Modellazione del cancro al seno nel tessuto mammario umano utilizzando un sistema microfisiologico
Summary
Questo protocollo descrive la costruzione di un sistema microfisiologico in vitro per lo studio del cancro al seno utilizzando il tessuto mammario umano primario con materiali di prima qualità.
Abstract
Il cancro al seno (BC) rimane una delle principali cause di morte per le donne. Nonostante oltre 700 milioni di dollari investiti nella ricerca BC ogni anno, il 97% dei farmaci BC candidati fallisce gli studi clinici. Pertanto, sono necessari nuovi modelli per migliorare la nostra comprensione della malattia. Il programma NIH Microphysiological Systems (MPS) è stato sviluppato per migliorare la traduzione clinica delle scoperte scientifiche di base e promettendo nuove strategie terapeutiche. Qui presentiamo un metodo per generare MPS per i tumori al seno (BC-MPS). Questo modello adatta un approccio precedentemente descritto di coltivare il tessuto adiposo bianco umano primario (WAT) incattando WAT tra fogli di cellule staminali derivate da adiposi (ASC). Nuovi aspetti della nostra BC-MPS includono la semina di cellule BC in tessuto mammario umano non danneggiato (HBT) contenente matrice extracellulare nativa, adipociti maturi, fibroblasti residenti e cellule immunitarie; e l’incastro dell’admixture BC-HBT tra fogli ASC derivati da HBT. Il BC-MPS risultante è stabile in coltura ex vivo per almeno 14 giorni. Questo sistema modello contiene più elementi del microambiente che influenzano BC tra cui adipociti, cellule stromali, cellule immunitarie e matrice extracellulare. Quindi BC-MPS può essere usato per studiare le interazioni tra BC e il suo microambiente.
Dimostriamo i vantaggi della nostra BC-MPS studiando due comportamenti BC noti per influenzare la progressione del cancro e la metastasi: 1) motilità BC e 2) crosstalk metabolico BC-HBT. Mentre la motilità BC è stata precedentemente dimostrata utilizzando l’imaging intravitale, BC-MPS consente l’imaging time-lapse ad alta risoluzione utilizzando la microscopia a fluorescenza per diversi giorni. Inoltre, mentre il crosstalk metabolico è stato precedentemente dimostrato utilizzando cellule BC e pre-adipociti murini differenziati in adipociti immaturi, il nostro modello BC-MPS è il primo sistema a dimostrare questo crosstalk tra adipociti mammari umani primari e cellule BC in vitro.
Introduction
Ogni anno, più di 40.000 donne negli Stati Uniti muoiono di cancro al seno (BC)1. Nonostante oltre 700 milioni di dollari investiti nella ricerca BC ogni anno, il 97% dei farmaci BC candidati fallisce gli studiclinici 2,3. Sono necessari nuovi modelli per migliorare la pipeline di sviluppo dei farmaci e la nostra comprensione di BC. Il programma NIH Microphysiological (MPS) ha delineato le caratteristiche necessarie per modelli rivoluzionari per migliorare la traduzione della scienza di base in successo clinico4. Questi includevano l’uso di cellule o tessuti umani primari, stabili in coltura per 4 settimane, e l’inclusione dell’architettura dei tessuti nativi e della risposta fisiologica.
Gli attuali modelli BC in vitro, come la coltura bidimensionale delle linee cellulari BC, la co-coltura dell’inserto a membrana e gli sferoidi tridimensionali e gli organoidi, non soddisfano i criteri delle MPS del NIH perché nessuno di questi riassume l’architettura nativa del tessuto mammario. Quando a questi sistemi viene aggiunta una matrice extracellulare (ECM), l’ECM mammario non viene utilizzato; invece, vengono utilizzati gel di collagene e matrici di membrana basale.
