呼吸系统同步病毒病毒特定核胶囊的生成和组装

非隔离性负感（NNS）RNA病毒包括许多重要的人类病原体，如狂犬病、埃博拉和呼吸道同步病毒（RSV）1、2。RSV^{是导致全球}幼儿和老年人患支气管炎和肺炎等呼吸系统疾病的主要原因。目前，没有有效的疫苗或抗病毒疗法可用于预防或治疗RSV^4。作为生命周期的一部分，RSV基因组作为RSV RNA依赖RNA聚合酶复制的模板，以产生抗原体，而抗基因组又充当生成后代基因组的模板。基因组和抗基因组RNA都完全被核蛋白（N）封装，形成核胶囊^{（NCs）3。}由于NC是RSV聚合酶复制和转录的模板，因此适当的NC组装对于聚合酶获得RNA合成⁵的模板至关重要。有趣的是，根据NNS病毒聚合酶的结构分析，假设几个N蛋白暂时脱离NC，允许聚合酶进入，并在RNA合成^{6、7、8、9、10、11、12}后重新绑定RNA。

目前，RSV RNA聚合检测已建立使用纯化RSV聚合酶短裸RNA模板^13，14。然而，RSV聚合酶的活动没有达到最佳水平，正如RSV聚合酶在使用裸RNA模板时产生的非加工和流产产品中观察到的。缺乏带有病毒特异性RNA的NC是进一步机械化地理解RSV RNA合成的主要障碍。因此，使用正宗的RNA模板成为推进RSV RNA合成基础知识的关键需要。来自RSV和其他NNS RNA病毒的核胶囊状粒子（NCLPs）的已知结构显示，NCLP中的RNA要么是随机细胞RNA，要么是平均病毒基因组RNA15、16、17、18、19。总之，主要障碍是，当N在主机单元中表达过度时，N与细胞RNA结合，形成NCLP。

为了克服这一障碍，我们建立了一个协议，首先获得无RNA（N^0），并组装N⁰ 与正宗的病毒基因组RNA到NCLP^20。该协议的原则是获得大量的重组RNA无N（N^0）通过共同表达N与伴郎，RSV磷蛋白（P_NTD）的N终端域。纯化的 N⁰P 可以通过添加 RSV 特异性 RNA 寡头来刺激并组装成 NCLP，在组装过程中，伴郎 P_NTD 在添加 RNA 寡头后会被移位。

在这里，我们详细说明了 RSV 特定 RNA 特定 NC 的生成和组装协议。在此协议中，我们描述了分子克隆、蛋白质制备、 体外 组装和复杂组件的验证。我们强调克隆策略，为分子克隆的蛋白质共表达生成双柠檬结构。在蛋白质制备方面，我们描述了细胞培养、蛋白质提取和蛋白质复合物的纯化过程。然后，我们讨论RSV RNA特定NC的 体外 组装方法。最后，我们使用大小排除色谱 （SEC） 和负污渍电子显微镜 （EM） 来描述和可视化组装的 NCLP。

1. 分子克隆

注:利气独立克隆（LIC）用于制造RSV双语气联表达构造质粒。LIC是一种在20世纪90年代初开发的方法，它利用T4DNA聚合酶的3'-5'Exo活性来制造载体和DNA插入^21，22之间的互补性悬垂。构造使用 2BT-10 矢量 DNA 进行，该 DNA 由他在开放读取帧 （ORF） （图 1）N 端的标记组成。

