我们描述了一种将人皮肤来源的成纤维细胞重编程为诱导性神经前体细胞（iNPCs），并进一步将其分化为诱导性星形胶质细胞（iAs）的实验方案。该方法可快速、可重复地大量生成iNPCs和iAs。
本文内容
摘要
摘要
神经疾病的研究主要关注神经元对疾病机制的影响。动物模型的有限可获得性严重制约了对特定细胞类型在疾病中作用的研究。此外，动物模型通常无法反映人类患者中所见的突变多样性和疾病进程差异。诱导多能干细胞（iPSCs）的重编程技术革新了针对患者的特异性研究，并为研究疾病机制提供了宝贵的工具。然而，iPSC技术存在耗时长、劳动强度大、克隆选择性以及表观遗传标记丢失等缺点。近年来对这些方法的改进实现了更直接地生成细胞谱系或特定细胞类型，从而绕过克隆分离或 pluripotent 干细胞状态。我们开发了一种快速的直接转化方法，利用逆转录病毒载体结合神经诱导培养基，将皮肤成纤维细胞直接转化为诱导神经祖细胞（iNPCs）。这些iNPCs可进一步分化为神经元（iNs）、少突胶质细胞（iOs）和星形胶质细胞（iAs）。其中，iAs的生成仅需5天即可完成分化，有利于快速开展药物筛选和疾病机制研究。此外，iAs易于操作，且能够以高纯度和大规模获得。我们建立了一种高度可重复的共培养检测方法，使用小鼠GFP+神经元与患者来源的iAs，用于评估多种神经系统及神经退行性疾病的潜在治疗策略。重要的是，该iAs检测方法可扩展至384孔板格式，便于在同一块板上评估多种小分子化合物。该方法可同时对具有不同遗传背景的多位患者细胞系进行治疗效果评估。iAs的简便制备与储存特性，以及单次实验即可筛选多种化合物的能力，使该技术方法适用于个体化医学研究。
引言
了解潜在的疾病机制对于神经系统疾病至关重要，因为它有助于开发潜在的治疗策略。尽管动物模型在神经系统疾病研究中历来被视为金标准，但将潜在疗法直接转化为临床应用往往成效有限1,2,3。转化失败的原因包括小鼠遗传背景和突变缺乏多样性、疾病表型呈现不完全，以及人类患者在药物敏感性或剂量反应方面的差异在近交系小鼠中难以准确模拟。此外，对于许多罕见的神经系统疾病，目前尚无或仅有极少数可用的动物模型。直接在相关的人类细胞类型中研究疾病机制可能有助于推动研究并提高向临床转化的成功率。对于中枢神经系统疾病而言，原代人类细胞难以获取，且来源极为有限，因为活检具有侵入性，或只能在疾病终末期通过尸检获得。在过去15年中，细胞重编程技术的发展极大地拓展了在体外模拟人类神经系统及神经退行性疾病的能力。
传统的细胞重编程方法涉及将成纤维细胞或其他细胞类型重编程为诱导性多能干细胞（iPSCs），后者具有分化为三个胚层各类细胞类型的潜能4高桥和山中首次证明，重新表达四种干细胞转录因子足以将体细胞重编程为诱导多能干细胞（iPSCs）5随后，iPSCs 可进一步分化为特定的细胞类型。然而，该过程的缺点在于生成和分离稳定的干细胞克隆需要耗费大量人力且耗时较长。此外，体细胞突变或母细胞的特定异常也会在干细胞克隆中得以保留，并可能影响研究结果6此外，越来越多的证据表明，向干细胞重编程的过程会抹除可能影响细胞疾病机制的重要表观遗传学改变。4,7,8近年来，研究人员致力于改进重编程方法，以更直接地生成不同类型细胞，同时绕过多能干细胞状态。9,10,11,12 （综述见于 13,14）。最初的突破揭示了在体外将成纤维细胞通过组合重编程转化为心肌细胞15神经元16 和肝细胞17 通过异位表达多种谱系特异性转录因子或微小RNA18随后，开展了直接重编程细胞以模拟神经系统疾病的研究。19,20如上所述，这类直接重编程或转分化方案相较于经典的iPSC方案具有潜在优势，包括更快的进程以及省去了克隆分离步骤。此外，有证据表明，这些方案能够保留更多与患者年龄相关的表观遗传信息，对于疾病相关标志物的保留可能同样如此。7,8.