Gli attuali sistemi in vivo, come gli xenoinnesti derivati dal paziente (PDX), allo stesso modo non soddisfano i criteri delle MPS del NIH perché i tessuti mammari murini differiscono notevolmente dal seno umano. Inoltre, le interazioni sistema immunitario-BC sono sempre più riconosciute come chiave nello sviluppo tumorale, ma i modelli murini immunocompro compromessi utilizzati per generare tumori PDX mancano di cellule T mature, cellule B e cellule natural killer. Inoltre, mentre pdx consente di mantenere ed espandere i tumori del seno primario, i tumori PDX risultanti vengono infiltrati con cellule stromali murine primarie e ECM5.
Per superare queste sfide, abbiamo sviluppato una nuova MPS mammario umano tridimensionale, ex vivo, che soddisfa i criteri NIH MPS. Il fondamento della nostra MPS mammario è costituito dall’incastro del tessuto mammario umano primario (HBT) tra due fogli di cellule staminali derivate da adiposi (ASC), anche isolate dall’HBT(Figura 1). I pistoni per il trasferimento dei fogli cellulari per sandwich l’HBT può essere stampato in 3D o realizzato con semplici plastiche acriliche (Figura 1H, I). Questa tecnica adatta il nostro approccio precedentemente descritto per coltivare il tessuto adipocite bianco umano primario6,7. La MPS mammario può quindi essere seminata da un modello bc di scelta, che va dalle linee cellulari BC standard ai tumori al seno umani primari. Qui mostriamo che questi BC-MPS sono stabili in coltura per più settimane(Figura 2); includere elementi nativi dell’HBT come adipociti mammari, ECM, endotelio, cellule immunitarie (Figura 3); e ricapitolare le interazioni fisiologiche tra BC e HBT come il crosstalk metabolico (Figura 4). Infine, mostriamo che BC-MPS consente lo studio del movimento ameboide delle cellule BC in tutta l’HBT(Figura 5).
Protocol
Representative Results
Discussion
Sono necessari nuovi sistemi per modellare il cancro al seno umano per sviluppare una migliore comprensione della malattia. Lo sviluppo di sistemi microfisiologici umani per modellare le impostazioni delle malattie che includono ECM nativo e cellule stromali aumenterà il potere predittivo degli studi preclinici. Il modello BC-MPS qui presentato è un sistema di nuova sviluppo che supera i limiti dei modelli precedenti consente la valutazione di BC nel suo ambiente HBT nativo. Questo sistema può essere utilizzato con li…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vorremmo ringraziare il Tulane Flow Cytometry and Cell Sorting Core e il Tulane Histology Core per il loro supporto tecnico. Questo lavoro è stato supportato dal Southeastern Society of Plastic & Reconstructive Surgeons 2019 Research Grant e dalla National Science Foundation (EPSCoR Track 2 RII, OIA 1632854).
Materials
| Accumax | Innovative Cell Technologies | 1333 | Cell disassoication solution for separation of BC-MPS |
| Accutase | Corning | 25-058-CI | Cell detachment solution for passaging of cells |
| BioStor Container 16oz | National Scientific Supply Co | MPCE-T016 | For Transport of sterile tissue |
| Cell Culture 75 cm flasks | Corning | 430641U | For culturing ASCs |
| Conical Tubes 15mL | ThermoScientific | 339650 | |
| Curved Forceps | ThermoScientific | 1631T5 | For maneuvering tissue while mincing |
| DMEM low glucose, w/ Glutamax | Gibco | 10567-014 | For culturing ASCs and BC-MPS |
| FBS Qualified | Gibco | 26140-079 | |
| Gelatin | Sigma | G9391 | |
| HBSS 10x | Gibco | 14185-052 | |
| NaOH | Sigma | 221465 | |
| Nunc UpCell 6 well plates | ThermoScientific | 174901 | Top ASC cell sheet |
| PBS | Gibco | 10010-023 | |
| Pen/Strep 5,000U | Gibco | 15070-063 | |
| Petri Dish 150 cm | FisherBrand | FB0875714 | For holding tissue while mincing |
| Razor Blades | VWR | 55411-055 | Single Edge for mincing tissue |
| Strainer 250um | ThermoScientific | 87791 | For separation of BC-MPS |
| Tissue Culture 6 well plates | Corning | 3506 | Bottom ASC cell Sheet |
| Weights/Washers | BCP Fasteners | BCP672 | For weighing plungers down 1/2" inner diameter |
References
- DeSantis, C. E., et al. Breast cancer statistics, 2019. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 69 (6), 438-451 (2019).
