本方案描述了一种利用现成材料和原代人乳腺组织构建体外微生理系统以研究乳腺癌的方法。
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摘要
摘要
乳腺癌（BC）仍然是导致女性死亡的主要原因。尽管每年在乳腺癌研究上的投入超过7亿美元，但97%的候选药物在临床试验中失败。因此，需要新的模型来加深对这种疾病的理解。美国国立卫生研究院（NIH）微生理系统（MPS）计划旨在提高基础科学发现和有前景的新治疗策略向临床应用的转化效率。本文介绍一种用于构建乳腺癌微生理系统（BC-MPS）的方法。该模型改进了先前描述的一种方法，即通过将白色脂肪组织（WAT）夹在脂肪来源的干细胞片（ASC）之间来培养原代人白色脂肪组织（WAT）。本BC-MPS的创新之处在于：将乳腺癌细胞接种到含有天然细胞外基质、成熟脂肪细胞、定居的成纤维细胞和免疫细胞的非病变人乳腺组织（HBT）中；再将乳腺癌与HBT的混合物夹在来源于HBT的ASC细胞片之间。所构建的BC-MPS在体外培养中至少可稳定维持14天。该模型系统包含了影响乳腺癌的多种微环境成分，包括脂肪细胞、基质细胞、免疫细胞以及细胞外基质。因此，BC-MPS可用于研究乳腺癌与其微环境之间的相互作用。
我们通过研究两种已知会影响癌症进展和转移的乳腺癌（BC）行为来展示本研究中BC-MPS的优势：1）乳腺癌细胞的运动性；2）乳腺癌细胞与人乳腺脂肪组织（HBT）之间的代谢串扰。尽管此前已通过活体成像技术展示了乳腺癌细胞的运动性，但BC-MPS系统能够利用荧光显微镜实现持续数天的高分辨率时间序列成像。此外，虽然代谢串扰此前曾通过乳腺癌细胞与小鼠前脂肪细胞分化为未成熟脂肪细胞的共培养模型得以证实，但我们的BC-MPS模型是首个在体外展示原代人乳腺脂肪细胞与乳腺癌细胞之间存在此类代谢串扰的系统。
引言
每年，美国有超过 40,000 名女性死于乳腺癌（BC）1。尽管每年在乳腺癌研究上的投入超过 7 亿美元，但 97% 的候选乳腺癌药物在临床试验中失败2,3。迫切需要建立新的模型，以改善药物研发流程并加深对乳腺癌的理解。美国国立卫生研究院微生理系统（MPS）计划明确了突破性模型所需具备的特征，以促进基础科学向临床成功的转化4。这些特征包括使用原代人源细胞或组织、在培养中稳定维持 4 周、并包含天然组织结构和生理反应。
目前的体外乳腺癌模型，例如乳腺癌细胞系的二维培养、膜插件共培养以及三维球状体和类器官，均不符合美国国立卫生研究院（NIH）的微生理系统（MPS）标准，因为这些模型均未能重现天然乳腺组织的结构。当在这些系统中添加细胞外基质（ECM）时，并未使用乳腺来源的ECM，而是采用胶原凝胶和基底膜基质。
目前的体内系统，例如患者来源的异种移植模型（PDX），同样不符合美国国立卫生研究院（NIH）的微生理系统（MPS）标准，因为小鼠乳腺组织与人类乳房存在显著差异。此外，免疫系统与乳腺癌之间的相互作用在肿瘤发生过程中日益被认为至关重要，但用于构建PDX肿瘤的免疫缺陷型小鼠模型缺乏成熟的T细胞、B细胞和自然杀伤细胞。....
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方案
所有人体组织均根据路易斯安那州立大学健康科学中心机构审查委员会批准的方案 #9189 进行收集。
1. 脂肪来源干细胞（ASCs）细胞片的接种
- 从商业渠道购买ASCs，或按照既定方案从原代人乳腺组织中分离获取8,9. 以70%密度接种人乳腺脂肪来源干细胞（ASCs）（约80,000个细胞/cm²）2 将细胞以适当的密度接种于6孔标准组织培养板中，培养基为添加10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）（BC-MPS培养基）。用于制备细胞片的脂肪来源干细胞（ASCs）代数应低于第10代。
- 为制备每孔乳腺癌微生理系统（BC-MPS），需在1个标准组织培养孔及1个尺寸相似的聚（N-异丙基丙烯酰胺）（pNIPAAm）涂层组织培养塑料板孔中接种细胞。每块6孔BC-MPS需使用1块标准6孔组织培养板（底部）和1块pNIPAAm涂层板（顶部）。pNIPAAm板可从商业渠道购买，也可在实验室自行包被。10,11,12.
- 在37 °C、5% CO₂的....
