呼吸系统同步病毒病毒特定核胶囊的生成和组装

摘要

为了深入分析呼吸道同步病毒 （RSV） RNA 合成，我们报告了利用伴生磷蛋白 （P） 共同表达无RNA核蛋白 （N^0）的协议，用于病毒特定核胶囊 （NCs） 的后续 体外 组装。

摘要

使用正宗的RNA模板对于推进病毒RNA合成的基本知识至关重要，该知识可以指导机械发现和病毒学的检测发展。非受教负感 （NNS） RNA 病毒（如呼吸道同步病毒 （RSV））的 RNA 模板不是单单 RNA 分子，而是核蛋白 （N） 封装核糖核蛋白复合物。尽管正宗RNA模板很重要，但这种核糖核蛋白复合物的生成和组装仍然复杂，需要深入阐明。主要的挑战是，过度表达的RSV N非具体地与细胞RNA结合，形成随机核胶囊状粒子（NCLPs）。在这里，我们建立了一个协议，通过与伴郎磷蛋白 （P） 共同表达 N，然后用 RNA 寡头与 RSV 特异性 RNA 序列组装 N⁰来获得无RNA N （N^0），以获得病毒特异性核胶囊 （NCs）。该协议展示了如何克服在准备这个传统上具有挑战性的病毒核糖蛋白复合物的困难。

引言

非隔离性负感（NNS）RNA病毒包括许多重要的人类病原体，如狂犬病、埃博拉和呼吸道同步病毒（RSV）1、2。RSV^{是导致全球}幼儿和老年人患支气管炎和肺炎等呼吸系统疾病的主要原因。目前，没有有效的疫苗或抗病毒疗法可用于预防或治疗RSV^4。作为生命周期的一部分，RSV基因组作为RSV RNA依赖RNA聚合酶复制的模板，以产生抗原体，而抗基因组又充当生成后代基因组的模板。基因组和抗基因组RNA都完全被核蛋白（N）封装，形成核胶囊^{（NCs）3。}由于NC是RSV聚合酶复制和转录的模板，因此适当的NC组装对于聚合酶获得RNA合成⁵的模板至关重要。有趣的是，根据NNS病毒聚合酶的结构分析，假设几个N蛋白暂时脱离NC，允许聚合酶进入，并在RNA合成^{6、7、8、9、10、11、12}后重新绑定RNA。

目前，RSV RNA聚合检测已建立使用纯化RSV聚合酶短裸RNA模板^13，14。然而，RSV聚合酶的活动没有达到最佳水平，正如RSV聚合酶在使用裸RNA模板时产生的非加工和流产产品中观察到的。缺乏带有病毒特异性RNA的NC是进一步机械化地理解RSV RNA合成的主要障碍。因此，使用正宗的RNA模板成为推进RSV RNA合成基础知识的关键需要。来自RSV和其他NNS RNA病毒的核胶囊状粒子（NCLPs）的已知结构显示，NCLP中的RNA要么是随机细胞RNA，要么是平均病毒基因组RNA15、16、17、18、19。总之，主要障碍是，当N在主机单元中表达过度时，N与细胞RNA结合，形成NCLP。

为了克服这一障碍，我们建立了一个协议，首先获得无RNA（N^0），并组装N⁰ 与正宗的病毒基因组RNA到NCLP^20。该协议的原则是获得大量的重组RNA无N（N^0）通过共同表达N与伴郎，RSV磷蛋白（P_NTD）的N终端域。纯化的 N⁰P 可以通过添加 RSV 特异性 RNA 寡头来刺激并组装成 NCLP，在组装过程中，伴郎 P_NTD 在添加 RNA 寡头后会被移位。

在这里，我们详细说明了 RSV 特定 RNA 特定 NC 的生成和组装协议。在此协议中，我们描述了分子克隆、蛋白质制备、 体外 组装和复杂组件的验证。我们强调克隆策略，为分子克隆的蛋白质共表达生成双柠檬结构。在蛋白质制备方面，我们描述了细胞培养、蛋白质提取和蛋白质复合物的纯化过程。然后，我们讨论RSV RNA特定NC的 体外 组装方法。最后，我们使用大小排除色谱 （SEC） 和负污渍电子显微镜 （EM） 来描述和可视化组装的 NCLP。