迄今为止，针对神经系统疾病的体外研究主要集中在神经元上。然而，众所周知，其他细胞类型（如星形胶质细胞、小胶质细胞和少突胶质细胞）在神经退行性疾病（如阿尔茨海默病（AD）、肌萎缩侧索硬化症（ALS）、帕金森病（PD）、亨廷顿病（HD）、多发性硬化症（MS））以及其他神经系统病理过程（如雷特综合征（RTT）、睡眠障碍、成瘾、癫痫、溶酶体贮积症、抑郁症、偏头痛和病理性疼痛）的发病机制与进展中也发挥着关键作用21,22,23,24,25,26。星形胶质细胞是中枢神经系统（CNS）中最丰富的细胞类型，但直到最近，其在病理学方面的意义仍被广泛忽视7。目前研究已明确，星形胶质细胞在维持健康中枢神经系统几乎所有稳态功能方面具有关键作用。此外，它们在疾病病理过程中也具有重要影响，对于理解疾病机制和评估治疗策略具有重要价值19。
在本文描述中，我们详细介绍了一种利用表达Yamanaka重编程因子（Klf4、Oct3/4、Sox2和c-Myc）的逆转录病毒载体，并结合神经诱导培养基，将人类患者成纤维细胞直接转化为诱导性神经前体细胞（iNPCs）的实验方案。以往研究曾采用不同的转录因子组合实现向神经细胞的直接重编程（详见参考文献14），但本方案所用因子可广泛获得，既可通过质粒自行制备病毒载体，也可使用市售的即用型病毒重编程试剂盒。所获得的iNPCs可进一步分化为诱导性神经元（iNs）27、诱导性少突胶质细胞（iOs）24 和诱导性星形胶质细胞（iAS）19，用于研究其在神经系统疾病中的作用。本方案无需耗时的iPSCs诱导过程，而大多数现有方案均依赖iPSCs来获得人类星形胶质细胞28。经本方案直接重编程获得的iNPCs中，约98%至100%可分化为GFAP阳性星形胶质细胞29，相比之下，由成纤维细胞直接转化为星形胶质细胞的方法仅约2%30。近期一项基于本研究描述的重编程方法的比较转录组学研究表明，由供体成纤维细胞重编程获得的iNPCs可在转录和功能水平上保留与年龄匹配的尸检来源星形胶质细胞及原代星形胶质细胞相似的衰老特征29。因此，该转化方案是研究疾病机制以及评估与年龄相关的神经退行性和神经系统疾病新型治疗策略的有力工具。
本文描述了用于生成诱导性神经前体细胞（iNPCs）并进一步分化为诱导性星形胶质细胞（iAs）的实验方案，该体系最适合用于大规模的小分子筛选实验。利用iAs进行疾病机制研究和药物测试时，可采用多种方法，例如与神经元共培养，或进行代谢和生化分析。该系统相较于诱导性多能干细胞（iPSCs），具有培养速度快和维护简便的优势。此外，iNPCs可分装冻存，便于在长期内以恒定条件进行iAs分化和药物测试。总体而言，该方法使得更大样本量的比较成为可能，从而为在更大且更具代表性的患者群体中评估化合物的治疗潜力提供了途径。
方案
| 培养基 | 试剂 | 混合量 | 终浓度 (%) |
| 成纤维细胞培养基 | DMEM, 高糖, GlutaMAX | 500 mL | 89 |
| 胎牛血清 | 50 mL | 10 | |
| 抗生素-抗真菌剂 | 5 mL | 1 | |
| 基础培养基 | DMEM/F12 + Glutamax | 500 mL | 97 |
| N-2 | 5 mL | 1 | |
| B-27 | 5 mL | 1 | |
| 抗生素-抗真菌剂 | 5 mL | 1 | |
| 转化培养基 | 基础培养基 | 50 mL | 99.9 |
| FGF | 1 µL | 0.02 (20 ng/mL) | |
| EGF | 1 µL | 0.02 (20 ng/mL) | |
| 肝素 | 50 µL | 0.1 (5 µg/mL) | |
