方法文章

使用 dpy-10 共 CRISPR 筛选标记和组装的核糖核蛋白复合物对 C. elegans rbm-3.2 基因进行 CRISPR/Cas9 编辑。

DOI：

10.3791/62001

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2020年12月11日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry and Biochemistry, The University of Tulsa

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

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本实验方案的目的是利用组装的核糖核蛋白复合物以及 dpy-10 共CRISPR标记进行筛选，实现对 C. elegans 基因组的无缝CRISPR/Cas9编辑。该方案可用于在 C. elegans 中实现多种遗传修饰，包括插入、缺失、基因替换和密码子替换。

摘要

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细菌规律成簇的间隔短回文重复序列（CRISPR）/Streptococcus pyogenes CRISPR相关蛋白（Cas）系统已被研究人员用于研究重要的生物学问题。CRISPR/Cas基因组编辑方法具有无与伦比的强大功能，可使研究人员精确编辑任意选定的基因组位点，从而促进对基因功能的深入理解。多种用于编辑基因组的 秀丽隐杆线虫 利用CRISPR/Cas9对基因组进行编辑的方法此前已有报道。本文中，我们讨论并展示了一种利用 体外 组装的核糖核蛋白复合物以及 dpy-10 用于筛选的共CRISPR标记。具体而言，本文详细阐述了将提前终止密码子引入目标基因的逐步操作流程 秀丽隐杆线虫 rbm-3.2 通过同源定向修复利用CRISPR/Cas9编辑技术对基因进行编辑。这种相对简单的编辑方法可用于研究任何目的基因的功能，并能够产生纯合编辑的细胞或 organism 秀丽隐杆线虫 通过CRISPR/Cas9编辑 不到两周内。

引言

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成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）/ Streptococcus pyogenes CRISPR 相关蛋白（Cas）技术能够在多种生物中实现高效的靶向基因组编辑1,2,3,4。CRISPR 系统最初被发现是原核生物抗病毒免疫反应的一部分5,6,7。II 型 CRISPR 系统利用一种核酸内切酶（如 Cas9）、反式激活 RNA（tracrRNA）以及一段短的、针对目标 DNA 的 20 个核苷酸长度的向导 CRISPR RNA（crRNA），识别位于目标 DNA 上的 "NGG" 原间隔序列邻近基序（PAM），并在目标 DNA 中产生双链断裂5,6,7,8,9,10,11,12。该双链断裂会被细胞的 DNA 修复机制识别为损伤。因此，所产生的双链断裂可通过两条途径之一进行修复：i）非同源末端连接（NHEJ）或 ii）同源定向修复（HDR）13。NHEJ 通常容易出错，因此当该途径用于修复目标 DNA 中的双链断裂时，常常会在目的基因中引起失活突变（插入、缺失）。另一方面，通过提供一个在双链断裂两侧具有同源性的外源修复模板，可引导细胞的 DNA 修复机制使用 HDR 来修复断裂13。因此，HDR 方法能够实现对任何目的位点的精确编辑。

已报道了多种CRISPR/Cas9基因编辑方案 秀丽隐杆线虫14,15,16,17,18,19,20. 最常用的CRISPR/Cas9编辑方法 秀丽隐杆线虫 包括基于克隆和无克隆的两种方案，用于生成CRISPR/Cas9编辑的修复模板14,15,16,17,18,19,20. 本方案详细讨论了一种基于使用无需克隆的 CRISPR/Cas9 编辑技术的实验流程 dpy-10 作为筛选的共CRISPR标记。迄今为止，唯一详细的 秀丽隐杆线虫-利用荧光标记进行筛选的靶向CRISPR/Cas9编辑视频方案21然而，使用荧光标记进行筛选需要配备荧光显微镜，而许多小型主要以本科生教育为主的机构（PUIs）的实验室可能难以获得此类设备。值得注意的是，先前的研究已获得积极的相关结果，表明携带荧光标记的线虫与基因编辑的存在之间具有良好的相关性21,22然而，仍需开展进一步的研究，以确定基于荧光的筛选方法在使用不同向导RNA和修复模板编辑多种基因位点时的整体效率。最后，由于编码这些荧光标记物的质粒会形成染色体外阵列，这些阵列常产生可变的荧光信号，使得阳性个体难以识别23因此，尽管基于荧光的筛选方法可能具有应用价值，但上述问题可能限制其适用性。