方案

1. 分子克隆

注:利气独立克隆（LIC）用于制造RSV双语气联表达构造质粒。LIC是一种在20世纪90年代初开发的方法，它利用T4DNA聚合酶的3'-5'Exo活性来制造载体和DNA插入^21，22之间的互补性悬垂。构造使用 2BT-10 矢量 DNA 进行，该 DNA 由他在开放读取帧 （ORF） （图 1）N 端的标记组成。

1. 使用 SSPI 消化对 LIC 矢量进行线性化。
   1. 结合 10 μL 的 SSPI 10X 缓冲器、浓度为 5 U/μL 的 4 μL SSPI 酶、相当于 5 μg 的矢量迷你准备脱氧核糖核酸和无菌 ddH₂O 至 100 μL。
   2. 在37°C下孵化消化3小时。
   3. 在1.0%的蔗糖凝胶上运行摘要，以提取载体DNA。
   4. 使用凝胶提取套件进行提取和净化。将矢量DNA的最终体积暂停在ddH₂O的30μL中，并将其存储在-20°C。
2. _使用N_1-391转发引物、N_1-391反向引物、P 1-126 转发引物和 P 1-126 反向引物（表 1）为 N_1-391和 P_1-1-126准备 DNA 插入。
   注意:与线性向量有足够重叠，可确保熔化温度在 55 °C 至 60 °C 之间。 对于反向引号，出于同样的原因，与线性向量的反向互补链存在足够的重叠。
   1. 使用 表 2 和表 3中的条件对 DNA 插入进行 PCR 放大。
   2. 提取放大的DNA插入。在 1.0% 的蔗糖凝胶上运行前一步的 PCR 产品，然后通过凝胶提取提取和净化带状物。将提取的DNA的最终体积暂停在 15 μL 的 ddH₂O 中。
3. T4DNA聚合酶处理载体并插入DNA（表4）。
   注:必须分别对载体DNA和插入DNA进行治疗。
   1. 在室温下将混合物孵育40分钟。然后，在 75 °C 时将聚合酶灭活 20 分钟。将反应混合物储存在-20°C。
4. 安妮尔的LIC矢量和插入载体。
   1. 使用 2μL 的 LIC 矢量 DNA 和 2 μL 的无菌 ddH₂O 设置负控。
   2. 将 2μL 插入脱氧核糖核酸和 2 μL 的 LIC 矢量 DNA 从以前的 T4 DNA 聚合酶反应中组合在 0.2 mL 管中。
   3. 在室温下执行10分钟的退化反应。
   4. 在浓度为 25 mM 时用 1.3μL 的 EDTA 淬气反应。
   5. 将反应转化为100μL的大肠杆菌Top10称职细胞，并把它们放在安培林选择板^23，24上。
5. 识别正构造。
   1. 准备质粒迷你预备解决方案。这可以通过LB介质中的菌落采摘和接种来完成。通常，3个殖民地就足够了。
   2. 在37°C下连夜孵化混合物。
   3. 将混合物在 4，560 x g 中分化 10 分钟，然后丢弃超母体。
   4. 将颗粒重新喷入 250 μL 的 P1 缓冲区，并使用旋转迷你准备套件准备质粒迷你准备。
   5. 使用 AseI 或其他限制酶对迷你prep产品进行消化分析。
   6. 将样品装载在 0.8% 的蔗糖凝胶上，并运行消化的质粒。分析紫外线灯下的凝胶。
   7. 使用测序服务验证正产品的顺序。
6. 获取联合表达DNA插入。
   1. 使用先前构建_{的 2BT-10 N 1-391}和 2BT-10 P 1-126 作为模板执行 PCR 以获取 N_1-391和 P_1-126。
   2. 执行第 1^个PCR，使用表 2 中的 PCR 条件，使用 N_1-391转发引因器和反向引件 5 ́-GTGAGACTGTCTGGCCCCCG，从 2BT-10 N 1-391 构造中获取 N _1-391
      CGCGCGCGC加特克-3 ́。
   3. 使用前置引号:5'-CCGCATCATCATCATCATCCTCTC获得P_{1-126从2BT-10 P 1-126构造中获取P 1-126}
      AGGACTC加塔加-3 ́和P_1-126 反向引座（在 表2 和 表3中使用PCR条件）。
   4. 最后，对前2个PCR反应的混合产品执行重叠PCR，以合并N_1-391和P_1-126。使用 N_1-391前向引金和 P_1-126反向引金。在表 5 和表 6中使用 PCR 条件。
7. 加入载体和DNA插入。
   1. 按照第 1.3 步的协议，使用 T4 DNA 聚合酶处理重叠的 PCR 产品。
   2. 按照第 1.4 步的协议，对 LIC 矢量和 PCR 产品进行安妮化。
   3. 在第 1.5 步中确定协议下的正构造。