1. 使用 SSPI 消化对 LIC 矢量进行线性化。
   1. 结合 10 μL 的 SSPI 10X 缓冲器、浓度为 5 U/μL 的 4 μL SSPI 酶、相当于 5 μg 的矢量迷你准备脱氧核糖核酸和无菌 ddH₂O 至 100 μL。
   2. 在37°C下孵化消化3小时。
   3. 在1.0%的蔗糖凝胶上运行摘要，以提取载体DNA。
   4. 使用凝胶提取套件进行提取和净化。将矢量DNA的最终体积暂停在ddH₂O的30μL中，并将其存储在-20°C。
2. _使用N_1-391转发引物、N_1-391反向引物、P 1-126 转发引物和 P 1-126 反向引物（表 1）为 N_1-391和 P_1-1-126准备 DNA 插入。
   注意:与线性向量有足够重叠，可确保熔化温度在 55 °C 至 60 °C 之间。 对于反向引号，出于同样的原因，与线性向量的反向互补链存在足够的重叠。
   1. 使用 表 2 和表 3中的条件对 DNA 插入进行 PCR 放大。
   2. 提取放大的DNA插入。在 1.0% 的蔗糖凝胶上运行前一步的 PCR 产品，然后通过凝胶提取提取和净化带状物。将提取的DNA的最终体积暂停在 15 μL 的 ddH₂O 中。
3. T4DNA聚合酶处理载体并插入DNA（表4）。
   注:必须分别对载体DNA和插入DNA进行治疗。
   1. 在室温下将混合物孵育40分钟。然后，在 75 °C 时将聚合酶灭活 20 分钟。将反应混合物储存在-20°C。
4. 安妮尔的LIC矢量和插入载体。
   1. 使用 2μL 的 LIC 矢量 DNA 和 2 μL 的无菌 ddH₂O 设置负控。
   2. 将 2μL 插入脱氧核糖核酸和 2 μL 的 LIC 矢量 DNA 从以前的 T4 DNA 聚合酶反应中组合在 0.2 mL 管中。
   3. 在室温下执行10分钟的退化反应。
   4. 在浓度为 25 mM 时用 1.3μL 的 EDTA 淬气反应。
   5. 将反应转化为100μL的大肠杆菌Top10称职细胞，并把它们放在安培林选择板^23，24上。
5. 识别正构造。
   1. 准备质粒迷你预备解决方案。这可以通过LB介质中的菌落采摘和接种来完成。通常，3个殖民地就足够了。
   2. 在37°C下连夜孵化混合物。
   3. 将混合物在 4，560 x g 中分化 10 分钟，然后丢弃超母体。
   4. 将颗粒重新喷入 250 μL 的 P1 缓冲区，并使用旋转迷你准备套件准备质粒迷你准备。
   5. 使用 AseI 或其他限制酶对迷你prep产品进行消化分析。
   6. 将样品装载在 0.8% 的蔗糖凝胶上，并运行消化的质粒。分析紫外线灯下的凝胶。
   7. 使用测序服务验证正产品的顺序。
6. 获取联合表达DNA插入。
   1. 使用先前构建_{的 2BT-10 N 1-391}和 2BT-10 P 1-126 作为模板执行 PCR 以获取 N_1-391和 P_1-126。
   2. 执行第 1^个PCR，使用表 2 中的 PCR 条件，使用 N_1-391转发引因器和反向引件 5 ́-GTGAGACTGTCTGGCCCCCG，从 2BT-10 N 1-391 构造中获取 N _1-391
      CGCGCGCGC加特克-3 ́。
   3. 使用前置引号:5'-CCGCATCATCATCATCATCCTCTC获得P_{1-126从2BT-10 P 1-126构造中获取P 1-126}
      AGGACTC加塔加-3 ́和P_1-126 反向引座（在 表2 和 表3中使用PCR条件）。
   4. 最后，对前2个PCR反应的混合产品执行重叠PCR，以合并N_1-391和P_1-126。使用 N_1-391前向引金和 P_1-126反向引金。在表 5 和表 6中使用 PCR 条件。
7. 加入载体和DNA插入。
   1. 按照第 1.3 步的协议，使用 T4 DNA 聚合酶处理重叠的 PCR 产品。
   2. 按照第 1.4 步的协议，对 LIC 矢量和 PCR 产品进行安妮化。
   3. 在第 1.5 步中确定协议下的正构造。

2. 蛋白质表达和纯化

注意:使用 大肠杆菌 进行N和P两种培养细胞在37°C的联位的双语制构造，但在一夜之间在降低温度（16°C）时进行表达。通过钴柱、离子交换和大小排除色谱（图2）的组合来净化蛋白质复合物。