使用产生可见表型的共CRISPR标记可显著减少为筛选出成功编辑的线虫所需检测的子代数量23,24,25,26,27,28重要的是，这些标记物所产生的表型可在简易解剖显微镜下轻松观察到23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34。该 dpy-10 共CRISPR标记是目前研究最充分且应用最广泛的共CRISPR标记之一，用于开展 秀丽隐杆线虫 CRISPR/Cas9 基因组编辑24,27. 因此，本文将讨论在CRISPR/Cas9编辑中进行操作的方法 秀丽隐杆线虫 使用核糖核蛋白复合物的直接递送 dpy-10 作为共CRISPR标记27,35. 在该方法中，制备的编辑注射混合物包含一种经过充分表征的 dpy-10 crRNA 和 dpy-10 修复模板以介导可观察显性性状的产生 "滚轴" （Rol）表型，由已知的杂合子状态所赋予 dpy-10(cn64) 突变位于 dpy-10 基因24,27,29. 当以纯合状态存在时，该基因 dpy-10(cn64) 突变导致矮胖（Dpy）表型，产生较短且较粗壮的线虫24,29. Rol表型由共提供的准确插入介导 dpy-10 修复模板插入单个拷贝的 dpy-10 通过HDR介导的CRISPR/Cas9编辑基因。因此，Rol表型的出现 秀丽隐杆线虫 表明在注射的线虫细胞内注射成功，且发生了成功的HDR介导的编辑事件。由于目的基因的crRNA和修复模板与 dpy-10 crRNA 和 dpy-10 修复模板的情况下，所鉴定出的 Rol 蠕虫很可能在目标基因位点也同时发生了编辑。因此，可通过聚合酶链式反应（PCR）（适用于大于 50 bp 的编辑）或 PCR 后接限制性酶切（适用于小于 50 bp 的编辑）等技术，对这些 Rol 蠕虫进行目标编辑的筛选。

使用该方法进行基因组编辑的优点包括：i) 利用此方法可相对高效地产生CRISPR编辑（效率为2%至70%）27；ii) 本方法中使用的修复模板和向导RNA无需进行克隆，从而缩短了其制备所需的时间；iii) 通过组装核糖核蛋白复合物 体外，组装的编辑复合物的浓度可保持相对恒定，从而提高实验的可重复性；iv）某些在质粒表达时无法产生编辑效果的向导RNA，当以合成形式提供时，已被证明可用于CRISPR/Cas9基因组编辑 体外 转录的crRNA27；v）包括 dpy-10 共CRISPR标记可通过解剖显微镜实现简便筛选，减少为找到阳性个体所需筛选的子代数量24,27；并且通过该方法可在数周内获得经DNA测序验证的纯合编辑线虫品系19,27.

已发表多篇关于不同 C. elegans CRISPR 方法的优秀书籍章节14,15,16,17,18,19,20,43。然而，目前尚缺乏在实验室环境中以视频形式展示 dpy-10 共同CRISPR（co-CRISPR）方法的实例。本文中，我们描述并演示了使用 dpy-10 共同CRISPR 方法编辑一个名为 rbm-3.2 的代表性靶基因的过程，该基因编码一种推测的RNA结合蛋白（WormBase: https://wormbase.org/species/c_elegans/gene/WBGene00011156#0-9fcb6d-10）.  具体而言，本文详细描述了利用体外组装的核糖核蛋白复合物以及外源提供的线性单链修复模板，在 C. elegans 的 rbm-3.2 基因中引入三个提前终止密码子的方法。这些研究已成功构建出首个在 rbm-3.2 基因中带有提前终止密码子的 C. elegans CRISPR 菌株。由于目前对该基因在 C. elegans 中的功能了解尚少，该菌株将作为解析RBM-3.2蛋白功能的有用工具。该方法也可被用于在 C. elegans 基因组的任意位点进行插入、替换和缺失操作。

方案

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该CRISPR/Cas9基因组编辑方案已获得塔尔萨大学机构生物安全委员会批准，符合美国国立卫生研究院（NIH）指南。在整个实验过程中均采用无菌操作技术。本方案所有步骤均使用无核酸酶的试剂进行。特别注意防止RNase污染，例如使用RNase去污溶液清洁手套、工作区域以及设备（如移液器、玻璃器皿外表面等）。

1. crRNA 设计

  1. 找到使 Cas9 在编辑位点附近进行切割的 PAM。
    1. PAM 位点为 5'-NGG-3'。
    2. 请记住，PAM 可位于 DNA 的任意一条链上。
  2. 选择PAM序列5'端的20个碱基作为crRNA序列。
    注意：商业公司合成的实际crRNA序列长度超过20 bp，因其在靶点特异性的20 bp crRNA序列基础上，会自动添加一段通用序列。关于这一点 由于脱靶效应，近期研究尚未发现Cas9的脱靶效应 秀丽隐杆线虫36,37,38,39,40. 此外，所获得的CRISPR编辑菌株均经过杂交回交。因此，我们对设计的crRNA可能产生的脱靶效应并不十分担忧。然而，包括在线网站在内的 http://genome.sfu.ca/crispr/ 和 http://crispor.tefor.net/ 可用于查找并选择脱靶效应最小的crRNA38,41以 G 或 GG 结尾且 GC 含量高于 50% 的 crRNA 预计效率更高19,23,42.
  3. 从公司订购至少 10 nmol 的 crRNA（例如 IDT、Horizon Discovery 等）。
    1. 冻干的crRNA到货后，应保存在-30°C，直至显微注射当天使用。
    2. 在进行显微注射的当天，将冻干的crRNA以最大速度（17,000 × g）离心1分钟，并用5 mM Tris-Cl（pH 7.4）重悬，配制成8 µg/µL的crRNA储备液。
    3. 将未使用的crRNA储备液于-80 °C冷冻保存。