| 神经前体细胞 (NPC) 培养基 | DMEM/F12 + Glutamax | 500 mL | 96.9 |
| N-2 | 5 mL | 1 | |
| B-27 | 5 mL | 1 | |
| 抗生素-抗真菌剂 | 5 mL | 1 | |
| FGF | 10 uL | 0.002 | |
| 星形胶质细胞培养基 | DMEM, 高糖, GlutaMAX | 500 mL | 89 |
| 胎牛血清 | 50 mL | 10 | |
| 抗生素-抗真菌剂 | 5 mL | 1 | |
| N-2 | 1 mL | 0.2 | |
| 所有组分混合后必须过滤培养基。转化培养基（含因子）需每周新鲜配制。 | |||
表1. 本方案中所有细胞类型的培养基配方。 配制所有组分后，应使用无菌真空过滤系统（大体积）或注射器配合0.2 µm注射器滤器进行过滤。诱导培养基（含因子）必须每周新鲜配制。
1. 成人人类成纤维细胞直接转化为神经前体细胞
注意：本方案的示意图时间线可参见 Meyer (2014)19。
- 使用可从细胞库或皮肤活检中获得的原代人皮肤成纤维细胞31。将细胞在37 °C、5% CO2的组织培养孵箱中培养。实验前，细胞复苏后至少传代1-2次。当细胞准备就绪后，在室温下用1:200稀释于PBS中的人纤维连接蛋白包被6孔板的1个孔，孵育15-20分钟。
- 当细胞准备接种时，从培养皿中移除纤维连接蛋白，并立即加入细胞悬液或2 mL成纤维细胞培养基（表1），在加入培养基前切勿让培养皿干燥。根据细胞生长速度，分别在两个经人纤维连接蛋白包被的6孔板孔中接种150,000个（生长快）至200,000个（生长慢）的成纤维细胞。
注意：为使病毒转导后细胞能在同一孔中继续培养数天，接种时细胞融合度应约为70%。为便于次日选择，建议以两种不同密度接种。 - 接种后的第二天，在显微镜下检查成纤维细胞，确认细胞密度（70%-85%之间）以及在整个孔内分布均匀，以获得最佳效果。
- 用四种逆转录病毒载体（Oct3/4、Klf4、Sox2和c-Myc）对其中一个孔进行转导——对生长快的成纤维细胞使用感染复数（MOI）为10，对生长慢的细胞使用MOI为15（每种载体的转导效率应超过70%或更高阳性率）。将常规成纤维细胞培养基加入病毒混合物中，使每孔总体积达到1 mL，并在37 °C、5% CO2的组织培养孵箱中过夜孵育。另一孔不作处理，将细胞放回组织培养孵箱。
注意：逆转录病毒载体可从供应商购买或自行制备，相关方案可在网络获取32。 - 转导后的第二天，用PBS洗涤细胞一次，并加入1 mL新鲜成纤维细胞培养基。
- 次日，更换为转化培养基。先用PBS洗涤细胞一次，以去除残留的成纤维细胞培养基，然后加入1 mL转化培养基。同时，也将未处理孔的培养基更换为转化培养基。
注意：即使仅更换未接受逆转录病毒载体处理的成纤维细胞的培养基，也可能观察到一些形态学变化，因此保留一个未处理孔（可选）有助于判断病毒载体的作用效果。细胞在更换为转化培养基后2-4天应开始出现形态变化。 - 在显微镜下观察细胞，注意其形态变化（图1）。在整个转化过程（1-2 mL转化培养基，表1）以及后续iNPC培养期间，应每天更换培养基。换液时，小心移除孔中70%的培养基，确保剩余30%培养基仍覆盖细胞。
注意：含生长因子的培养基需在配制后1周内使用完毕。- 继续每日观察细胞并更换培养基（1-2 mL转化培养基）。
- 某些细胞系开始形成松散、隆起的圆形结构，呈球状生长或松散的神经元样球体（补充图1和19,33）。注意避免这些细胞脱落。若球体脱落，可收集后重新接种至新的纤维连接蛋白包被的6孔板孔中。
注意：若单独扩增这些球体，其细胞多样性将低于初始培养皿中的细胞，可能代表一个明显不同的细胞系。建议在下一次传代时将这些细胞与其他转化细胞合并。
