使用 MALDI 质谱成像进行代谢分析的示例准备

代谢物，代谢的中间体或最终产物，包括核苷酸、氨基酸或有机酸、脂质，是生物功能和过程的关键成分。代谢学，代谢物的研究，允许探索其生化相互作用，并理解其在基础、转化和临床研究中的作用。代谢物与生物体的表型密切相关，并提供细胞代谢过程中发生的生化活动^信息。因此，除了基因组学和益生术之外，代谢学已成为了解生理和病理条件的重要工具。例如，代谢学用于阐明现有药物背后的机制及其耐受性。在药物开发中，异生物代谢有助于评估不同物种代谢物的活动或毒性，后来转化为支持个性化药物^2。尽管代谢学的广泛应用，代谢物的成像可能具有挑战性，由于代谢物的化学反应性，结构异质性和广泛的浓度范围^3。然而，包括高能化合物、葡萄糖、乳酸盐、糖溶胶、五氯蔗分流通路和TCA循环中间体、磷脂、神经递质、信号化合物在内的阴唇代谢物的浓度，在组织酶在组织采集过程中活跃时，如脑收获^4、5、6中的死后缺血，可在几秒钟内发生变化，并在几分钟内取得进展.为确保准确的代谢数据采集，适当和仔细的样品准备是关键^7，8。目前已建立的测量代谢物的平台包括NMR、酶检测和质谱（包括液体和气体色谱），最后一个平台在下面进一步讨论。

MALDI-MSI 是一种最先进的技术，它允许通过检测单个分子物种来分析复杂的样品。MALDI MSI 使能够快速和可重复地测量生物样本中的各种分子化合物的好处。质谱成像进一步允许产生基于其复合代谢物的表示组织生物学的图像，同时保留样品⁹中代谢物的空间分布。MALDI 能够在不使用抗体标记、结构修饰或其他专用试剂（如用于免疫染色）的情况下检测样品中的分析物，再加上它在单个实验中监测数百个分子的能力，仅包括 MS 成像在代谢分析¹⁰方面授予的一些优势^{， 11}.除了常用的基质，如2，5-二氢苯二甲酸（DHB）和9-阿米诺阿克里丁（9-AA），最近发现了新的基质N-（1-纳芙yl）二氢二氢化二氢（NEDC），这是非常适合分析各种低分子量代谢物， 进一步改善了马尔迪MSI在代谢分析¹²中的应用。

尽管MALDI MSI的广泛应用，但仪器的高成本和实验程序的复杂性阻碍了其在个别研究实验室的广泛实施。因此，大多数 MALDI MSI 研究都通过共享的核心设施提供支持。样品制备，包括幻灯片制备和矩阵涂层，是 MALDI MSI 中最关键的一步。但是，幻灯片制备通常在个别研究人员的实验室进行，这为以后的 MALDI MSI 收购带来了潜在的变化。在这里，我们旨在提供一个详细的协议，为生物样本的样品准备之前，进行MALDI MSI测量，并使用发育小鼠大脑的代谢分析作为例子。

该协议遵循纽约城市大学高级科学研究中心（ASRC）机构动物护理和使用委员会（IACUC）的指导方针。

1. 收获组织

1. 准备铝船。准备一个长方形铝10厘米×20厘米，折叠在中间，使10厘米双层方形。将样品信息标记在一边，将另一侧折叠起来，形成一条底部表面约 4 厘米 x 4 厘米的船。
2. 在泡沫泡沫泡沫盒中的液氮（LN_2）上预制船。
   注:如果船太小，样品可能会从船上掉下来，并通过直接接触LN₂而变得过度冻结，这可能导致在冷冻过程中出现碎片。
3. 按照国际兽联的制度指南，通过宫颈错位对动物实施安乐死，立即解剖感兴趣的组织。
   1. 尽可能缩短动物麻醉和捕捉冻结之间的间隔，以尽量减少组织采集过程中代谢物的改变，特别是死后缺血导致大脑中的实验室代谢物。
      注:用磷酸盐缓冲盐水（PBS）灌注动物将增加缺血的持续时间，进一步改变阴唇代谢物的浓度，夸大人工结果。因此，不建议用 PBS 灌注或清洗组织，除非血液或体液的污染比单个项目的代谢物变质或洗涤更令人关注。
4. 立即将组织放入漂浮在液氮上的铝船上，关闭发泡胶盒的盖子，根据组织大小冷冻2-10分钟:产后第1天（P1）、P21、P60鼠脑分别冻结2分钟、5分钟、7分钟，P60大鼠大脑分别冻结10分钟。
   注意:不要长时间冻结组织（例如P1小鼠大脑5分钟），因为过度冷冻可能导致冷冻过程中组织碎片。
5. 用钳子取出船，折叠铝箔包裹纸巾，在干冰上运输，储存在-80°C，供以后使用。如果随后立即进行分割，将干冰上的样品带到低温状态。
   注:为了更好地保存代谢物，最好将样品储存在完整的组织中，并在进行 MALDI 成像之前将其分割。组织可在 -80 °C 中存储长达 24 个月。

