模拟新生血管化初始事件的微流控模型

摘要

本文提供了一种微流控芯片及一种可自动控制、高效循环的微流控系统，可重现血管新生的初始微环境，使内皮细胞（ECs）同时受到高管腔剪切应力、生理水平的跨内皮流动以及不同分布的血管内皮生长因子（VEGF）的刺激。

摘要

新生血管形成通常起始于已有的正常血管系统，内皮细胞（ECs）在初始阶段所处的生物力学微环境与后续新生血管形成过程中的微环境存在显著差异。尽管已有大量模型可用于模拟新生血管形成的不同阶段，但 体外 仍缺乏能够概括在正常血管微环境相应刺激下血管新生初始过程的3D模型。在此，我们重建了一个 体外 模拟血管新生初始事件的3D模型（MIEN）。MIEN模型包含一个微流控出芽芯片和一个自动控制的高效循环系统。在微流控出芽芯片中形成了由内皮细胞包被的功能性可灌注微通道，并模拟了出芽过程。通过微流控控制系统重现了血管新生最初的生理微环境，使内皮细胞（ECs）可同时暴露于高管腔剪切应力、生理性跨内皮流动以及多种血管内皮生长因子（VEGF）分布条件下。MIEN模型可便捷地应用于血管新生机制的研究，并有望成为一种低成本的药物筛选和毒理学研究平台。 关键词：MIEN模型，微流控芯片，血管新生，内皮细胞，剪切应力，跨内皮流动，VEGF分布，药物筛选，毒理学

引言

新生血管形成发生在许多正常和病理过程中^1,2,3,4，成年人体内的主要过程包括血管生成和动脉生成⁵。除了最著名的生长因子（如血管内皮生长因子，VEGF）⁶外，机械刺激，特别是血流引起的剪切应力，在调控新生血管形成中也具有重要作用⁷。众所周知，剪切应力的大小和形式在血管系统的不同部位存在显著且动态的变化，从而对血管细胞产生重要影响^8,9,10,11,12。先前的研究表明，剪切应力可能影响内皮细胞（ECs）的多个方面，包括细胞表型变化、信号转导、基因表达以及与血管壁细胞的相互作用^{13,14,15,16,17,18,19,20}；因此，调控新生血管形成^21,22,23,24。

因此，为了更好地理解血管新生过程，有必要在天然的细胞微环境中重建该过程 体外近年来，已建立了多种模型以构建微血管，并实现对微环境的精确控制^25,26,27，利用微加工和微流控技术的进步。在这些模型中，微血管可通过水凝胶生成^28,29聚二甲基硅氧烷（PDMS）微流控芯片^30,31,32 或3D生物打印^33,34. 微环境的某些方面，例如管腔剪切应力^22,23,35,36，跨内皮流动^37,38,39,40, 血管生成因子的生化梯度^41,42应变/拉伸^43,44,45，并与其他类型的细胞共培养^32,46 已被模拟和控制。通常使用大型储液器或注射泵来提供灌注介质。这些模型中的跨内皮流动是通过储液器与微管之间的压力差产生的。^22,23,38,40然而，通过这种方式难以持续维持机械微环境。如果采用高流速和高剪切应力进行灌注，跨内皮流动会增加并超过生理水平。先前的研究表明，在新生血管形成的初期，由于内皮细胞和基底膜保持完整，跨内皮流动速度非常低，通常低于0.05 µm/s⁸与此同时，尽管血管系统中的管腔剪切应力变化很大，但其值相对较高，平均为5-20 dyn/cm^2,11,47目前，以往研究中跨内皮流动的速度通常保持在0.5–15 µm/s之间。^22,38,39,40，且管腔剪切应力通常低于10 dyn/cm^2 23持续同时向内皮细胞施加高管腔剪切应力和生理水平的跨内皮流动仍然是一个难题。

在本研究中，我们描述了一种 体外 用于模拟新生血管化初始事件的3D模型（MIEN）。我们开发了一种微流控芯片及自动控制的高效循环系统，以形成可灌注的微管并模拟出芽过程⁴⁸采用MIEN模型，可首先重现血管新生初期受刺激的内皮细胞（ECs）微环境。该模型可同时对ECs施加高管腔剪切应力、生理水平的跨内皮流动以及多种血管内皮生长因子（VEGF）分布进行刺激。本文详细描述了建立MIEN模型的操作步骤及需重点关注的关键环节，以期为其他研究者提供参考。