2. 修复模板设计

  1. 下载一个序列操作软件（例如 CLC Sequence Viewer、APE、Snapgene、Vector NTI 等）。我们使用 CLC Sequence Viewer 版本 8.0（Qiagen），因为它操作简便且可免费下载。
  2. 将目标 DNA 序列粘贴到序列查看器中。
  3. 修复模板的方向会影响编辑效率28。若要在 PAM 的 5' 端插入修复序列，应设计一条单链修复模板，其 DNA 序列来源于含有 PAM 序列的同一条 DNA 链（原间隔序列链）28；而若要在 PAM 的 3' 端插入修复序列，则应设计一条单链修复模板，其 DNA 序列来源于不携带 PAM 序列的 DNA 链（间隔序列链）28。
  4. 在编辑位点两侧（5' 和 3' 端）各选择具有连续同源性的 35 个碱基对序列。
  5. 突变或删除 PAM 序列，以防止 Cas9 对修复模板或已编辑的基因组 DNA 进行切割。
    1. 如果无法突变 PAM 序列，可在 PAM 的 5' 端附近引入多个同义突变，以防止修复模板或已编辑的基因组 DNA 被切割。
    2. 仅当 PAM 位于外显子区域时，才可引入同义突变。
    3. 检查密码子使用频率，确保突变后的密码子引入频率与原始未突变密码子相近（例如 https://www.genscript.com/tools/codon-frequency-table）。在某些情况下，可能无法使突变密码子的使用频率与未突变密码子相当。然而，在仅涉及少数几个氨基酸突变的实验中，我们预计突变蛋白的表达水平不会发生显著变化。
  6. 如果编辑较小（例如少数几个碱基的突变），可通过同义突变在编辑位点附近引入一个独特的限制性酶切位点。我们使用 http://heimanlab.com/cut2.html 来查找可通过同义突变引入的限制性酶切位点。
    1. 检查密码子使用频率，确保突变后的密码子引入频率与原始未突变密码子相近。如上所述，这并不总是可行的。然而，在涉及少数几个氨基酸突变的实验中，我们预计突变蛋白的表达水平不会发生显著变化。
  7. 合成并购买用于 HDR 的线性单链修复模板，规格为 4 nmol 的超长寡核苷酸（ultramer oligos）。
  8. 用无核酸酶水重悬冻干的寡核苷酸修复模板，配制成浓度为 1 µg/µL 的修复模板储备液，并于 -30 °C 保存备用。

3. 引物筛选设计

  1. 使用 CLC 序列查看器或其他类似软件，在编辑位点两侧分别设计 20 至 23 个碱基的正向和反向引物，使其在 PCR 扩增后产生 400 至 600 个碱基对的条带。
    1. 对于数个千碱基大小的较大插入片段，应将正向引物设计在修复模板左侧同源臂的外侧，反向引物设计在修复模板内部。在此情况下，仅在成功编辑的线虫中才能获得 PCR 产物。
    2. 为鉴定长片段插入的纯合编辑线虫，可设计位于插入位点两端外侧的正向和反向引物，以扩增整个插入区域。
  2. 在将引物用于基因分型之前，先使用野生型基因组 DNA 进行引物测试并优化 PCR 条件。
    1. 确保在基因组 DNA 的 PCR 扩增中产生单一的、大小符合预期的条带（如适用）。

4. 准备用于注射的年轻成虫蠕虫

  1. 将处于L2-L3阶段的C. elegans挑取至MYOB平板上的新鲜细菌菌苔中，于20 °C培养过夜。
    注意：MYOB平板的制备方法详见此处：http://www.wormbook.org/wli/wbg13.2p12a/
  2. 在显微注射当天，挑选子宫内胚胎少于10个的年轻成虫进行注射。

5. 准备注射混合液

  1. 在无菌无核酸酶的离心管中，按照 表1 所示顺序配制注射混合液。
    注意：如果预计将来不再使用该注射混合液，可将各组分按比例缩小，配制 5 µL 的注射混合液（而非 20 µL）。
  2. 通过移液操作混匀注射混合液。
  3. 将注射混合液在 37 °C 下孵育 15 分钟，以组装核糖核蛋白复合物。
  4. 在 4 °C 下以 17,000 × g 离心 5 分钟。