2. 蛋白质表达和纯化

注意:使用 大肠杆菌 进行N和P两种培养细胞在37°C的联位的双语制构造，但在一夜之间在降低温度（16°C）时进行表达。通过钴柱、离子交换和大小排除色谱（图2）的组合来净化蛋白质复合物。

1. 使用 大肠杆菌 BL21（DE3）菌株进行蛋白质生产。在LB（卢里亚兄弟）介质中以37°C增长4L细胞培养，直到OD₆₀₀ 达到0.6。
2. 将温度降低到 16 °C。 一小时后，用0.5 m异丙基1-硫-D-加拉托皮拉诺赛德（IPTG）在一夜之间诱导表达。
3. 将细胞在4，104 x g中离心25分钟，然后丢弃超母细胞。
4. 将细胞颗粒重新喷入 200 mL 的裂解缓冲器 A （50 mM 磷酸钠、pH 7.4、500 mM NaCl、5m 肌酰胺佐尔、10% 甘油和 0.2% NP40）中。使用 50 毫升的裂解缓冲器从 1 升细胞培养物中补充细胞颗粒。
5. 通过声波化将细胞酶化15分钟、3秒开和3秒。然后离心机在37，888 x g40分钟。
   注意:在 -80 °C 冰柜中发出声波之前，可以通过冻结细胞来暂停协议。
6. 将超自然物加载到钴重力柱中（直径 x 长度:2.5 厘米 x 10 厘米），用 5-10 列卷 （CV） 裂解缓冲器预先平衡约 10mL 的珠子。
7. 用 5 CV 缓冲器 B （50 mM 特里斯 - HCl pH 7.4） 清洗列， 1 M 纳克、10% 甘油、5 m 米米达佐尔）和 5 CV 缓冲 C （50 mM 特里斯-HCl pH 7.4、500 mM 纳克、10% 甘油和 5 m m 伊米达佐尔）。
8. 使用缓冲 D 的 2 CV（50 mM 特里斯-HCl pH 7.4、500 mM 纳克和 250 mM 伊米达佐尔）从珠子中分离蛋白质。
9. 用Q柱的Q缓冲（50m Tris-HCl pH 8.0，5%甘油）稀释elute蛋白5倍。
10. 用 QA 缓冲器清洗 5 mL 的 Q 列以平衡柱，然后使用永久泵（如兔子）将稀释的样品加载到 Q 列中。
11. 将 Q 列与 QA 缓冲器和 QB 缓冲区一起加载到 HPLC 机器中（50 mM 三重-HCl pH7.4、1.5 M NaCl、5% 甘油）。将流速设置为 1 mL/分钟。
12. 运行"泵洗"程序，使用 QB 缓冲区清洗机器，然后是 QA 缓冲区（1-2 CV/每个）。将系统流量设置为 3 mL/分钟。
13. 将紫外线设置为 280 nm，将紫外线设置为 260 nm。使用 96 深井板收集分数。
14. 使用弹性剂 （QB 缓冲器） 的阶梯级应用每个浓度的 3-4 CV 的 Elute 蛋白质，每次从 0% QB 开始将百分比增加 5%。N⁰P蛋白复合物将在15%QB缓冲区出来。
15. 一旦所有的蛋白质都被稀释，用100%QB缓冲区（2 CV）清洗柱子。
16. 通过凝胶过滤分离蛋白质 Superdex 200 增加 10/300 GL 柱（直径 x 长度:1.0 厘米 x 30 厘米），并与缓冲 E（20 mM HEPES pH 7.4 和 200 mM NaCl）等于一体。
17. 通过 SDS-PAGE 分析含蛋白质分数。