方案

1. 晶圆制备

注意：本方案专用于本研究中使用的 SU-8 2075 负性光刻胶。

1. 在匀胶机上使用甲醇和异丙醇对硅片清洗3至5次，具体步骤如下：首先以500 rpm转速旋转15秒，然后以3,000 rpm转速旋转60秒。
2. 将硅片转移至预热至180 °C的加热板上，烘烤10分钟。
3. 从加热板上取下硅片，冷却至室温。在进行旋涂前，再次用压缩空气清洁硅片表面。将4 mL SU-8 2075光刻胶滴加在硅片中心。
4. 在匀胶机上获得70 µm的特征高度，具体步骤如下：首先以500 rpm转速旋转12秒，然后以2,100 rpm转速旋转50秒。
5. 在加热板上进行前烘处理，具体步骤如下：先在65 °C下烘烤8分钟，再在95 °C下烘烤20分钟。随后将硅片从加热板上取下，冷却至室温后再进行光刻。
6. 将掩膜版放置在光刻胶薄膜上。使用光刻设备对硅片进行曝光，总曝光量为200 mJ/cm²。
   注意：该掩膜版包含九组芯片图案，因此每次可同时制备九个微流控出芽芯片。
7. 在加热板上进行曝光后烘烤，具体步骤如下：先在65 °C下烘烤5分钟，然后在95 °C下烘烤20分钟。随后将硅片从加热板上取下，冷却至室温后再进行显影。
8. 将硅片转移至盛有SU-8显影液（PGMEA）的玻璃培养皿中，开始显影。
   警告：显影液对眼睛和呼吸道具有刺激性。操作应在通风橱内进行，并佩戴防溅护目镜、丁腈手套和供气式面罩。
9. 沿流道方向轻轻晃动培养皿，10分钟后更换显影液。
10. 重复步骤1.9共3至5次，直至图案清晰可见。
    注意：确保硅片表面无残留光刻胶，否则需再次在显影液中冲洗硅片。
11. 将硅片转移至预热至120 °C的加热板上，烘烤30分钟。
12. 用移液器吸取35 µL硅烷试剂滴加到盖玻片上， 然后将盖玻片与硅片一同放入干燥器中并抽真空。密封干燥器，使硅片在真空条件下静置4小时，以完成硅烷化处理，防止后续软光刻过程中PDMS粘附。
    警告：硅烷试剂有毒。为防止中毒，硅烷化操作必须在通风橱内进行，并佩戴丁腈手套。
13. 释放干燥器内的真空。将硅烷化处理后的硅片转移至预热的加热板上，在65 °C下烘烤2小时。
14. 将硅片存放于洁净的培养皿中，待后续使用。

2. 微流控出芽芯片的制备

1. 将20 g基础剂和2 g固化剂（10:1比例）加入塑料烧杯中，用搅拌棒充分混合。
2. 将烧杯放入干燥器中，抽真空1小时，以去除PDMS混合物中的气泡。
3. 将PDMS混合物倒入培养皿中的晶圆上，然后将培养皿重新放入干燥器中，继续脱气30分钟。
   注意：使用双面胶带将晶圆固定在培养皿底部有助于确保在脱气和固化过程中晶圆保持水平。
4. 从干燥器中取出培养皿，放入80 °C的干燥烘箱中加热3小时以完成固化。
5. 小心地将PDMS层从晶圆上剥离，并根据图案用解剖刀切割成九个芯片。
   注意：剥离后应保持结构面朝上。
6. 使用1 mm和3.5 mm的活检打孔器，分别在每个芯片上打两个水凝胶注射口和四个培养基注射口。
7. 用无残留胶带清洁打孔后的芯片，以去除PDMS残留物。将芯片和九个盖玻片放入等离子清洗机中，用氧气等离子处理30秒，使表面形成共价键。
8. 取出芯片和盖玻片，将芯片的结构面贴合到盖玻片上。
9. 将贴合好的芯片放入80 °C的干燥烘箱中加热1小时，以增强键合强度。
10. 使用前对芯片进行高压灭菌，并在后续操作中保持无菌状态。

