小鼠后肢激光多普勒血流成像

摘要

本文介绍了一种实验方案，用于演示激光多普勒灌注成像技术及其必要的对照方法，以测量小鼠后肢的血流。

摘要

血流恢复是实验性后肢缺血或缺血-再灌注后的一项关键结局指标。激光多普勒血流成像（LDPI）是一种常见、无创且可重复的评估血流恢复的方法。该技术通过检测激光照射到流动的红细胞时产生的多普勒频移，计算采样组织中的总体血流量。测量结果以任意灌注单位表示，因此通常使用对侧未干预肢体作为对照，以帮助校正测量值。测量深度范围为0.3–1 mm；对于后肢缺血模型，这意味着评估的是皮肤真皮层的灌注情况。真皮灌注受多种因素影响，其中最重要的是皮肤温度和麻醉剂，必须严格控制这些因素以获得可靠的读数。此外，毛发和皮肤色素沉着可能会影响激光到达或穿透至真皮层的能力。本文展示了在小鼠后肢应用LDPI的技术方法。

引言

皮肤溃疡伴愈合不良是导致人类患者截肢的主要原因¹。充分的伤口愈合所需的动脉灌注水平高于维持完整皮肤所需水平，而在外周动脉疾病患者中，这种灌注水平会受到损害^2,3,4。其他多种风湿性疾病和糖尿病也可能导致皮肤微循环障碍，从而影响伤口愈合^5,6。许多糖尿病患者同时患有外周动脉疾病，使其面临极高的截肢风险。激光多普勒灌注成像（LDPI）在临床中用于评估皮肤微循环，也在科研中用于评估实验性后肢缺血、缺血-再灌注以及显微外科皮瓣术后血流及血流恢复情况⁷。

LDPI 系统投射一束低功率激光，该激光经扫描镜偏转，可在感兴趣区域上移动。这与激光多普勒血流仪不同，后者仅对直接接触血流探头的小范围组织提供灌注测量⁸。当激光束与微血管中流动的血液相互作用时，会产生多普勒频移，该信号由扫描仪的光电探测器检测并转换为任意灌注单位。由于 LDPI 是一种基于光的技术，其穿透深度受限，仅为 0.3–1 mm，因此主要评估的是真皮层灌注⁷。皮肤温度和交感神经系统可影响真皮血流，而这些因素可能受到多种麻醉剂的影响⁹。光学激光的测量结果还受环境光照条件、皮肤色素沉着的影响，并可能被表层的毛发或皮毛遮挡⁷。

激光多普勒灌注成像（LDPI）是监测缺血后灌注恢复最常用的研究技术，因为它具有无创性，无需使用对比剂，且扫描速度快，可实现对多只动物的数据采集。这使其成为评估旨在促进治疗性动脉生成或血管生成的干预措施在小型动物模型中是否有效的理想方法。通过LDPI测量的后肢缺血后血流恢复情况，与其他方法（如Microfil灌注造影或显微CT）评估的侧支动脉发育情况具有良好的相关性^10,11。本实验方案的目标是演示如何使用LDPI评估后肢灌注情况。

方案

动物实验根据华盛顿大学机构动物护理和使用委员会批准的方案进行。

1. 扫描仪准备

1. 调整扫描仪高度，使扫描仪与被扫描物体之间的距离约为 30 cm。
2. 打开成像仪并启动配套软件。
3. 打开 Measurement 程序。如果软件与扫描仪通信正常，将出现红外激光开启警告提示。
4. 使用制造商提供的标准品对设备进行校准（视频中未展示，具体操作取决于所使用的设备型号）。
5. 根据房间内的背景材料和照明设置，调整扫描仪参数。
   1. 按照制造商说明设置增益水平 DC FLUX 和 CONC（视频中未展示）。
   2. 将激光束对准黑色背景材料，点击 Auto BK Set，以设置背景阈值。