1. 使用 大肠杆菌 BL21（DE3）菌株进行蛋白质生产。在LB（卢里亚兄弟）介质中以37°C增长4L细胞培养，直到OD₆₀₀ 达到0.6。
2. 将温度降低到 16 °C。 一小时后，用0.5 m异丙基1-硫-D-加拉托皮拉诺赛德（IPTG）在一夜之间诱导表达。
3. 将细胞在4，104 x g中离心25分钟，然后丢弃超母细胞。
4. 将细胞颗粒重新喷入 200 mL 的裂解缓冲器 A （50 mM 磷酸钠、pH 7.4、500 mM NaCl、5m 肌酰胺佐尔、10% 甘油和 0.2% NP40）中。使用 50 毫升的裂解缓冲器从 1 升细胞培养物中补充细胞颗粒。
5. 通过声波化将细胞酶化15分钟、3秒开和3秒。然后离心机在37，888 x g40分钟。
   注意:在 -80 °C 冰柜中发出声波之前，可以通过冻结细胞来暂停协议。
6. 将超自然物加载到钴重力柱中（直径 x 长度:2.5 厘米 x 10 厘米），用 5-10 列卷 （CV） 裂解缓冲器预先平衡约 10mL 的珠子。
7. 用 5 CV 缓冲器 B （50 mM 特里斯 - HCl pH 7.4） 清洗列， 1 M 纳克、10% 甘油、5 m 米米达佐尔）和 5 CV 缓冲 C （50 mM 特里斯-HCl pH 7.4、500 mM 纳克、10% 甘油和 5 m m 伊米达佐尔）。
8. 使用缓冲 D 的 2 CV（50 mM 特里斯-HCl pH 7.4、500 mM 纳克和 250 mM 伊米达佐尔）从珠子中分离蛋白质。
9. 用Q柱的Q缓冲（50m Tris-HCl pH 8.0，5%甘油）稀释elute蛋白5倍。
10. 用 QA 缓冲器清洗 5 mL 的 Q 列以平衡柱，然后使用永久泵（如兔子）将稀释的样品加载到 Q 列中。
11. 将 Q 列与 QA 缓冲器和 QB 缓冲区一起加载到 HPLC 机器中（50 mM 三重-HCl pH7.4、1.5 M NaCl、5% 甘油）。将流速设置为 1 mL/分钟。
12. 运行"泵洗"程序，使用 QB 缓冲区清洗机器，然后是 QA 缓冲区（1-2 CV/每个）。将系统流量设置为 3 mL/分钟。
13. 将紫外线设置为 280 nm，将紫外线设置为 260 nm。使用 96 深井板收集分数。
14. 使用弹性剂 （QB 缓冲器） 的阶梯级应用每个浓度的 3-4 CV 的 Elute 蛋白质，每次从 0% QB 开始将百分比增加 5%。N⁰P蛋白复合物将在15%QB缓冲区出来。
15. 一旦所有的蛋白质都被稀释，用100%QB缓冲区（2 CV）清洗柱子。
16. 通过凝胶过滤分离蛋白质 Superdex 200 增加 10/300 GL 柱（直径 x 长度:1.0 厘米 x 30 厘米），并与缓冲 E（20 mM HEPES pH 7.4 和 200 mM NaCl）等于一体。
17. 通过 SDS-PAGE 分析含蛋白质分数。

3. 病毒特异性NC的体外组装

注:RSV 特定 NC （N:RNA） 的 体外 组装通过用 RNA 寡头孵育已准备好的 N⁰P 复合物来执行。然后，SEC色谱用于将装配复合物与N⁰P和多余的RNA（图2）分开。

1. 混合和孵育纯化的N⁰P复合物与RNA寡头与分子比1:1.5在室温下1小时，通常1 mL的蛋白质N⁰P浓度为1毫克/mL就足以为下一步。设置控制样本，其中只含有相同量的N⁰P蛋白。
2. 预平衡凝胶过滤超级dex 200 增加 10/300 GL 列与缓冲器 E （20 mM HEPES， pH 7.4， 200 mM NaCl）.
3. 将样品以 21，130 x g 分过 15 分钟，去除任何降水，并将超自然物加载到 SEC 列中。
4. 比较 N:RNA 装配样本和 N⁰P 控制样本的 SEC 色谱图像，将 A₂₆₀/A₂₈₀ 比率组合在一起，以确定哪些峰值是组装的 N-RNA、N⁰P 和免费 RNA。
5. 收集峰值分数、运行 SDS-PAGE 凝胶或制作网格。
6. 对于组装 N-RNA 复合体，收集 N-RNA 峰值的所有分数，进行 RNA 提取并运行尿素-PAGE 凝胶，以仔细检查特定 RNA 的长度，这与第一步的混合和孵育相同。

4. 制作负污渍网格

注:负污渍电子显微镜（EM）是一种分子被吸收到碳膜上，然后嵌入重金属原子层的方法。负污渍 EM 产生高图像对比度，便于查看和计算对齐粒子。另一个优点是，将粒子吸附到碳膜上通常诱导分子粘附在网格上，几乎没有偏爱的方向。当分子处于类似的方向时，很容易将其分离成结构上不同的类。因此，负污渍 EM 是指导样品制备^25、26 （图 3）的适当技术。