3. 表面修饰与水凝胶注射

1. 对于每个芯片，用移液器吸取 40 µL 的 1 mg/mL 多聚-D-赖氨酸（PDL），并从水凝胶注入口注入芯片的通道中。
   注意：确保 PDL 完全充满通道，特别是在靠近端口的狭窄通道中。
2. 将芯片在 37 °C 下孵育 4 小时，以修饰 PDMS 表面。
3. 用移液器吸取 200 µL 无菌水，并从水凝胶注入口注入芯片的通道中，以洗去 PDL。
4. 将芯片放入 120 °C 的干燥烘箱中 3 小时，以恢复其疏水性。
5. 将一支无菌离心管置于冰上，并根据以下公式计算所需 I 型胶原蛋白的体积。
   最终体积（50 µL）× 最终胶原蛋白浓度（本研究中为 3 mg/mL）/ 瓶中浓度 = 需添加的胶原蛋白体积
6. 根据以下公式计算所需 NaOH 的体积。
   （需添加的胶原蛋白体积）× 0.023 = 1 N NaOH 体积
7. 按照以下步骤在离心管中制备 50 µL 水凝胶：依次加入 5 µL 10× PBS、0.5 µL 酚红、计算量的 1 N NaOH、4 µL 1 mg/mL 纤连蛋白、计算量的 I 型胶原蛋白。然后加入适量的 dH₂O，使总体积达到 50 µL。充分混匀管中所有成分。
   注意：所有操作均需在冰上进行。使用酚红作为酸碱指示剂，辅助肉眼判断水凝胶的 pH 值。当 pH 值约为 7.4 时，最终水凝胶呈橙色，硬度约为 15 kPa⁴⁹。
8. 每个芯片用移液器吸取 2–3 µL 水凝胶，并从水凝胶注入口缓慢注入中央水凝胶通道。
9. 将芯片在 37 °C 下孵育 30 分钟，以完成凝胶化。
   ​注意：若芯片不立即使用，应将其密封于含 1 mL 无菌水的密闭容器中。密封后的芯片可在 37 °C 下最多保存 24 小时。

4. 细胞接种

1. 将20 µL浓度为125 µg/mL的纤连蛋白加入细胞培养通道的一个培养基注入孔中。
2. 用剪刀将移液枪头剪裁至适合细胞培养通道孔口的尺寸。
3. 将移液枪头插入细胞培养通道的另一个培养基注入孔中，然后抽出通道内的空气，使纤连蛋白充满整个通道。
4. 将芯片置于37 °C孵育1小时。
5. 接种细胞前，向每个培养基注入孔中加入20 µL ECM培养基，并将芯片在37 °C孵育30分钟。
6. 随后，用移液枪吸出所有培养基注入孔中的液体。
7. 接下来，将5 µL细胞悬液加入细胞培养通道的一个培养基注入孔中。在静水压差的作用下，内皮细胞将迅速铺展至整个通道。
   注：通过胰酶消化从培养瓶中获得人脐静脉内皮细胞（HUVECs），以400 × g离心后，将细胞重悬于缓冲液中，调整浓度至10⁷个细胞/mL。
8. 向另一侧孔中加入约4–6 µL ECM培养基，以调节静水压并阻止细胞移动。
9. 将芯片转移至细胞培养箱中，每30分钟翻转一次芯片，直至2小时后内皮细胞完全覆盖细胞培养通道的内表面（图1）。
   注：为使芯片倒置，可在盖玻片背面滴加少量水，使芯片可附着于培养皿盖上。
10. 使用移液枪头小心清除注入孔中附着的细胞。
11. 随后，将四个带倒刺的雌性鲁尔接头插入培养基注入孔中，并加入ECM培养基。
    ​注：这些接头可作为液体储液池，为通道内的细胞提供营养物质。
12. 将芯片放回细胞培养箱，每12小时更换一次鲁尔接头中的ECM培养基。