6. 向秀丽隐杆线虫（C. elegans）生殖腺进行显微注射

  1. 按照 Iyer 等人 2019 年所述方法，将 CRISPR 注射混合物显微注射到 C. elegans 的生殖腺中43。
    1. 用 CRISPR 注射混合物注射约 30 条线虫。未使用的注射混合物可在 4°C 下保存约 6 个月，且不会丧失效率，可重复使用49。
    2. 尽可能注射两个生殖腺臂。被注射的线虫视为 P0 代。

7. 注射线虫的回收与转移

  1. 显微注射后，使用线虫挑取工具将显微注射过的 P0 线虫转移至接种了 OP50 E. coli 的 60 mm MYOB 琼脂平板上，在室温下恢复约一小时。
    1. 请注意，恢复温度取决于所注射线虫的基因型。例如，对于温度敏感型品系，可能需要在不同的温度下进行线虫恢复。
  2. 使用铂金丝线虫挑取工具，将每只注射过的线虫分别转移至单独的接种过的 35 mm MYOB 琼脂培养皿中，并在 20 °C 下孵育至次日，使其产卵。
    1. 请注意，部分线虫可能因显微注射操作造成的损伤而死亡。仅选择存活且能够活动的线虫进行操作。
  3. 24 小时后，将注射过的线虫转移到新的单独平板中（每板 1 条线虫）。

8. 筛选秀丽隐杆线虫（C. elegans）的挑取

  1. 注射后在 20°C 下培养 3 至 4 天，使用解剖显微镜观察所有含有注射线虫后代的培养皿。
  2. 鉴定出 F1 后代中表现出滚动表型（Rol）和矮胖表型（Dpy）的培养皿。Dpy 表型是指与同发育阶段的对照线虫相比，线虫体型更短更粗壮（WormBase: https://wormbase.org/species/all/phenotype/WBPhenotype:0000583#0--10）。含有 Rol 和 Dpy 表型线虫的培养皿表明，F1 后代已成功引入 dpy-10(cn64) 突变，分别处于杂合或纯合状态。
  3. 挑选出含有最多滚动和矮胖表型线虫的培养皿用于后续筛选。
  4. 从这些培养皿中分别挑取 50 至 100 只 F1 Rol 线虫，每只单独转移至独立的培养皿中（每皿 1 只），并让其产卵。
    1. 让处于 L4 发育阶段的 F1 Rol 线虫产卵 1 至 2 天，以产生 F2 后代。

9. 单条线虫裂解与PCR

  1. 产生 F2 1 至 2 天后，将每只单独的 F1 Rol 母虫转移至含有 20 mg/mL 蛋白酶 K 1:100 稀释液的 2.5 µL 裂解缓冲液中 (表 2)。
  2. 将试管在 -30 °C 冻存 20 分钟。线虫在此阶段可长期保存，直至后续分析。
  3. 在 PCR 扩增仪上进行单条线虫裂解，程序如下：60 °C 恒温 1 小时，95 °C 15 分钟，然后保持在 4 °C。
  4. 直接向含有裂解线虫的 2.5 µL PCR 管中加入以下试剂：12.5 µL 含 dNTPs、DNA 聚合酶、MgCl2 和上样染料的 2× PCR 混合液，1 µL 10 µM 正向引物，1 µL 10 µM 反向引物，以及无菌水补足至 22.5 µL。每个 PCR 反应总体积为 25 µL。
    注意：若需同时筛选多只 F1 线虫，配制适用于多个反应的 PCR 主混合液，并向每根裂解管中加入 22.5 µL 主混合液，操作更快速且便捷。
  5. 在扩增仪上设置 PCR 反应程序如下：95 °C 预变性 1 分钟，随后进行 35 个循环（每个循环包括 95 °C 变性 15 秒，55 °C 退火 15 秒（针对每对引物优化条件），72 °C 延伸 1 分钟（根据目标 DNA 片段优化时间））44，最后在 4 °C 保存反应产物。

10. 限制性酶切与琼脂糖凝胶电泳

注意：仅在筛选小片段编辑（小于 50 bp）时才需要进行限制性酶切消化。

  1. 将第9步的10 µL PCR DNA转移至新离心管中。
  2. 每15 µL反应体系中加入2至4单位的限制性内切酶及1倍浓度的限制酶缓冲液（即1.5 µL的10倍浓度反应缓冲液）。
  3. 在37 °C（或其他酶特异性温度）孵育2小时（对于快速酶，孵育时间可更短）。
  4. 通过将PCR管在65 °C（或其他酶特异性温度）加热10至15分钟，使限制性消化反应失活。
  5. 将每个PCR管中的全部反应产物上样至1%-2%琼脂糖凝胶的单个加样孔中，在110 mA条件下电泳，直至达到理想的条带分离效果。
    注：我们使用的PCR预混液已含有上样染料，便于在琼脂糖凝胶电泳过程中进行可视化。该预混液不会干扰限制性消化反应，因此适用于同时筛选大量线虫。