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结果
培养过程中的稳定性
BC-MPS 是一种稳定的微生理系统，可在体外培养至少14天。在100倍放大倍数下拍摄ASC细胞片的明场图像，以显示融合细胞片的条纹状结构（图2A）。ASC细胞片在培养中至少可保持稳定4周。在6孔板的一个孔中培养14天后的BC-MPS使用彩色相机成像，结果显示漂浮的HBT仍通过ASC细胞片稳定锚定在孔底（图2B）。这表明用于夹持脂肪组织的细胞片仍然完整。表达RFP的三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231在HBT中培养14天后，通过荧光显微镜成像，显示BC-MPS与细胞系共培养至少14天仍保持稳定（图2C）。组织中乳腺癌细胞的存在表明癌细胞具有侵袭HBT的能力。将来自小鼠的三阴性PDX组织块切除后，用Cell Tracker CMTPX染色，并与HBT共同培养。在第6天进行荧光显微镜成像，以显示BC-MPS与肿瘤组织块共培养至少6天的稳.......
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讨论
为了更好地理解乳腺癌疾病，亟需开发新的系统来模拟人类乳腺癌。构建包含天然细胞外基质（ECM）和间质细胞的疾病模型的人源微生理系统，将提高临床前研究的预测能力。本文介绍的BC-MPS模型是一种新开发的系统，克服了以往模型的局限性，能够在原生人乳腺组织（HBT）环境中评估乳腺癌（BC）。该系统既可使用癌细胞系，也可使用肿瘤外植体，且至少可稳定维持14天。通过荧光标记乳腺癌细胞，可实时或在特定时间点观察癌细胞的运动性、细胞间相互作用、迁移、存活率或增殖情况（图3 和 图5）。该模型系统可用于阐明与癌细胞及其微环境之间相互作用相关的癌症生物学重要机制。对该系统的深入研究有助于揭示肿瘤微环境（TME）对癌症进展、药物反应以及转移起始的调控作用。
为了成功建立该系统，需要遵循几个关键步骤。第一个关键步骤是ASC细胞片的培养与转移。经pNIPAAm包被的培养板具有温度敏感性。当培养板温度高于32 °C时，其表面呈疏水性，ASC细胞会附着于表面；当温度低于此阈值时，表面变为亲水性.......
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披露
作者声明不存在任何竞争利益。
致谢
我们感谢杜兰大学流式细胞术与细胞分选核心实验室以及杜兰大学组织学核心实验室提供的技术支持。本研究由美国东南部整形外科协会资助 & 重建外科医生2019年研究基金以及美国国家科学基金会（EPSCoR Track 2 RII，OIA 1632854）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Accumax | Innovative Cell Technologies | 1333 | 用于分离乳腺癌-间充质干细胞（BC-MPS）的细胞解离液 |
| Accutase | Corning | 25-058-CI | 用于细胞传代的细胞脱离溶液 |
| BioStor Container 16oz | National Scientific Supply Co | MPCE-T016 | 用于无菌组织的运输 |
| 细胞培养瓶 75 cm² | Corning | 430641U | 用于ASCs的培养 |
| 锥形管 15 mL | ThermoScientific | 339650 | |
| 弯头镊子 | ThermoScientific | 1631T5 | 用于组织切碎过程中的组织操作 |
| DMEM低糖培养基，含Glutamax | Gibco | 10567-014 | 用于ASCs和BC-MPS的培养 |
| 经鉴定合格的胎牛血清（FBS） | Gibco | 26140-079 | |
| 明胶 | Sigma | G9391 | |
| HBSS 10倍浓缩液 | Gibco | 14185-052 | |
| NaOH | Sigma | 221465 | |
| Nunc UpCell 6孔板 | ThermoScientific | 174901 | 用于顶部ASC细胞片层 |
| PBS | Gibco | 10010-023 | |
| 青霉素-链霉素溶液（5,000 U） | Gibco | 15070-063 | |
| 培养皿 150 mm | FisherBrand | FB0875714 | 用于组织切碎时盛放组织 |
| 剃刀刀片 | VWR | 55411-055 | 单刃，用于组织切碎 |
| 筛网 250 µm | ThermoScientific | 87791 | 用于分离BC-MPS |
| 组织培养6孔板 | Corning | 3506 | 用于底部ASC细胞片层 |
| 配重/垫圈 | BCP Fasteners | BCP672 | 用于压紧活塞，内径1/2" |
参考文献
- DeSantis, C. E., et al. Breast cancer statistics, 2019. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 69 (6), 438-451 (2019).
- NIH Categorical Spending -NIH Research Portfolio Online Reporting Tools (RePORT). , Available from: https://report.nih.gov/categorical_spending.aspx (2020).
- Wong, C. H., Siah, K. W., Lo, A. W.
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