- . NIH Categorical Spending -NIH Research Portfolio Online Reporting Tools (RePORT) Available from: https://report.nih.gov/categorical_spending.aspx (2020)
- Wong, C. H., Siah, K. W., Lo, A. W. Estimation of clinical trial success rates and related parameters. Biostatistics. 20 (2), 273-286 (2019).
- Sutherland, M. L., Fabre, K. M., Tagle, D. A. The National Institutes of Health Microphysiological Systems Program focuses on a critical challenge in the drug discovery pipeline. Stem Cell Research & Therapy. 4, 1 (2013).
- Wang, X., et al. Breast tumors educate the proteome of stromal tissue in an individualized but coordinated manner. Science Signaling. 10 (491), (2017).
- Lau, F. H., et al. Sandwiched white adipose tissue: A microphysiological system of primary human adipose tissue. Tissue Engineering. Part C, Methods. 24 (3), 135-145 (2018).
- Scahill, S. D., Hunt, M., Rogers, C. L., Lau, F. H. A microphysiologic platform for human fat: sandwiched white adipose tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), e57909 (2018).
- Yu, G., et al. Adipogenic differentiation of adipose-derived stem cells. Adipose-Derived Stem Cells. 702, 193-200 (2011).
- Bunnell, B., Flaat, M., Gagliardi, C., Patel, B., Ripoll, C. Adipose-derived stem cells: Isolation, expansion and differentiation. Methods. 45 (2), 115-120 (2008).
- Ebara, M., Hoffman, J. M., Stayton, P. S., Hoffman, A. S. Surface modification of microfluidic channels by UV-mediated graft polymerization of non-fouling and ‘smart’ polymers. Radiation Physics and Chemistry. 76 (8-9), 1409-1413 (2007).
- Lin, J. B., et al. Thermo-responsive poly(N-isopropylacrylamide) grafted onto microtextured poly(dimethylsiloxane) for aligned cell sheet engineering. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 99, 108-115 (2012).
- Turner, W. S., Sandhu, N., McCloskey, K. E. Tissue engineering: Construction of a multicellular 3D scaffold for the delivery of layered cell sheets. Journal of Visualized Experiments. (92), e51044 (2014).
- Tinkercad. Create 3D digital designs with online CAD. Tinkercad. , (2020).
- Halfter, K., Mayer, B. Bringing 3D tumor models to the clinic – predictive value for personalized medicine. Biotechnology Journal. 12 (2), (2017).
- Wang, Y. Y., et al. Mammary adipocytes stimulate breast cancer invasion through metabolic remodeling of tumor cells. JCI insight. 2 (4), 87489 (2017).
- Qiu, B., Simon, M. BODIPY 493/503 staining of neutral lipid droplets for microscopy and quantification by flow cytometry. Bio-Protocols. 6 (17), 1912 (2016).
- Fotos, J. S., et al. Automated time-lapse microscopy, and high-resolution tracking of cell migration. Cytotechnology. 51 (1), 7-19 (2006).
- Barry, D. J., Durkin, C. H., Abella, J. V., Way, M. Open source software for quantification of cell migration, protrusions, and fluorescence intensities. Journal of Cell Biology. 209 (1), 163-180 (2015).
- Akiyama, Y., Kikuchi, A., Yamato, M., Okano, T. Ultrathin poly(N-isopropylacrylamide) grafted layer on polystyrene surfaces for cell adhesion/detachment control. Langmuir: the ACS Journal of Surfaces and Colloids. 20 (13), 5506-5511 (2004).