11. 鉴定编辑成功的线虫

  1. 在紫外光下观察琼脂糖凝胶（适用于溴化乙锭染色的凝胶），以检测DNA条带大小。
    注意：经阳性编辑的线虫由于在基因组目标位点处通过携带限制性酶切位点的修复模板进行了编辑，会在预期大小位置显示出一条额外的DNA条带。F1代滚筒表型（roller）线虫预期为编辑位点的杂合子，因此应出现三条条带（一条为野生型未切割的PCR产物，另两条为编辑后切割产生的较小片段）。尽管较为罕见，但需注意纯合子偶尔也会出现。
  2. 在通过Sanger测序验证编辑存在之前，保存所有原始的阳性编辑平板。

12. 目标纯合编辑

  1. 从已成功编辑的 F1 Rol 突变线虫培养板中，挑选 8 到 12 条外观正常、不滚动的 F2 代线虫，让其产卵并繁殖后代 1 至 2 天。
    注意：C. elegans 为自体受精的雌雄同体生物，若编辑后的等位基因不影响存活率或发育，则预期纯合突变体的比例约为 25%。不滚动的 F2 代线虫在 dpy-10 位点必须为野生型。挑选不滚动的个体有助于获得已丢失 dpy-10(cn64) 突变、仅在目标基因上携带突变的编辑线虫。
    1. 请注意，dpy-10 基因位于第二号染色体上。若目标基因与 dpy-10 存在连锁关系，则可能难以将 dpy-10 突变与目标基因突变分离。
  2. 执行步骤 9 至 11，以鉴定纯合线虫品系。

13. 通过测序确认编辑

  1. 一旦鉴定出纯合线虫，按步骤9所述进行裂解和PCR。
    1. 对每条待测序的纯合品系，至少设置3个PCR反应。
  2. 使用PCR纯化试剂盒纯化PCR产物。
  3. 使用纳米分光光度计测定DNA浓度。
  4. 将样品与相应的正向引物一同送测进行Sanger测序。确保正向引物设计位置距离待测编辑位点至少50个碱基。
  5. 使用序列分析软件分析测序结果，确认编辑的存在。

结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

rbm-3.2 是一种推测的RNA结合蛋白，与人类剪切刺激因子亚基2 τ变异体具有同源性（WormBase：https://wormbase.org/species/c_elegans/gene/WBGene00011156#0-9fcb6d-10）。RBM-3.2蛋白被鉴定为蛋白磷酸酶1（GSP-1）及其调节因子Inhibitor-2（I-2）的结合伴侣SZY-2）以及在先前研究中将这些蛋白鉴定为新型调控因子的SDS-22 秀丽隐杆线虫 中心粒复制（数据未显示）45目前，关于该功能的研究还非常有限 rbm-3.2 基因在 秀丽隐杆线虫 因此，为了进一步研究该基因的生物学功能 秀丽隐杆线虫 rbm-3.2 基因，该 rbm-3.2-无效等位基因 rbm-3.2(ok688) 来自秀丽隐杆线虫遗传学中心（Caenorhabditis Genetics Center，CGC）.

遗憾的是，除了缺失整个 rbm-3.2 基因外，rbm-3.2(ok688) 等位基因还导致与其重叠的 rbm-3.1 基因发生部分缺失，从而增加了遗传分析的复杂性。因此，为了准确研究 rbm-3.2 基因在 C. elegans 中的功能，我们利用 CRISPR/Cas9 基因编辑技术，在 C. elegans rbm-3.2 编码区起始位置附近引入了三个提前终止密码子，同时保持重叠的 rbm-3.1 基因完整无损。

将这些提前终止密码子引入 秀丽隐杆线虫 rbm-3.2 基因，我们设计了一条位于DNA相反链（模板链）上的具有PAM基序的crRNA (图1A)Cas9切割位点位于距目标序列6个碱基的位置 rbm-3.2 起始密码子ATG。为了将提前终止密码子引入到 rbm-3.2 基因，我们设计了具有以下五个主要特征的修复模板：1）35个碱基与目标序列完全同源 rbm-3.2 上游的 rbm-3.2 起始密码子（左侧同源臂）2）删除了包含PAM基序的一段短序列 3）在起始密码子后立即引入一个EcoRI限制性酶切位点用于筛选 4）第二个和第三个密码子 rbm-3.2 在第五个RBM-3.2密码子后引入了三个终止密码子，以终止翻译，同时删除了后续序列 rbm-3.2 mRNA 5) 与第一个内含子具有35个碱基的连续同源性 rbm-3.2 编辑下游（右侧同源臂）包含 (图1B).