5. FITC-葡聚糖扩散通透性的测定

注意：为了评估微血管的屏障功能，需检测内皮细胞培养通道在有或无细胞衬层情况下的扩散通透性。

1. 取出已注入水凝胶的微流控出芽芯片。
2. 重复步骤 4.1–4.6。
3. 移除所有鲁尔接头，并用移液器吸出四个培养基注入孔中的全部培养基。
4. 将芯片放置于共聚焦激光扫描显微镜载物台上。
5. 向细胞培养通道的一个端口加入 5 µL 含有 500 µg/mL 40 kDa FITC-葡聚糖的培养基。
   注意：40 kDa FITC-葡聚糖的分子大小与 VEGF-165（39–45 kDa）相似。
6. 每 3 秒采集一次图像，持续 30 秒。由此测定无细胞衬里的扩散通透性。
7. 在细胞培养通道内 HUVECs 达到汇合状态后，取出微流控出芽芯片。
8. 重复步骤 5.3–5.5。
9. 每 3 秒采集一次图像，持续 30 秒。由此测定有细胞衬里的扩散通透性。
10. 通过量化荧光强度随时间的变化，使用以下修正公式计算扩散通透性系数⁵⁰。
    P_d = (I₂ - I₁) / ((I₁ - I_b)·Δt) ·S/d
    其中，P_d 为扩散通透性系数，I₁ 为初始时间点的平均荧光强度，I₂ 为经过时间增量（Δt）后的平均荧光强度，I_b 为背景荧光强度，S 为荧光图像中通道的面积，d 为荧光图像中微柱之间的总间距。本研究中，Δt 设为 9 秒。
    ​注意：由于芯片中荧光物质的扩散方向仅从内皮细胞通道向水凝胶通道单向进行，不同于在径向全方位扩散的圆形管状结构，因此本公式与原始公式⁵⁰ 略有不同。

6. 微流控系统设置

注意：本研究中的微流控系统由微型注射泵、电磁夹管阀、气泡捕获芯片、微流控芯片、微型蠕动泵和储液池组成。该系统的各个部分均可替换为具有相同功能的替代组件。

1. 气泡捕获芯片的制备
   注意：气泡捕获芯片用于在循环过程中去除气泡。该芯片由三层PDMS构成。顶层通过软光刻技术制成具有网格结构的液体腔室，网格结构的每个通道宽100 µm。底层是一块带孔的PDMS块。两层之间夹有一层100 µm厚的PDMS薄膜。
   1. 重复步骤1，制备气泡捕获芯片的硅片。
   2. 重复步骤2.1–2.5，制备气泡捕获芯片的顶层和底层。
      注意：顶层的光掩模包含三组图案，因此需根据图案将PDMS层切割成三个芯片。
   3. 使用3.5 mm穿孔器在顶层进样和出样通道末端打六个孔。
   4. 根据顶层的图案，使用6 mm穿孔器在底层相应位置打两个孔。
   5. 重复步骤2.1–2.2，制备10 g PDMS混合物，并将其倒入洁净硅片中心。
   6. 通过以下旋涂程序制备100 µm厚的PDMS薄膜：以500 rpm转速旋涂15秒，然后将转速升至1,300 rpm并保持45秒。
   7. 将硅片转移至预热至180 °C的加热板上，烘烤30分钟。
   8. 使用无残留胶带清洁打孔后的各层，以去除PDMS残留物。将顶层和硅片放入等离子清洗机中，用氧气等离子体处理30秒，使表面形成共价键。
   9. 取出顶层和硅片。将顶层的结构面贴附到PDMS薄膜上。
   10. 用针沿顶层边缘小心切割薄膜。
   11. 缓慢将薄膜从硅片上剥离，并将芯片翻转，使薄膜面朝上。
   12. 将底层和已贴附的芯片放入等离子清洗机中，再次用氧气等离子体处理30秒。
   13. 取出底层和已贴附的芯片。将底层贴附到PDMS薄膜上，完成气泡捕获芯片的制备。
       注意：贴附时需将底层的孔与顶层的图案对齐。
   14. 将芯片放入80 °C的干燥烘箱中加热1小时，以增强键合强度。
2. 组装微流控控制系统
   注意：系统中所有部件（如气泡捕获芯片、储液池、管路和连接器）均需经高压灭菌处理后使用，电子设备除外。在洁净台中组装微流控控制系统。
   1. 为组装微流控控制系统，准备两根聚四氟乙烯管、两根短硅胶管、三根长硅胶管、一个带倒刺的雌性鲁尔接头、一个Y型连接器和三个L型连接器。
      注意：聚四氟乙烯管的优点是弹性低，因此管路中所需的培养基较少；而硅胶管弹性高，因此适用于夹管阀和蠕动泵。
   2. 用预热至37 °C的ECM培养基填充10 mL注射器。
      注意：预热有助于培养基释放溶解的气体。
   3. 通过带倒刺的雌性鲁尔接头将一根聚四氟乙烯管连接至注射器，再将该管的另一端连接至Y型连接器。
   4. 接着，将两根长硅胶管分别连接至Y型连接器的另外两个端口，其中一根连接至储液池，另一根连接至气泡捕获芯片。
   5. 将另一根长硅胶管连接至储液池。
   6. 接着，使用两根短硅胶管连接气泡捕获芯片顶层的所有进样和出样孔，并将一根聚四氟乙烯管连接至芯片后端。
   7. 接着，将注射器固定在微量注射泵上。
   8. 将两根长硅胶管夹入电磁夹管阀中。
   9. 接着，切换电磁夹管阀，打开注射器与储液池之间的管路。使用微量注射泵向储液池注入培养基，以排出管路中的空气。
   10. 然后，再次切换阀门，打开注射器与气泡捕获芯片之间的管路。注入培养基，使液体腔室和芯片后端管路完全充满。

