本文介绍了一种实验方案，用于演示激光多普勒灌注成像技术及其必要的对照方法，以测量小鼠后肢的血流。
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本文内容
摘要
摘要
血流恢复是实验性后肢缺血或缺血-再灌注后的一项关键结局指标。激光多普勒血流成像（LDPI）是一种常见、无创且可重复的评估血流恢复的方法。该技术通过检测激光照射到流动的红细胞时产生的多普勒频移，计算采样组织中的总体血流量。测量结果以任意灌注单位表示，因此通常使用对侧未干预肢体作为对照，以帮助校正测量值。测量深度范围为0.3–1 mm；对于后肢缺血模型，这意味着评估的是皮肤真皮层的灌注情况。真皮灌注受多种因素影响，其中最重要的是皮肤温度和麻醉剂，必须严格控制这些因素以获得可靠的读数。此外，毛发和皮肤色素沉着可能会影响激光到达或穿透至真皮层的能力。本文展示了在小鼠后肢应用LDPI的技术方法。
引言
皮肤溃疡伴愈合不良是导致人类患者截肢的主要原因1。充分的伤口愈合所需的动脉灌注水平高于维持完整皮肤所需水平，而在外周动脉疾病患者中，这种灌注水平会受到损害2,3,4。其他多种风湿性疾病和糖尿病也可能导致皮肤微循环障碍，从而影响伤口愈合5,6。许多糖尿病患者同时患有外周动脉疾病，使其面临极高的截肢风险。激光多普勒灌注成像（LDPI）在临床中用于评估皮肤微循环，也在科研中用于评估实验性后肢缺血、缺血-再灌注以及显微外科皮瓣术后血流及血流恢复情况7。
LDPI 系统投射一束低功率激光，该激光经扫描镜偏转，可在感兴趣区域上移动。这与激光多普勒血流仪不同，后者仅对直接接触血流探头的小范围组织提供灌注测量8。当激光束与微血管中流动的血液相互作用时，会产生多普勒频移，该信号由扫描仪的光电探测器检测并转换为任意灌注单位。由于 LDPI 是一种基于光的技术，其穿透深度受限，仅为 0.3–1 mm，因此主要评估的是真皮层灌注
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方案
动物实验根据华盛顿大学机构动物护理和使用委员会批准的方案进行。
1. 扫描仪准备
- 调整扫描仪高度，使扫描仪与被扫描物体之间的距离约为 30 cm。
- 打开成像仪并启动配套软件。
- 打开 Measurement 程序。如果软件与扫描仪通信正常，将出现红外激光开启警告提示。
- 使用制造商提供的标准品对设备进行校准（视频中未展示，具体操作取决于所使用的设备型号）。
- 根据房间内的背景材料和照明设置，调整扫描仪参数。
- 按照制造商说明设置增益水平 DC FLUX 和 CONC（视频中未展示）。
- 将激光束对准黑色背景材料，点击 Auto BK Set，以设置背景阈值。
2. 小鼠预扫描准备
- 设置异氟烷诱导室，并妥善连接废气清除装置。
注意：将诱导室置于加热垫上，有助于防止小鼠在麻醉诱导期间体温下降。 - 开启恒温毯，将其放置于扫描区域下方的非反光表面（本实验中为黑色氯丁橡胶织物）上。将恒温毯设定为维持小鼠体温在 37 °C。
- 将恒温毯配套的体温探....
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结果
成功的激光多普勒灌注成像（LDPI）应获得一致的重复测量扫描结果，三次扫描之间的灌注单位变化不应超过100–150个单位（相当于小鼠足垫通常平均灌注量的约10%）（图2）。如图2所示，重复扫描有助于确认小鼠已达到适当的平衡状态，从而使缺血侧/对照侧的灌注比值最真实地反映基础血流情况，而非因温度变化引起的皮肤灌注波动。若仅使用单次扫描作为数据点，将增加数据变异性，导致需要更多的实验小鼠。在用于后肢缺血模型时，手术侧后肢的总体灌注应低于对照侧后肢。结果以手术侧后肢灌注量与对照侧后肢灌注量的比值表示。由于小鼠在术后会逐渐发生血管扩张并随时间建立内在的侧支循环网络，因此通过LDPI可在术后的时间过程中观察到血流恢复情况（图4）。恢复程度取决于小鼠品系及后肢缺血模型的严重程度。
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讨论
在使用LDPI时，操作技术的一致性对于获得可靠结果至关重要。在整个实验时间过程中，应保持使用相同的麻醉剂、温度设置、小鼠体位和感兴趣区域。不同的麻醉剂会导致灌注值升高或降低9。异氟烷麻醉因其起效迅速、苏醒快且整体安全性高而较为方便。应使用恒定浓度的异氟烷，因为该血管扩张剂的麻醉深度可能影响皮肤灌注。如果感兴趣区域包含毛发，则每次应采用相同的脱毛方法，因为经化学脱毛的小鼠灌注值会高于使用电动剪刀去除毛发的小鼠7。小鼠体温对灌注成像具有显著影响，体温为36 °C的小鼠灌注值明显低于体温为38 °C的小鼠7,12。缺血后肢对局部温度变化的反应也可能与对照后肢不同（图2）。在本方案中，使用恒温毯在扫描期间维持小鼠体温，相较于将小鼠预先置于37 °C加热板上平衡5分钟后再在非加热表面进行扫描的方法，该方式可在扫描过程中提供更稳定的温度控制，这一点已被Niiyama等人的研究证实.......
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披露
唐博士没有需要披露的利益冲突。
致谢
本工作在退伍军人事务部普吉特湾医疗中心的设施和资源支持下完成。本研究内容由作者独立完成，不一定反映退伍军人事务部或美国政府的立场或政策。唐博士目前的研究经费来自退伍军人事务部（优异奖 5 I01 BX004975-02）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 黑色无反光材料 | 布料商店，公司推荐黑色氯丁橡胶 | ||
| F/空气储罐 | A.M. Bickford Inc | 80120 | |
| 带刚性金属探头的恒温毯 | Harvard Apparatus | 也可配柔性探头，但耐用性较差 | |
| 异氟烷麻醉机 | Drager | 多家制造商 | |
| 异氟烷诱导室 | VetEquip | 941444 | 2 L 室 |
| Moor 激光多普勒血流成像仪 | Moor Instruments | MoorLDI2-IR | 更高分辨率成像仪（MoorLDI2-HIR） |
| 小鼠麻醉鼻罩 | 多家制造商 | ||
| Nair | Nair | ||
| 氧气罐 | 多家制造商 | ||
| Surgilube | 多家分销商 |
参考文献
- Varma, P., Stineman, M. G., Dillingham, T. R. Epidemiology of limb loss. Physical Medicine and Rehabilitation Clinics of North America. 25 (1), 1-8 (2014).
- Farber, A. Chronic Limb-Threatening Ischemia. New England Journal of Medicine. 379 (2), 171-180 (2018).
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重印与许可