本CRISPR实验的注射混合物按表I所示配制。将注射混合物在37 °C孵育15分钟，以组装核糖核蛋白复合物。随后对混合物进行离心，并装入拉制的显微注射针中。向C. elegans性腺的显微注射操作参照Iyer等2019年文献43所述方法进行。

图2展示了使用本方案生成基因编辑的C. elegans的实验时间线。尽管我们通常每个CRISPR实验注射30只线虫，但一些实验室每个实验注射较少的线虫（10至20只之间）。由于注射更多的线虫可提高获得阳性编辑的概率，因此我们倾向于注射较多数量的线虫。许多实验室在筛选时会选择“中奖”子代群体（即滚转表型（Rol）和矮小表型（Dpy）后代超过50%的培养板）。根据我们进行多次CRISPR实验的经验，尽管偶尔会出现“中奖”子代群体，但大多数情况下用于筛选的Rol线虫通常来自多个不同的P0代培养板，每块板仅含有少量Rol后代。本实验中未获得任何“中奖”子代群体。

总共筛选了来自7只注射过的P0线虫的73只F1 Rol线虫的基因组DNA，以检测编辑是否成功。用于筛选的引物序列及其相对于rbm-3.2基因起始密码子的位置如图3A所示。分析结果显示，在73只F1线虫中，有7只检测到阳性编辑（占9.5%）（图3B）。未编辑的线虫经EcoRI酶切后显示一条445 bp的DNA片段；而携带rbm-3.2基因提前终止密码子的线虫经EcoRI酶切后则产生两条片段，分别为265 bp和166 bp。杂合编辑的线虫经EcoRI酶切后显示三条片段：一条为野生型未编辑的445 bp DNA片段，另两条分别为265 bp和166 bp，来自已编辑的rbm-3.2基因拷贝。

为了鉴定携带纯合编辑的线虫，我们将12条来自已鉴定为阳性的F2代杂合子F1代线虫分别转移到新的独立培养板上，并让其繁殖后代（F3代）。随后按照之前所述方法对F2代线虫进行纯合性筛选。在检测的12条线虫中，有6条（50%）被确认为目标编辑的纯合子（图4A）。选取一条经鉴定为纯合编辑的线虫品系提取基因组DNA，并用于DNA测序反应。DNA测序分析证实该编辑确实处于纯合状态（图4B）。通常情况下，建议对多个纯合编辑的线虫品系进行测序，以确保所有纯合编辑品系表现出一致的表型（如果该基因缺失突变会导致特定表型）。此外，还可能需要通过基于表达水平的检测方法（如Western印迹或RT-PCR）或表型分析来进一步验证基因敲除效果。这是因为，尽管在基因起始位置引入了提前终止密码子，但在其下游仍可能存在其他可被利用的替代ATG起始密码子，从而启动蛋白表达，产生部分功能性的截短蛋白。

试剂浓度 添加体积
Cas9 蛋白溶于含 20% 甘油的无核酸酶水中2 µg/µL5 µL
tracrRNA 溶于 5 mM Tris-Cl pH 7.5 中4 µg/µL5 µL
dpy-10 crRNA 溶于 5 mM Tris-Cl pH 7.5 中8 µg/µL0.4 µL
rbm-3.2 crRNA 溶于 5 mM Tris-Cl pH 7.5 中8 µg/µL1 µL
dpy-10 修复模板溶于无菌无核酸酶水中500 ng/µL0.55 µL
rbm-3.2 修复模板溶于无菌无核酸酶水中1 µg/µL2.2 µL
KCl 溶于无菌无核酸酶水中1 M0.5 µL
无菌无核酸酶水-5.35 µL

表1：使用核糖核蛋白复合物及dpy-10作为共CRISPR标记进行CRISPR/Cas9编辑的注射混合物组分。配制注射混合物时应使用无菌技术及无RNase试剂。请注意，配制注射混合物时使用的是无菌、未经DEPC处理的无核酸酶水。

试剂浓度添加体积
KCl1 M5 mL
Tris-HCl pH 8.31 M1 mL
MgCl21 M250 µL
NP-40 (或 IGEPAL CA-630)100%450  µL
Tween-20100%450  µL
明胶2%500  µL
水-92.35 mL

表2：线虫裂解缓冲液配方。 线虫裂解缓冲液可大量配制，经高压灭菌、过滤后分装，用于长期保存（注意：裂解缓冲液在室温下可保存一年以上）。每次使用前，向线虫裂解缓冲液中加入1:100稀释的20 mg/mL蛋白酶K溶液。

CRISPR基因编辑、PAM基序和EcoRI位点整合的基因组DNA修复示意图。
图1：用于rbm-3.2基因提前终止密码子CRISPR编辑的crRNA与修复模板设计示意图。A．示意图显示了rbm-3.2基因的编码链与模板链，其中crRNA序列及PAM基序序列位于模板链上。B．示意图展示为在rbm-3.2基因中引入三个提前终止密码子而合成的修复模板的不同特征。请点击此处查看该图的放大版本。