7. 内皮细胞出芽实验

注意：本研究使用装配有相差显微镜的台式培养箱，以实时观察出芽过程。台式培养箱可在显微镜载物台上维持温度、湿度和 CO₂ 的控制，适用于活细胞成像。但该设备并非本实验所必需。此处提供的实验方案同样可在基础细胞培养箱中进行。

1. 从细胞培养箱中取出内皮细胞出芽芯片。
2. 随后，移除细胞培养侧的鲁尔接头。将两个管塞插入微流控出芽芯片的水凝胶注射口。
   注意：管塞可由针头转换而来，其主要功能是防止培养基溢出。
3. 将气泡捕获芯片的后端管路连接至细胞培养通道的一个端口。
   注意：连接前确保管路中无气泡。
4. 在另一端口插入一个T型连接器，并将其连接至与储液器相连的长硅胶管。
5. 将长硅胶管固定到微型蠕动泵中。
6. 随后，在储液器中插入空气过滤器。
7. 接下来，将微流控出芽芯片安装至载台式培养箱。
8. 接着，使用TPU管将真空泵连接至气泡捕获芯片底层的孔洞。
9. 在自定义程序中设置循环体积和流速，该程序可同时控制微注射泵和电磁夹管阀（图2）。
   注意：内皮细胞培养通道中的流速根据经典公式计算：
   τ = 6µQ / Wh²
   其中，τ为剪切应力（dyn/cm²），µ为培养基黏度（8.8 × 10^-4 Pa•s），Q为内皮细胞培养通道中的流速（ml/s），h为通道高度（70 µm），W为通道宽度（1,000 µm）。培养基黏度使用同轴圆筒式旋转黏度计测定；通道高度和宽度为预设值，并通过4倍放大率的相差显微镜手动确认。根据计算，循环体积为5 mL，流速为85 µL/min（细胞培养通道内平均流速0.2 m/s），以实现15 dyn/cm²的剪切应力。
10. 接下来，设置微型蠕动泵的流速。
    注意：微型蠕动泵的流速应略高于微注射泵，以防止培养基溢出。
11. 启动微注射泵，从而建立循环控制系统。

8. 数据分析

注意：为了量化出芽情况，计算了标准化出芽面积、平均出芽长度和最长出芽长度。结果来自三项独立研究，以均值 ± 标准误表示。统计学显著性（P < 0.05）通过Student's检验进行评估 t-测试。