2. 小鼠预扫描准备

1. 设置异氟烷诱导室，并妥善连接废气清除装置。
   注意：将诱导室置于加热垫上，有助于防止小鼠在麻醉诱导期间体温下降。
2. 开启恒温毯，将其放置于扫描区域下方的非反光表面（本实验中为黑色氯丁橡胶织物）上。将恒温毯设定为维持小鼠体温在 37 °C。
3. 将恒温毯配套的体温探针及润滑剂放置到位，以备插入使用。
4. 将麻醉面罩及废气清除系统置于扫描区域内。
5. 使用异氟烷挥发器对小鼠进行麻醉。设定氧气流速为 1 L/min，异氟烷浓度调整为 4% 以进行麻醉诱导。开启流向麻醉诱导室的气流，小鼠呼吸频率将逐渐减慢。当小鼠失去翻正反射时，表明已达到充分麻醉状态。
6. 将小鼠转移至带有废气清除装置的麻醉面罩/鼻锥，并将异氟烷浓度调整至 1.5%。
   注意：此麻醉浓度通常足以使小鼠在扫描过程中保持相对静止，但并不旨在达到外科手术级别的麻醉深度，因此不进行麻醉深度检测。异氟烷浓度的改变会影响心率、呼吸及皮肤灌注，因此在整个时间过程实验及所有实验动物中应保持一致的浓度。也可采用其他麻醉方法（如氯胺酮与赛拉嗪腹腔注射），但在同一时间过程研究中应始终使用相同的麻醉技术，因为不同麻醉剂对皮肤灌注的影响存在差异。
7. （根据扫描区域可选）若计划扫描的感兴趣区域被毛发覆盖，可使用小型电动剃毛器或脱毛膏去除目标区域的毛发。
   注意：应彻底清除脱毛膏，并在扫描前将小鼠皮肤完全擦干。
8. 将小鼠置于覆盖恒温毯的黑色非反光表面上，调整至合适的扫描体位，并确保双后肢在整个平衡及扫描过程中始终位于热源之上（图 1）。
   注意：保持双足均置于恒温毯上，对于防止局部温度差异至关重要。
9. 插入已润滑的直肠体温探针（与恒温毯配套使用）。
10. 使小鼠体温平衡至目标扫描温度（37 °C），约需 5–10 分钟。
11. 选择 扫描仪设置，该选项可通过顶部菜单或扫描仪设置图标进入。通过调整 X-Y 坐标以覆盖感兴趣区域。扫描速度取决于扫描分辨率，分辨率越高，扫描时间越长。若重复扫描旨在评估整体灌注（而非高分辨率解剖灌注），则 4 ms/像素的扫描速度已足够。
    ​注意：若研究目标为直接观察侧支循环的形成过程（最佳成像部位为靠近皮肤的腹侧大腿及小腿区域），则应考虑采用更高分辨率及单次扫描模式。当评估小鼠足垫终末器官的整体灌注时，采用较低分辨率/速度（例如 4 ms/像素）的重复扫描已足够。视频中所示软件在重启后会自动加载先前使用的扫描区域、速度和分辨率模板；若不同实验使用不同感兴趣区域，也可从已保存的文件中调取相应设置。
12. 若进行重复扫描，选择 重复与线扫描 选项卡。可修改扫描次数（本例中为 3 次）及重复间隔时间。重复间隔的最短时间应等于由扫描区域和分辨率决定的预计扫描时间（显示在设置框右侧的灰色区域）。额外增加数秒时间可允许操作者在扫描间歇暂停操作，并在必要时重新调整小鼠位置。

3. 扫描

1. 选择图像扫描选项卡，然后点击标记按钮。激光将移动以勾勒出扫描区域。调整鼠标位置，使待扫描的目标位于标记区域内。
   注意：对于足垫或足垫与小腿的扫描，采用俯卧位并伸展后肢可获得比仰卧位更一致的兴趣区域。由于股动脉、隐动脉及其侧支非常接近大腿和小腿的腹侧表面，因此在使用这些区域作为兴趣区域时，建议采用仰卧位。
2. 通过选择重复扫描图标并按下播放按钮，开始重复测量。
3. 在弹出窗口中确认扫描距离，点击“确定”以开始扫描。
4. 在扫描过程中监测小鼠的移动情况；如果小鼠移动导致后爪在扫描中途偏离扫描区域，则需重新开始扫描。小鼠后爪位置的微小变化可在后续分析软件中进行校正。
5. 在扫描过程中监测小鼠体温，即使使用恒温毯，体温仍可能出现波动。若体温变化过大，可能导致不同扫描之间的显著差异。通常，体温维持在36.8–37.2 °C范围内可获得可接受的数据。
6. 在另存为窗口中保存捕获的扫描图像，文件名应包含小鼠标识符和时间点，以便于数据分析。如有需要，可在受试者信息窗口中输入小鼠和时间点的详细信息。
7. 关闭异氟烷，移除直肠温度探针。
8. 使用70%乙醇对直肠温度探针进行消毒，以便在下一只小鼠中继续使用。
9. 让小鼠从麻醉中恢复至出现翻正反射（即能从仰卧位自行翻转为俯卧位）后，再将其放回饲养笼。
   ​注意：对于异氟烷麻醉，恢复过程非常迅速，可在加热毯上进行恢复；而对于氯胺酮/赛拉嗪麻醉，则建议在加温的恢复笼中进行恢复。