CRISPR 工作流程图；包括显微注射、PCR、DNA 分析、琼脂糖凝胶电泳。
图 2：利用预组装的核糖核蛋白复合物及 dpy-10 作为共编辑标记，通过 CRISPR/Cas9 编辑技术生成纯合编辑的 C. elegans 的实验时间线。 本图展示了使用该 CRISPR/Cas9 编辑方法生成纯合编辑 C. elegans 所需执行步骤的逐日安排。简言之，将 30 条线虫通过显微注射导入 CRISPR 编辑混合物后，分别转移至接种了 OP50 E. coli 的独立 MYOB 培养板上。24 小时后，将注射过的 P0 代线虫转移至新的 MYOB 培养板，继续产卵。在显微注射后的第 3 天和第 4 天，观察培养板上是否存在 Rol 表型的 F1 代线虫。选择 Rol 和 Dpy 表型 F1 代线虫数量最多的培养板，从中挑取 73 条 F1 代 Rol 线虫（通常每次 CRISPR 实验挑选 50 至 100 条 F1 代 Rol 线虫），每条单独转移至新的 MYOB 培养板（每板 1 条），使其产卵约 2 天。显微注射后第 6 天，从已产生后代（F2）的 F1 代线虫制备裂解液，并通过 PCR 扩增结合 EcoRI 限制性酶切及琼脂糖凝胶电泳检测编辑是否成功。第 7 天，从检测呈阳性的培养板中转移 12 条非 Rol、非 Dpy 表型的 F2 代线虫至新的独立培养板，使其繁殖产生 F3 代后代。第 9 天，按照前述方法对 F2 代线虫进行编辑位点纯合性筛选。第 10 天，对纯合的 F3 代线虫进行裂解、PCR 扩增及 PCR 产物纯化，并使用 NanoDrop 分光光度计测定 DNA 浓度。第 11 天，对阳性样本设置 Sanger 测序反应，并将反应产物送测 DNA 序列。第 12 天，分析测序结果，并使用序列分析软件（例如 CLC Sequence Viewer）验证编辑的存在。请点击此处查看该图的放大版本。

使用凝胶电泳对 rbm-3.2 基因进行 CRISPR 筛选，上方显示引物序列。
图 3：筛选 C. elegans 中携带rbm-3.2 基因提前终止密码子的杂合子个体。经 EcoRI 消化后的秀丽隐杆线虫（C. elegans）基因组 PCR DNA 琼脂糖凝胶电泳图像。对 73 条独立的 F1 代线虫进行基因分型，以筛选是否存在 rbm-3.2 基因编辑。红色数字和星号表示成功编辑的线虫个体。所鉴定出的 7 条阳性编辑 C. elegans 均为杂合子，因其在 EcoRI 消化后表现出一条野生型未编辑 DNA 片段（445 bp），以及来自编辑后 rbm-3.2 基因的两条 DNA 片段（分别为 265 bp 和 166 bp）。请点击此处查看该图的放大版本。

Electrophoresis results and DNA sequencing, gene editing analysis, mutation identification diagram.
图4：鉴定并验证纯合子编辑 秀丽隐杆线虫 携带的 rbm-3.2 提前终止密码子。A. 筛选 秀丽隐杆线虫 纯合的 rbm-3.2 提前终止密码子. 琼脂糖凝胶电泳图像 秀丽隐杆线虫 用 EcoRI 消化基因组 DNA。12 个独立的 F2 来自阳性平板的线虫进行基因分型，并筛选其纯合性 rbm-3.2 编辑。红色：纯合编辑的线虫。在筛选的12个F代中，有6个2 50%的蠕虫对该基因型为纯合子 rbm-3.2 提前终止密码子。蠕虫7未出现PCR产物。 B. 确认提前终止密码子的插入 rbm-3.2 通过DNA测序。示意图显示了未编辑和已编辑纯合子的DNA序列与蛋白质序列的比较。对纯合编辑线虫基因组DNA测序结果的分析证实了三个提前终止密码子的存在 rbm-3.2 基因在CRISPR/Cas9编辑后的氨基酸变化均以红色字母或红色星号标出。 请点击此处以查看此图的放大版本。

讨论

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除了rbm-3.2之外，我们还使用上述方案对多个基因进行了编辑。针对不同基因位点、向导RNA以及修复模板（单链和双链），我们的编辑效率在2%至58%之间（数据未显示）。所观察到的编辑效率与此前报道的该方案2%至70%的编辑效率相当27。我们还成功地利用该技术实现了基因删除。通过使用两条crRNA，我们将一个长度接近6 kb的基因替换为绿色荧光蛋白（GFP）的编码序列（数据未显示）。在该实验中，经分析的Roll表型F1代线虫中约有14%显示出该基因被成功删除并被GFP替代（数据未显示）。然而，仍需进一步实验以确定该技术可实现的基因删除和替换的最大长度。