1. 实验结束后，使用含4%多聚甲醛的PBS溶液对微流控出芽芯片中的细胞和出芽结构固定15分钟。用DAPI（4′,6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐；1:1000；Sigma-Aldrich）染色细胞核10分钟，随后用TRITC标记的鬼笔环肽（P5285，1:100；Sigma-Aldrich）染色细胞骨架1小时。每步之间用PBS洗涤细胞，每次洗涤5分钟，共洗涤三次。
2. 以拼接模式采集芯片的共聚焦图像，并使用图像处理软件进行图像拼接。
3. 使用编程软件中的自定义代码，统计Z轴投影图像中荧光像素的数量，以量化标准化的出芽面积（参见补充文件）。
4. 在Z轴投影图像中手动识别并标记每个出芽的顶端，利用另一个自定义代码计算出芽顶端至内皮细胞基底膜之间的距离，以量化平均出芽长度和最长出芽长度（参见补充文件）。

结果

这 体外 用于模拟新生血管化初始事件（MIEN）的3D模型由微流控出芽芯片和微流控控制系统组成。该微流控出芽芯片是在先前发表的研究基础上优化而成^{22,23,37,40,51,52,53}简而言之，该装置包含三个通道和六个端口：一个内皮细胞培养通道和一个带有四个培养基注入端口的液体通道，以及一个中央水凝胶通道，配有两个水凝胶注入端口（图3）。微流控系统由一个微型注射泵、一个电磁夹管阀、一个气泡捕获芯片、一个微型蠕动泵和一个培养基储液器组成（图4）...

讨论

长期以来，对新生血管形成过程的实时观察一直是一个难题。近年来已开发出多种方法，用于构建由内皮细胞（ECs）衬覆并邻近细胞外基质、可发生出芽的灌注血管^{22,32,40,46,54}，但其力学微环境仍难以持续稳定维持。模拟内皮细胞所处的初始生物力学微环境仍是一项挑战，该环境通常具有较高的管腔剪切应力和较低的跨内皮流动速度。本文提出了一种MIEN模型，首次在模拟生理微环境中再现了新生血管形成的初始事件。利用该MIEN模型，实现了自动化、高效且无气泡的长期灌注。在保持跨内皮流动处于生理水平的同时，可在实验过程中随时选择性调节作用于内皮细胞的管腔剪切应力。

MIEN 模型的关键在于将管腔流对内皮细胞（ECs）的影响与跨内皮流动的影响分离开来。为此，创造性地在内皮细胞培养通...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.25% 胰蛋白酶-EDTA	Genview	GP3108
胶原蛋白 I，大鼠尾部来源	Corning	354236
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542
电磁式夹管阀	Wokun Technology	WK02-308-1/3
内皮细胞培养基（ECM）	Sciencell	1001
胎牛血清（FBS）	Every Green	NA
纤连蛋白	Corning	354008
FITC-葡聚糖	Miragen	60842-46-8
图形化编程环境	LabVIEW	NA
图像编辑软件	PhotoShop	NA
图像处理程序	ImageJ	NA
异丙醇	Sigma-Aldrich	91237
光刻设备	中国科学院光电技术研究所	URE-2000/35
甲醇	Sigma-Aldrich	82762
微型蠕动泵	Lead Fluid	BT101L
微注射泵	Lead Fluid	TYD01
氧气等离子体	MING HENG	PDC-MG
多聚甲醛	Sigma-Aldrich	P6148
PBS（10倍浓缩液）	Beyotime	ST448
永久性环氧负性光刻胶	Microchem	SU-8 2075
酚红钠盐	Sigma-Aldrich	P5530
聚二甲基硅氧烷（PDMS）	Dow Corning	Sylgard 184
聚-D-赖氨酸氢溴酸盐（PDL）	Sigma-Aldrich	P7886
聚四氟乙烯	Teflon	NA
程序软件	MATLAB	NA
重组人 VEGF-165	StemImmune LLC	HVG-VF5
氢氧化钠（NaOH）	Sigma-Aldrich	1.06498
载物台培养箱	Tokai Hit	NA
SU-8 显影液	Microchem	NA
三氯(1H,1H,2H,2H-全氟辛基)硅烷	Sigma-Aldrich	448931
TRITC 鬼笔环肽	Sigma-Aldrich	P5285