2. 组织冷冻

注意:在处理氧化钛 （ITO） 幻灯片时，请随时戴上手套。避免直接呼吸到滑梯上或戴口罩（可选），以防止人唾液污染组织部分。

1. 在分割组织之前，收集与 MALDI 兼容的 ITO 涂层玻璃滑梯所需的数量。
2. 使用设置为电阻的伏特计测试幻灯片的导电性。标记电阻测量读取的侧面:这将是组织部分所坚持的侧面。务必将滑梯放在干净的纸巾上以避免污染。
3. 在设置为 -20 °C 的低温统计中预冷却幻灯片。
4. 如果从 -80 °C 中取出组织样本，则根据组织大小，让组织在低温室中均等约 45-60 分钟。如果样品从干冰中取出，则将其平衡约30分钟。
5. 用70%乙醇彻底清洁低温剂。预冷所有必要的工具，包括薄尖艺术家刷和钳子在低温室。
6. 根据组织类型设置低温室和标本头的温度:肝脏 -14 °C，肌肉 -20 °C，皮肤⁹-25 °C。
7. 使用冷冻组织嵌入化合物 OCT 将组织安装到夹头上，避免 OCT 从感兴趣的区域。
8. 将干净的刀片放在舞台和锁上。调整舞台位置和标本角度，实现所需的切割角度。
   注意:如果要切割不同类型的组织/基因型，请务必重新定位样本，以便使用刀片的清洁部分，或在切割下一个样本之前更改为新的刀片，以防止交叉污染。
9. 继续切割，直到发现感兴趣的区域（例如，大脑中的语料库）。请务必通过用在低温统计中平衡的艺术家画笔刷掉额外的作品来保持舞台清洁。
10. 一旦所需的区域被揭示出来，削减10-12μm厚度的较小部分。如果该部分容易剥落或脱落，则将低温统计器的温度提高，保持在 -22 °C 至 -11 °C 范围内。我们发现脑组织的最佳切割温度是 -15 °C 至 - 18 °C。
11. 一旦一个好的部分被切断，坚持它到ITO幻灯片（在低温室操作）。
12. 使用艺术家画笔尖将组织的一部分转移到 ITO 幻灯片上。
13. 将手指放在滑梯下加热部分，以确保安装安全。组织部分将首先在5-10s中变成透明，然后在大约30-60s中变成不透明。
14. 小心地将幻灯片放在低温统计器中。
15. 重复其他组织样本的步骤，确保组织的每一部分均匀地放置在幻灯片上，并尽可能对齐。
16. 由于 MALDI 目标最多可容纳两个幻灯片，请将来自同一组的多个样本的部分放置在单个幻灯片或两个幻灯片上，以确保可以同时分析它们。
17. 完成后，将 ITO 滑动放入真空箱中，并转移到带干燥剂的干燥器中。真空干燥滑梯 45-60 分钟。
    注意:如果实验室中没有真空干燥器，请一直将滑梯保持在 -20 °C 以下，以避免代谢物变质。
18. 幻灯片存储和运输:除非样本由 MALDI 成像核心设施准备，以便直接进行 MALDI 成像，否则将幻灯片存储在 -80 °C 或运送到干冰上的核心设施或其他 MALDI 研究实验室。
19. 为了最好地保存样品，将滑梯放入滑梯运输机中，用氮气（可选）填充，用准胶片密封，放入拉链袋中，然后放入另一个装有干燥剂的拉链袋中。给外拉链袋贴上标签。
20. 在 -80 °C（最多 6 个月）下继续储存或用足够的干冰运输。