3. 病毒特异性NC的体外组装

注:RSV 特定 NC （N:RNA） 的 体外 组装通过用 RNA 寡头孵育已准备好的 N⁰P 复合物来执行。然后，SEC色谱用于将装配复合物与N⁰P和多余的RNA（图2）分开。

1. 混合和孵育纯化的N⁰P复合物与RNA寡头与分子比1:1.5在室温下1小时，通常1 mL的蛋白质N⁰P浓度为1毫克/mL就足以为下一步。设置控制样本，其中只含有相同量的N⁰P蛋白。
2. 预平衡凝胶过滤超级dex 200 增加 10/300 GL 列与缓冲器 E （20 mM HEPES， pH 7.4， 200 mM NaCl）.
3. 将样品以 21，130 x g 分过 15 分钟，去除任何降水，并将超自然物加载到 SEC 列中。
4. 比较 N:RNA 装配样本和 N⁰P 控制样本的 SEC 色谱图像，将 A₂₆₀/A₂₈₀ 比率组合在一起，以确定哪些峰值是组装的 N-RNA、N⁰P 和免费 RNA。
5. 收集峰值分数、运行 SDS-PAGE 凝胶或制作网格。
6. 对于组装 N-RNA 复合体，收集 N-RNA 峰值的所有分数，进行 RNA 提取并运行尿素-PAGE 凝胶，以仔细检查特定 RNA 的长度，这与第一步的混合和孵育相同。

4. 制作负污渍网格

注:负污渍电子显微镜（EM）是一种分子被吸收到碳膜上，然后嵌入重金属原子层的方法。负污渍 EM 产生高图像对比度，便于查看和计算对齐粒子。另一个优点是，将粒子吸附到碳膜上通常诱导分子粘附在网格上，几乎没有偏爱的方向。当分子处于类似的方向时，很容易将其分离成结构上不同的类。因此，负污渍 EM 是指导样品制备^25、26 （图 3）的适当技术。

1. 使用钨加热器在小型玻璃烧杯中微波或加热 5 毫升 ddH₂O，直到沸腾。
2. 重 37.5 毫克的尿素为囚犯，并添加到 5 mL 的加热 ddH₂O，使 0.75% 尿素为队友染色溶液。在铝箔覆盖的烧嘴下搅拌，以防止光线照射。
3. 将 4 μL 的 10 M NaOH 添加到染色溶液中，继续搅拌 15 分钟，防止光线照射。
4. 通过 0.22 mm 滤芯将溶液过滤到试管中。
5. 使用发光放电，使连续碳涂层EM网格亲水^27。
   注:电网放置在连接到电源的室内。施用高压时，室内气体电解，负电荷离子沉积在碳网格上，使其亲水。
6. 剪切并折叠一条胶片条。在胶片的一侧将缓冲液的 40 μL 滴 2 滴，在另一侧管道中再滴 2 滴 40 μL 的染色溶液。
7. 要使 EM 碳网格化，请将 3 μL 的蛋白质样本应用 1 分钟。
8. 将网格与印迹纸上污点。
   注意:网格用缓冲器清洗2次，用每一步后沾污的0.75%尿素染色溶液洗1次。
9. 将网格表面保持在第二滴 0.75% 的尿素为队友染色溶液中 30 秒。
10. 将网格与印迹纸擦掉，以去除多余的污渍溶液，并允许网格干燥。
11. 在成像之前，将网格存储在网格框中。