该技术可用于插入约1.6 kb长度的片段19。最近一项研究表明，利用此方案插入超过1.6 kb的片段时，通过产生两个双链断裂并使用具有较长同源臂的修复模板，可实现更大DNA片段（约10 kb）的插入28。或者，也可通过对此方案进行多轮基因编辑以实现更大的修饰。此外，也可采用其他基于质粒的C. elegans CRISPR/Cas9基因编辑方案，用于涉及插入大于1.6 kb DNA片段的CRISPR实验46,47,48。

在使用本基因编辑方案之前，有必要确保目标基因不与以下因素相关联 dpy-10 位于2号染色体上的位点。当目标基因与该位点连锁时 dpy-10，将其分离可能会存在问题 dpy-10 远离您感兴趣的编辑位点。因此，如果目标基因与 dpy-10 位点，其他共CRISPR标记，例如 unc-58 （X染色体），unc-22 或 zen-4 （染色体 IV）, 和 ben-1 或 pha-1 （染色体III）位于不同染色体上的基因可用于24,25,26,28梅耶实验室的数据表明 ben-1 和 zen-4 突变可作为该筛选方法中有效的共CRISPR标记28然而，需要注意的是，使用 zen-4 和 pha-1 作为共CRISPR标记物需要在非野生型背景下进行CRISPR实验 zen-4(cle10ts) 或 pha-1(e2123)ts) 分别作为背景26,28此外，涉及某些共CRISPR标记（如 ben-1 可能需要制备特殊培养板（例如含有苯并咪唑的培养板）28我们已成功使用了该方法 unc-58 用于筛选与目标基因连锁的阳性编辑的共CRISPR标记 dpy-10 使用此方法（数据未显示）。该 unc-58(e665) 突变赋予一种可见的表型（麻痹），可有效用于筛选成功编辑的线虫24. 或者，如果有荧光显微镜可供使用，可采用荧光标记的 gtbp-1 基因也可作为本实验方案的共CRISPR标记19.

采用这种基因组编辑方法时，为了获得较高的编辑效率，编辑位点必须位于Cas9切割位点上游10至30个碱基范围内。如果编辑位点距离Cas9切割位点超过30个碱基，编辑效率将显著下降19,35,37。然而，Meyer实验室最近的一项研究表明，通过在相距较远的位置产生两个双链断裂，可利用该方案实现远离Cas9切割位点的编辑插入28。

在本实验方案中，修复模板的设计使得插入的三个终止密码子均位于同一阅读框内。然而，另一种构建无效突变体的策略是使用一种此前已报道的通用型43个碱基长的敲入式STOP-IN盒50。重要的是，该插入盒在所有三个可能的阅读框中均含有终止密码子，并可导致移码突变。当编辑位点发生错误或不完全修复时，这一策略在生成无效突变体方面尤为有用。

总之，由于该方法耗时较短，且近年来取得了诸多进展，因此非常适合用于常规实验室实验，包括添加短免疫原性表位标签、荧光标签，以及进行基因缺失、基因替换和密码子替换等操作。

披露

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作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

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本工作得到了塔尔萨大学（TU）启动资金以及授予Jyoti Iyer的TU教师发展暑期奖学金的支持。我们感谢化学暑期本科生研究项目（CSURP）和塔尔萨本科生研究挑战赛（TURC）为参与本研究的学生提供津贴。我们感谢Caroline Dunn女士在技术方面的协助。最后，我们感谢Jordan Ward博士、Aimee Jaramillo-Lambert博士、Anna Allen博士、Robert Sheaff博士、William Potter博士和Saili Moghe博士对本手稿提出的宝贵意见。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
条形码DNA测序管Eurofins GenomicsSimpleSeq试剂盒预混液N/A
Cas9蛋白PNA BioCP01冻干Cas9蛋白用含20%甘油的无核酸酶水中重悬，分装后于-80 °C保存
crRNAHorizon Discovery/ GE DharmaconN/A冻干crRNA用5 mM Tris-Cl缓冲液（pH 7.5）重悬，分装后于-80 °C保存
EcoRI新英格兰生物实验室R3101S于-30 °C保存
MinElute PCR纯化试剂盒Qiagen28004离心柱于4 °C保存
MyTaq RedmixMeridian BioscienceBIO-25043于-30 °C保存
引物IDTN/A合成标准20 nmol寡核苷酸，用无菌无核酸酶水重悬后于-30 °C保存
蛋白酶KGold BioP-480-SL4于-30 °C保存
修复模板寡核苷酸IDTN/A合成4 nmol Ultramer寡核苷酸，用无菌无核酸酶水重悬后于-30 °C保存
tracrRNAHorizon Discovery/ GE DharmaconU-002005-50冻干tracrRNA用5 mM Tris-Cl缓冲液（pH 7.5）重悬，分装后于-80 °C保存

参考文献

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