3. 矩阵准备

1. 准备矩阵。
   注:所有试剂必须是 HPLC 等级。
   1. 以 10 毫克/mL 的浓度准备 NEDC。准备10 mL的基质溶解在溶剂70%甲醇（100毫克NEDC，7mL甲醇，3mL的H₂O）。
   2. 此外，还要准备额外的 10 mL 70% 甲醇:水溶液，以便在填充矩阵之前冲洗喷雾器系统。
2. 一旦幻灯片在步骤 2.17 中脱水，使用大胆的点银标记在组织部分外的玻璃滑梯空白处放置"X"标记，然后在银"X"顶部放置带有细点黑色标记的第二个"x"。黑色"X"与银色背景形成鲜明对比（大胆的银色"X"）稍后将作为 MALDI 仪器中后期质量光谱采集的受托标记。
3. 将滑梯加载到 MALDI 滑动金属目标中。使用塑料盖，将样品绘制到塑料盖上。留。
4. 使用平板扫描仪与 MALDI 目标一起扫描幻灯片图像。目标表面的螺丝将用作垫片，以防止扫描仪损坏或污染组织部分。在 16 位灰度和 2400 dpi 中预览和扫描选定的幻灯片区域。保存图像，以便以后在马尔迪 MSI 中使用。

4. 矩阵沉积

注:有多种方法将细晶体大小的均匀矩阵层应用于 MALDI 幻灯片，包括升华、滴喷墨打印、自动矩阵喷雾器和使用艺术家 airbush⁹的手动喷雾。我们将使用自动矩阵喷雾器作为本协议中高可重复性示例。

1. 启动:打开矩阵喷雾器单元，确保阀门位于 LOAD 位置并启动喷雾器软件。检查排气风扇是否运行良好。如果活性通风不能正常工作，请不要启动溶剂泵。
2. 在 Comms 选项卡上确认一切都在通信，然后以 0.1 mL/min 启动溶剂泵，背压为 ±500 psi（或 3.4 MPa）。
3. 通过将氮气罐设置为 30 psi 来开始压缩流向矩阵喷雾器的气流。然后，将喷雾器前部的压力调节器调整为 10 psi，并根据需要设置喷雾喷嘴温度。
   注意:如果祈祷中的气压低于 5 psi，喷雾喷嘴将无法加热以保护。
4. 由于阀仍在 负载 位置，请使用注射器用 7 mL 的 70% 甲醇冲洗环路，然后用 6 mL 矩阵填充环。
5. 将组织滑入喷雾器中的支架，将两端贴上胶带以防止移动，并保留无基质边缘，以避免矩阵对 MALDI 目标的金属夹子进行污染。
   注:强烈建议在进入珍贵样品幻灯片之前，先在空白显微镜幻灯片上测试矩阵喷雾。
6. 检查流量和温度是否稳定，开始喷洒。
7. 使用空白玻璃滑梯选择所需的方法进行预测试。
8. 按 开始。这将设置喷嘴温度并调整泵流量，以匹配所选方法。将阀门从 负载 切换到 喷雾 位置，然后通过单击 "继续"进行确认。
9. 允许系统运行，根据方法，每个幻灯片需要 5-20 分钟。将阀门从 喷雾切换 到 负载 位置，然后在完成后单击 "继续" 进行确认。
10. 从喷雾器中取出幻灯片，检查显微镜下矩阵涂层的图案，以确保细矩阵晶体的均匀层。
11. 矩阵沉积后，将幻灯片放入金属 MALDI 支架中立即使用。如果只有一个标本幻灯片，则添加另一个空白幻灯片以填充 MALDI 支架的两个空格。
12. 按照制造商的指示在使用后立即清理系统，以防止喷雾喷嘴堵塞。
13. 样品幻灯片涂上矩阵后，要么立即进入 MALDI 成像仪，要么使用第 2.19 步描述的相同双拉链袋制备，用干冰将其装运。
    注:在紧急情况下，如 MALDI 仪器不可立即使用，将涂层滑梯存放在真空状态或 -20 °C 下长达 24 小时，尽管某些代谢物的恶化可能发生在存储期间，但尚未彻底研究。