4. 采集LDPI数据（图3）

1. 打开影像回顾软件程序。
2. 进入文件菜单，选择“打开”，并找到已保存的文件。
3. 从工具栏中选择ROI 图标。
4. 选择添加多边形按钮。
5. 使用鼠标勾画对照后肢的兴趣区域（ROI）。由于灰色背景不会被计入计算的平均值中，因此多边形勾画无需完全精确。
6. 对术侧后肢重复步骤 4.3–4.5 。
7. 选择统计图标，以打开图像ROI统计结果（PU）窗口。
8. 通过复制/粘贴方式，将多边形1（对照后肢）和多边形2（术侧后肢）的结果导出至数据采集工作表。

5. 分析

1. 将每次扫描的数据记录为手术侧/对照侧的比值。
2. 对该时间点每只小鼠的数据点，采用三次扫描的手术/对照比值的平均值。由于小鼠对后肢缺血的生物学反应存在变异性，通常每个时间点需要8–10只小鼠，才能获得标准误差约10%的可重复结果。
   注意：在允许小鼠从麻醉中恢复之前，建议快速分析重复扫描的数据，以检查数据变异性是否过大（例如，扫描1–3之间的灌注单位差异超过100–150）。重复扫描间变异过大提示小鼠在扫描期间尚未完全达到稳态（图2），此时可重新进行扫描，从而避免因图像延迟至日后分析而导致数据点丢失。为更清晰地显示扫描间的变异情况，可能需要调整颜色调色板以优化显示通量值的动态范围（图2）。

结果

成功的激光多普勒灌注成像（LDPI）应获得一致的重复测量扫描结果，三次扫描之间的灌注单位变化不应超过100–150个单位（相当于小鼠足垫通常平均灌注量的约10%）（图2）。如图2所示，重复扫描有助于确认小鼠已达到适当的平衡状态，从而使缺血侧/对照侧的灌注比值最真实地反映基础血流情况，而非因温度变化引起的皮肤灌注波动。若仅使用单次扫描作为数据点，将增加数据变异性，导致需要更多的实验小鼠。在用于后肢缺血模型时，手术侧后肢的总体灌注应低于对照侧后肢。结果以手术侧后肢灌注量与对照侧后肢灌注量的比值表示。由于小鼠在术后会逐渐发生血管扩张并随时间建立内在的侧支循环网络，因此通过LDPI可在术后时间过程中观察到血流恢复情况（图4）。恢复程度取决于小鼠品系及后肢缺血模型的严重程度。

讨论

在使用LDPI时，操作技术的一致性对于获得可靠结果至关重要。在整个实验时间过程中，应保持使用相同的麻醉剂、温度设置、小鼠体位和感兴趣区域。不同的麻醉剂会导致灌注值升高或降低⁹。异氟烷麻醉因其起效迅速、苏醒快且整体安全性高而较为方便。应使用恒定浓度的异氟烷，因为该血管扩张剂的麻醉深度可能影响皮肤灌注。如果感兴趣区域包含毛发，则每次应采用相同的脱毛方法，因为经化学脱毛的小鼠灌注值会高于使用电动剪刀去除毛发的小鼠⁷。小鼠体温对灌注成像具有显著影响，体温为36 °C的小鼠灌注值明显低于体温为38 °C的小鼠^7,12。缺血后肢对局部温度变化的反应也可能与对照后肢不同（图2）。在本方案中，使用恒温毯在扫描期间维持小鼠体温，相较于将小鼠预先置于37 °C加热板上平衡5分钟后再在非加热表面进行扫描的方法，该方式可在扫描过程中提供更稳定的温度控制，这一点已被Niiyama等人的研究证实...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
黑色无反光材料			布料商店，公司推荐黑色氯丁橡胶
F/空气储罐	A.M. Bickford Inc	80120
带刚性金属探头的恒温毯	Harvard Apparatus		也可配柔性探头，但耐用性较差
异氟烷麻醉机	Drager		多家制造商
异氟烷诱导室	VetEquip	941444	2 L 室
Moor 激光多普勒血流成像仪	Moor Instruments	MoorLDI2-IR	更高分辨率成像仪（MoorLDI2-HIR）
小鼠麻醉鼻罩			多家制造商
Nair	Nair
氧气罐			多家制造商
Surgilube	多家分销商