- Shingyochi, Y., Orbay, H., Mizuno, H. Adipose-derived stem cells for wound repair and regeneration. Expert Opinion on Biological Therapy. 15 (9), 1285-1292 (2015).
- Tokunaga, M., et al. Fat depot-specific gene signature and ECM remodeling of Sca1(high) adipose-derived stem cells. Matrix Biology: Journal of the International Society for Matrix Biology. 36, 28-38 (2014).
- Belgodere, J. A., et al. Engineering breast cancer microenvironments and 3D bioprinting. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 66 (2018).
- Cao, Y. Adipocyte and lipid metabolism in cancer drug resistance. The Journal of Clinical Investigation. 129 (8), 3006-3017 (2019).
- Dirat, B., et al. Cancer-associated adipocytes exhibit an activated phenotype and contribute to breast cancer invasion. 癌症研究. 71 (7), 2455-2465 (2011).
- Druso, J. E., Fischbach, C. Biophysical properties of extracellular matrix: Linking obesity and cancer. Trends in Cancer. 4 (4), 271-273 (2018).
- Luo, H., Tu, G., Liu, Z., Liu, M. Cancer-associated fibroblasts: A multifaceted driver of breast cancer progression. Cancer Letters. 361 (2), 155-163 (2015).
- Chandler, E. M., et al. Implanted adipose progenitor cells as physicochemical regulators of breast cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (25), 9786-9791 (2012).
- Oskarsson, T. Extracellular matrix components in breast cancer progression and metastasis. The Breast. 22, 66-72 (2013).
- Liu, J., et al. Collagen 1A1 (COL1A1) promotes metastasis of breast cancer and is a potential therapeutic target. Discovery Medicine. 25 (139), 211-223 (2018).
- Ahfeldt, T., et al. Programming human pluripotent stem cells into white and brown adipocytes. Nature Cell Biology. 14 (2), 209-219 (2012).
- Volz, A. -. C., Omengo, B., Gehrke, S., Kluger, P. J. Comparing the use of differentiated adipose-derived stem cells and mature adipocytes to model adipose tissue in vitro. Differentiation; Research in Biological Diversity. 110, 19-28 (2019).
- Zimta, A. A., et al. Molecular links between central obesity and breast cancer. International Journal of Molecular Sciences. 20 (21), 5364 (2019).
- Bousquenaud, M., Fico, F., Solinas, G., Rüegg, C., Santamaria-Martínez, A. Obesity promotes the expansion of metastasis-initiating cells in breast cancer. Breast Cancer Research. 20 (1), 104 (2018).
- Robado de Lope, L., Alcíbar, O. L., Amor López, A., Hergueta-Redondo, M., Peinado, H. Tumour-adipose tissue crosstalk: fuelling tumour metastasis by extracellular vesicles. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 373 (1737), 20160485 (2018).
- Insua-Rodríguez, J., Oskarsson, T. The extracellular matrix in breast cancer. Advanced Drug Delivery Reviews. 97, 41-55 (2016).
- Sabol, R. A., et al. Leptin produced by obesity-altered adipose stem cells promotes metastasis but not tumorigenesis of triple-negative breast cancer in orthotopic xenograft and patient-derived xenograft models. Breast Cancer Research: BCR. 21 (1), 67 (2019).
- Cui, X. D., Gao, D. Y., Fink, B. F., Vasconez, H. C., Pu, L. L. Q. Cryopreservation of human adipose tissues. Cryobiology. 55 (3), 269-278 (2007).
- Skardal, A., Shupe, T., Atala, A. Organoid-on-a-chip and body-on-a-chip systems for drug screening and disease modeling. Drug Discovery Today. 21 (9), 1399-1411 (2016).
- Clark, A. M., Allbritton, N. L., Wells, A. Integrative microphysiological tissue systems of cancer metastasis to the liver. Seminars in Cancer Biology. , (2020).