具有代表性的实验是根据 图1中显示的工作流程进行的。产后第1天、第21天、第60天（成人）发育的C57BL野型小鼠大脑按照CUNY IACUC指南采集，分别在漂浮在液氮上的铝船上冷冻2、5和7分钟。冷冻组织在标本头和腔室的 +15 °C 厚度段下冷冻。然后，组织低温被轻轻地转移到 ITO 涂层玻璃幻灯片的预冷却导电侧，以便进行 MALDI 成像。在室温下，ITO 幻灯片上的安装低温在真空中干燥 45 分钟，然后使用自动矩阵喷雾器进行矩阵沉积。矩阵 NEDC 用于检测代谢物，甲醇/水中（70/30 v/v）中 10 毫克/mL 的矩阵溶液以 0.1 mL/min 的流速沉积，喷嘴温度为 75 °C，用于 12 个周期，每个周期之间有 5 s 干燥。采用喷雾速度1300毫米/分钟，轨道间距2毫米，N2 气压10 psi，流速3L/min，喷嘴高度40毫米。

MALDI质量光谱由马尔迪飞行时间（TOF）MSI仪器以负离子模式获得。0.5-1 μL 的红磷（Pn 簇与 n = 1 - 90）甲醇乳液沉积到 ITO 幻灯片上，旁边安装的组织，并用于校准仪器在 100 -1000 m/z 质量范围内应用二次校准曲线13。激光点直径聚焦于 50μm 光刺宽度的"中等"调制光束轮廓。质量范围从 m/z 50 到 1000 的光谱以 1000 Hz 获得，用于 500 次拍摄。记录了质谱数据，并使用先进的 MALDI MSI 数据分析软件进一步分析了成像。离子图像生成时，根均值方块 （RMS） 正常化的垃圾箱宽度为 ±0.25 Da。

图2的结果显示，从每100道尔顿间隔中选择的M/z光谱MALDI MSI数据分析软件的输出图像，清楚地描绘了从小分子代谢物到高分子量脂质的光谱识别效用。每行都绘制各自的离子热图，包含产后第 1、21 和 60 天收集的三个组织中特定代谢物物种的空间和光谱信息。对于每个具有代表性的 m/z，可以使用区域分布和离子丰度分析来比较不同年龄的相应物种的相对数量。MALDI MSI 方法的一个优点是能够识别 m/z 识别的某些物种对发育里程碑或特定解剖结构的特异性。观察到一些代谢物在P1新生儿（m/z 320.1）中富集，在P60成人中富集（m/z 846.5），或在不同年龄（m/z 480.3）中均匀分布:其他分子物种特别富含灰质（m/z 117.1:524.3:765.1）、白质（m/z 673.4:846.5）或CSF/文特尔（m/z 239.0）（图2A）。代表性代谢物的空间分布，包括低氧酸（m/z 135.0）、N-乙酰-L-阿斯巴酸（m/z 174.0）、阿拉奇多尼奇 酸 （m/z 303.2）， 和几个脂质， 如利索法蒂莱他诺胺 LPE （18:1） （m/z 478.3）， LPE （20:4） （m/z 500.3）， LPE （22:6） （m/z 524.3）， 磷酸乙醇胺PE （44:: 10） （m/z 838.5），磷酸二醇PI（38:4）（m/z 885.6）也显示（图2B）。

图1。马尔迪-飞行时间（TOF）质谱成像的工作流程。 捕捉冷冻组织在低温统计中低温，并安装在 ITO 幻灯片上。→ 带组织部分的幻灯片使用自动矩阵喷雾器涂上细细的矩阵层。→质谱由马尔迪-托夫MSI仪器在20-200um的光泽中收集。→ 数据进行分析，并且使用先进的 MALDI MSI 数据分析软件生成图像。缩放栏:2 毫米。 请单击此处查看此图的较大版本。

图2。代表输出，选定的 m/z 光谱来自质谱学，以 50 μm 的横向分辨率获得。（A） 热图描绘了从P1、P21和P60确定的三个发育里程碑中每100道尔顿/z间隔中选择的特定代谢物物种的空间分布。（B） P1、P21和P60中代表性代谢物的空间分布，包括:低氧酸、N-乙酰-L-阿斯巴酸、阿拉奇多尼酸和不同脂质物种，如利索法蒂莱诺胺（LPE）、磷酸二醇胺（PE）、磷脂二醇（PI）。缩放栏，500 μm。请单击此处查看此图的较大版本。

作者声明没有相互竞争的经济利益。