- 在转化培养基中培养约5-6天（难转化细胞系最多可达12天），或当细胞变得非常密集时，以1:2或最多1:3的比例进行传代。
注意：在整个转化过程中，保持细胞高密度至关重要。
2. 转化与iNPC分离步骤
- 将细胞解离溶液（例如 Accutase）预热，并用纤连蛋白（按 PBS 中 1:200 稀释，每孔加入 1 mL 包被液）包被 6 孔板中适当数量的孔，室温孵育 15–20 分钟。延长纤连蛋白包被时间不会产生负面影响，但应避免缩短包被时间。
- 用 PBS 轻柔清洗细胞，注意不要使细胞脱落（可沿孔壁缓慢加入 PBS）。使用移液器或抽吸法小心移除 PBS。
- 每孔加入 0.5 mL 细胞解离溶液，在 37 °C 组织培养孵箱中孵育 2–3 分钟。在显微镜下观察，确认大部分细胞已脱落。若所有细胞均已脱落，加入 2 mL 新鲜转化培养基，轻柔吹打 2–3 次以分散细胞团块（如需要）。
- 将细胞收集至 15 mL 离心管中，并加入额外 3 mL 培养基以进一步稀释细胞解离溶液。先用额外培养基冲洗孔板，确保所有细胞均被回收。
- 室温下以 200 × g 离心 4 分钟。
注意：正在转化的细胞或诱导神经前体细胞（iNPCs）对培养基中残留的细胞解离溶液极为敏感。必须通过离心并吸除上清液彻底去除残留酶。 - 弃去上清液，将细胞沉淀重悬于 1 mL 新鲜培养基中。轻柔吹打 2–3 次以分散细胞团块。去除已包被的 6 孔板中的纤连蛋白，并立即向每孔加入 1 mL 新鲜培养基（避免纤连蛋白干燥）。按 1:2 传代比例，将 0.5 mL 细胞悬液加入一个新孔，另 0.5 mL 加入第二个新孔。
- 将细胞置于 37 °C 组织培养孵箱中培养。
- 通过轻柔地沿南北东西方向晃动 6 孔板（非环形晃动）使细胞分布均匀，随后放入组织培养孵箱。
- 次日于显微镜下观察细胞，并更换培养基（1–2 mL）。此后每日换液，直至细胞再次达到传代状态。
注意：此时细胞增殖应开始加速，通常在 2–3 天内（生长缓慢的细胞系可能需 4 天）即可进行第二次传代。- 在此次传代时，将一孔细胞接种于转化培养基中，另一孔接种于仅含高浓度 FGF 而不含 EGF/肝素的 NPC 培养基中（表 1）。
注意：某些细胞系在转化培养基中培养约 10 天后会进入停滞状态，此时转换至 NPC 培养基可能有助于促进细胞生长。此外，NPC 在 NPC 培养基中培养时形态更为特异且较小19。至此，iNPCs 已可用于分化实验及其他用途。
- 在此次传代时，将一孔细胞接种于转化培养基中，另一孔接种于仅含高浓度 FGF 而不含 EGF/肝素的 NPC 培养基中（表 1）。
- 继续每日更换 iNPCs 的培养基（1–2 mL）。
- 通过合并 6 孔板中两至三个完全汇合的孔，将细胞扩增至 10 cm 培养皿中。10 cm 培养皿的典型培养基体积为 12–15 mL。
- 在下一次传代时，可进一步将这些细胞扩增至三至四个 10 cm 培养皿（每皿 12–15 mL 培养基），以制备大量细胞储备。10 cm 培养皿通常每 3–4 天按 1:3 或 1:4 比例传代一次，具体取决于细胞增殖速率。
3. 从NPCs生成诱导性星形胶质细胞
- 为从新鲜的iNPCs制备星形胶质细胞，将iNPCs直接接种于10 cm纤维连接蛋白包被的培养皿中，加入10 mL星形胶质细胞培养基（表1），使次日细胞汇合度约为10%。将细胞置于37 °C、5% CO2的组织培养孵箱中培养。
注意：推荐的接种密度通常为一个10 cm培养皿NPCs细胞重悬液的50 µL，前提是根据其传代比例稀释至最终体积（例如，1:3传代时为3 mL，1:4传代时为4 mL，依此类推）。 - 接种后第三天更换培养基（10 mL星形胶质细胞培养基）。继续诱导细胞分化5–7天。