结果

无RNA N⁰P蛋白的纯化
通过此协议，可以获得大规模可溶性异质 RSV N⁰P 复合体。P蛋白的N和N终端部分的全长与大肠杆菌中的N蛋白的10倍共同表达。N⁰P 使用钴柱、离子交换和大小排除色谱进行纯化。N⁰P 包含全长 N 端和 N 端 P，但不包含基于紫外线吸收 A_{260 /A 280}比率₂₀ （图4）的蜂窝RNA。

N-RNA 的组装和负污渍的检查
然后，我们证明纯化的N⁰P可以通过与特定的RNA寡头孵育来刺激并组装成类似核苷酸的粒子（NCLPs）。NCLP 通过在室温下以 1:1.5 的比例孵育 N⁰P 和 RNA 寡头进行组装，持续 1 小时，然后穿过凝胶过滤柱。当 N:RNA 复杂形式时，它显示三个峰值^{:1 ...}

讨论

已知的核胶囊状粒子（NCLP）结构的非隔离负感（NNS）RNA病毒表明，组装的NCLP是复杂的N与宿主细胞RNA时，过度表达在细菌或真核表达系统15，16，17，18，19。先前的研究已经尝试通过各种方法获得RNA免费N，如RNA酶A消化，高盐洗涤，或调整不同的pH缓冲器，以去除非特异性细胞RNA^28，29。但是，上述方法均不能成功用于病毒特定 NC 的组装。为了获得无RNA的RSV N，我们还尝试了多种方法的组合，包括RNASE A消化、高盐（1.5M NaCl）洗涤、将缓冲pH从pH 5.0调整到pH 9.0、蛋白质变性和再饱和。经过多次失败的试验，我们仍然无法获得无RNA的N与上述方法。我们将...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
琼脂糖	SIgma	A9539-500G	使用 LIC 方法制作构建体
Amicon Ultra-15 离心过滤装置	Millipore	UFC901024	浓缩蛋白质样品
氨苄青霉素钠	GOLD BIOTECHNOLOGY	5118.111317A	用于细胞培养的抗生素
AseI	NEB	R0526S	使用 LIC 法制作构建体
钴（高密度）琼脂糖微珠	Gold Bio	H-310-500	用于纯化 His 标签蛋白
康宁 LSE 数字干浴加热器	康宁	6885-DB	加热样品
dCTP	LIC 方法	Invitrogen	10217016
dGTP	Invitrogen	LIC 方法制备10218014构建体
甘油	Sigma	G5516-4L	制备溶液
HEPES	Sigma	H3375-100G	制备溶液
HiTrap Q HP	Sigma	GE29-0513-25	蛋白质纯化
咪唑	Sigma	I5513-100G	制备溶液
IPTG（异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷）	GOLD BIOTECHNOLOGY	1116.071717A	诱导蛋白质微量
离心管的表达	PCR 的	VWR	47730-598
Misonix Sonicator XL2020 超声波液体处理器	SpectraLab	MSX-XL-2020	用于裂解细胞
的超声仪 阴性染色网格	电子显微镜科学	CF400-Cu-TH	用于制作阴性染色网格
New Brunswick Innova 44/44R	eppendorf	M1282-0000	用于培养细胞的摇床
Nonidet P 40替代	Sigma	74385-1L	制备溶液
OneTaq DNA 聚合酶	NEB	M0480L	PCR
QIAquick 凝胶提取试剂盒	QIAGEN	28706	纯化 DNA
SSPI-HF	NEB	R3132S	使用 LIC 方法制备构建体
Superose 6 增加 10/300 GL	Sigma	GE29-0915-96	蛋白质纯化
T4 DNA聚合酶	Sigma	70099-3	使用 LIC 方法制备构建体
Thermo Scientific Sorvall RC 6 Plus 离心机	Fisher Scientific	36-101-0816	离心机，最高转速 20,000 rpm
盐酸 Trizma	盐酸盐 Sigma	T3253-250G	制备溶液
甲酸铀酰	电子显微镜科学	22451	制备负染色溶液