	显微注射
Microlaoder吸头	Eppendorf	5252 956.003	显微注射
显微操作臂	Narishige	NT-88-V3	显微注射
微电极拉制仪	Sutter Instrument	P-1000	显微注射
PiezoXpert	Eppendorf	5194000016	显微注射
PVP（聚乙烯吡咯烷酮）	Merck	PVP360	显微注射
注射器滤器	SARSTEDT	83.1826.001	显微注射