注意：iAs对多次传代耐受性较差，因此每次传代NPCs时最好重新制备新鲜的星形胶质细胞。 - 为实验接种，使用胰蛋白酶或细胞解离溶液按照步骤2.1–2.7所述方法对星形胶质细胞进行传代。推荐的接种密度见表2。
| 培养板类型 | 每孔星形胶质细胞数量 |
| 384孔板 | 2500 |
| 96孔板 | 10000 |
| 24孔板 | 40000 |
| 6孔板 | 150000 |
表2. 每孔板面积推荐的iAs接种密度。 在最常用的组织培养板上形成单层时，iAs的典型接种数量。
4. 从冻存的NPC储备中准备和解冻用于星形胶质细胞分化的部分（替代步骤3）
注意：除了在培养中维持iNPCs外，星形胶质细胞也可以直接从冻存的细胞库中制备。为此，可将iNPCs分装成较小体积进行冻存。表3列出了建议的冻存和解冻体积，适用于解冻后接种至含10 mL星形胶质细胞培养基的10 cm培养皿中的细胞分装量。
| 分装体积 | 细胞悬液 (µL) | 冻存液 (µL) | 总体积 (µL) | 解冻后接种于 |
| 4x | 400 | 400 | 800 | 两个 10-cm 培养皿 |
| 2x | 200 | 200 | 400 | 一个 10-cm 培养皿 |
表3. 将iNPC分装以制备iAs的操作说明。 用于制备分装样本的iNPC悬液与冻存液的比例。请注意，当细胞悬液与冻存液混合后，DMSO的终浓度为10%。
- 从液氮储存罐中取出冷冻的iNPC储备管，迅速在37 °C条件下解冻。细胞一旦完全解冻，立即将细胞悬液转移至含有5 mL星形胶质细胞培养基的15 mL离心管中。
- 在室温下以200 × g离心4分钟，弃去上清液，并将细胞沉淀重悬于1 mL新鲜星形胶质细胞培养基中。
- 在纤维连接蛋白包被的10 cm培养皿中加入9 mL新鲜星形胶质细胞培养基，再加入1 mL细胞悬液。轻轻以南北东西方向晃动培养皿，使细胞均匀分布。将细胞置于37 °C、5% CO2的细胞培养孵箱中进行培养。
结果
本方案利用含有山中因子的逆转录病毒，可直接从人皮肤成纤维细胞快速、简便地生成诱导性神经前体细胞（iNPCs）。该方法能够绕过干细胞状态以及克隆筛选的步骤，从而避免克隆间变异。在细胞转化过程中需特别注意的关键步骤包括：成纤维细胞的接种密度、培养基pH值，以及维持细胞处于最佳汇合度。转化过程中最佳传代汇合度及形态学变化的示例见图1。
图1。加入Yamanaka因子逆转录病毒混合物后转化过程的代表性图像。 成纤维细胞接种后24小时用Yamanaka因子进行转导。病毒感染后第2天（DPV），更换为转化培养基。细胞在转化培养基中培养至可传代阶段（13 DPV）。传代后接种细胞，使其在次日达到80%融合度（14 DPV）。后续传代均维持此密度，直至神经前体细胞开始快速增殖。比例尺为200 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。
转化过程完成后，神经前体细胞（NPC）将显著降低或不再表达成纤维细胞标志物及其形态特征，并表达NPC特异性的细胞标志物（图2）。此外，这些细胞还可用于生成不同的细胞系，如诱导神经元（iNs）、诱导少突胶质细胞（iOs）和诱导星形胶质细胞（iAs）。
图2．经历转化过程的细胞表达细胞特异性标志物。 将患者成纤维细胞（A）、诱导性神经前体细胞（iNPCs，B）和诱导性星形胶质细胞（iAs，C）接种于24孔组织培养处理板中的玻璃盖玻片上。细胞经免疫荧光染色检测以下标志物：成纤维细胞特异性标志物（A），Vimentin（绿色）和TE7（红色）；iNPC特异性标志物（B），Nestin（红色）；以及iAs细胞标志物（C），GFAP（紫色）和iNPC标志物Nestin（绿色）。比例尺为50 µm。请点击此处查看该图的放大版本。