1. 使用钨加热器在小型玻璃烧杯中微波或加热 5 毫升 ddH₂O，直到沸腾。
2. 重 37.5 毫克的尿素为囚犯，并添加到 5 mL 的加热 ddH₂O，使 0.75% 尿素为队友染色溶液。在铝箔覆盖的烧嘴下搅拌，以防止光线照射。
3. 将 4 μL 的 10 M NaOH 添加到染色溶液中，继续搅拌 15 分钟，防止光线照射。
4. 通过 0.22 mm 滤芯将溶液过滤到试管中。
5. 使用发光放电，使连续碳涂层EM网格亲水^27。
   注:电网放置在连接到电源的室内。施用高压时，室内气体电解，负电荷离子沉积在碳网格上，使其亲水。
6. 剪切并折叠一条胶片条。在胶片的一侧将缓冲液的 40 μL 滴 2 滴，在另一侧管道中再滴 2 滴 40 μL 的染色溶液。
7. 要使 EM 碳网格化，请将 3 μL 的蛋白质样本应用 1 分钟。
8. 将网格与印迹纸上污点。
   注意:网格用缓冲器清洗2次，用每一步后沾污的0.75%尿素染色溶液洗1次。
9. 将网格表面保持在第二滴 0.75% 的尿素为队友染色溶液中 30 秒。
10. 将网格与印迹纸擦掉，以去除多余的污渍溶液，并允许网格干燥。
11. 在成像之前，将网格存储在网格框中。

无RNA N0P蛋白的纯化
通过此协议，可以获得大规模可溶性异质 RSV N0P 复合体。P蛋白的N和N终端部分的全长与大肠杆菌中的N蛋白的10倍共同表达。N0P 使用钴柱、离子交换和大小排除色谱进行纯化。N0P 包含全长 N 端和 N 端 P，但不包含基于紫外线吸收 A260 /A 280比率20 （图4）的蜂窝RNA。

N-RNA 的组装和负污渍的检查
然后，我们证明纯化的N0P可以通过与特定的RNA寡头孵育来刺激并组装成类似核苷酸的粒子（NCLPs）。NCLP 通过在室温下以 1:1.5 的比例孵育 N0P 和 RNA 寡头进行组装，持续 1 小时，然后穿过凝胶过滤柱。当 N:RNA 复杂形式时，它显示三个峰值:1 个 峰值为 N:RNA，第 2个 峰值为 N0P，第 3 个 峰值为超额自由 RNA。N:RNA 峰值的最高部分创建负污渍网格，用于检查 EM20 （图 5）。

图1。质粒结构的插图。一。RSV N1-391的构造:乙。RSV P1-126的构造:C. N1-391和P 1-126的联音结构。第一个基因RSV N1-391，第二个基因RSV P1-126，抗生素耐药基因（AmpR），和促进者分别突出显示在黄色，青色，粉红色和橙色框。总之，RSV N1-391和 RSV P1-126的基因插入是单独构建和组装的。请单击此处查看此图的较大版本。

图2。蛋白质复合物N1-391 P 1-126的纯化流程图。它概述了大肠杆菌细胞培养的接种和大规模生长，并通过离心收获细胞。其次是细胞裂解，蛋白质样本通过亲和力色谱（即Co2+列）、离子交换色谱（即Q列）和凝胶过滤大小排除（SEC）色谱进行纯化。SDS-PAGE凝胶进一步分析了蛋白质样本。请单击此处查看此图的较大版本。

图3。为成像准备负污渍 EM 网格。A. 发光会释放网格。乙。显示负染色网格的程序。钳子用于拾取网格，然后应用蛋白质样本1分钟。网格上布满了印迹纸。网格用缓冲器清洗两次，用 0.75% 的尿素为队友染色溶液洗两次。网格在第二个染色溶液下降中保持 30 秒。每次洗涤后，网格都会被弄脏，最后打喷后会风干。C. 网格存储在网格框中进行成像。请单击此处查看此图的较大版本。

图4。N1-391 P 1-126综合体的共化代表结果。 一。美国证券交易委员会（SEC）的N1-391P1-126概况。乙。与RNA的装配N1-391P1-126的SEC配置文件。C. SDS-PAGE 凝胶仅显示 N-RNA 复合物的 N 蛋白和 N1-391 P 1-126复合物的 N 和 P 蛋白质的带状物。请单击此处查看此图的较大版本。

图5。N-RNA 的代表图像。A 和 B 是图 4中 N1-391-RNA峰值 N-RNA 具有代表性的负污渍 EM 图像。N-RNA复合物使用图3中描述的程序进行染色。请单击此处查看此图的较大版本。

表1。引物序列。

表2。脱氧核糖核酸插入试剂的PCR放大。

表3。PCR放大DNA插入恒温程序。

表4。T4脱氧核糖核酸聚合酶治疗。

表5。重叠五氯苯酚试剂。

表6。重叠PCR恒温程序。

作者没有什么可透露的。