根据我们的经验，尤其是诱导性星形胶质细胞（iAs）在药物和疾病机制研究中具有很高的应用价值，因为它们能够以可重复的大规模数量获得高纯度的细胞群体（98%或以上的GFAP阳性细胞29）。iAs可通过在传代时取少量细胞或使用先前冻存的诱导性神经前体细胞（iNPCs）直接接种于星形胶质细胞培养基中进行分化。在此过程中需注意的关键因素包括：保持iNPCs的初始接种密度较低（图3 和 图4），因为过高密度已被证明会阻碍分化过程（图4）；同时需特别关注培养基的pH值，因为酸化可能激活即使是健康的星形胶质细胞。
图3．iNPCs向iAs分化过程的代表性图像。 将iNPCs以较低接种密度接种于星形胶质细胞培养基（表1）中。理想的接种密度约为接种后第一天（DPS）覆盖约10%（左图）；然而，该密度可根据细胞的生长速率进行调整。典型的iAs形态在接种后5天（DPS）可见（中图）。在某些情况下，可观察到异常的星形胶质细胞形态，具有细长且尖锐的突起。这种变化提示星形胶质细胞的活化，可能与疾病状态或培养技术不当有关（右图）。比例尺为200 µm。请点击此处查看该图的放大版本。
图4。iNPC接种密度影响iAs分化效率。 将对照组iNPC细胞系以低密度（A）和高密度（B）接种于星形胶质细胞培养基中，以展示接种密度对分化的影响。接种后第5天，低密度组表达星形胶质细胞特异性标记物，而高密度组则呈现iNPC与iAs标记物的混合表达，并具有明显的iNPC样形态。比例尺为50 µm。请点击此处查看该图的放大版本。
补充图1. 添加山中因子逆转录病毒混合物后转化过程的附加图像。 转化过程在传代前1天（12 DPV）和传代后6天（19 DPV）的图像。注意传代前后细胞形态的差异：在12 DPV时，细胞呈现类球状结构；经过一次传代并在转化培养基（表1）中培养数天后，细胞开始呈现类似神经前体细胞（NPC）的形态。比例尺为200 µm。请点击此处下载该文件。
讨论
总之，直接转化是一种从患者皮肤成纤维细胞快速、简便地生成诱导性神经前体细胞的方法。该方法具有速度快、产细胞数量多且易于维持等优势。此外，越来越多的证据表明，与经典的诱导多能干细胞（iPSC）重编程技术相比，直接重编程方法保留了更多的表观遗传标记，因而能更完整地保留疾病环境4,7,8。iNPCs向星形胶质细胞的分化过程非常直接，且高度可重复，即使在多个独立实验室之间也具有一致性19,29,33。iNPCs可分装冷冻，使用时直接解冻进行分化，有助于减少实验间的差异，因为传代次数可以保持相近。星形胶质细胞在多种神经系统疾病的进展中发挥关键作用，因此是一种具有研究价值的细胞类型。这些星形胶质细胞可用于机制研究、代谢研究或药物筛选实验，通常以单层形式培养。此外，星形胶质细胞还可与小鼠或人类神经元共培养，以评估其对神经元存活和形态的影响，这两者均为药物筛选的良好检测指标34。
为了成功使用本方案，需要注意一些要点和潜在的局限性。例如，人皮肤成纤维细胞在细胞分裂速率以及对病毒载体的反应方面存在很大差异。由于这些细胞并非标准化的细胞系，其变异性如同人类本身一样广泛，每一批细胞系都各不相同。与许多重编程方法一样，相较于几乎不复制的细胞，具有中等至较快分裂速率的成纤维细胞更容易被重编程。细胞的复制速率可能受到皮肤活检样本质量及处理过程、成纤维细胞的传代次数以及操作方式的影响。在培养原代皮肤成纤维细胞时，应注意避免细胞密度过高，以防诱导细胞衰老。如果成纤维细胞生长状况不佳，最好尝试使用新的细胞库存或较低传代次数的细胞；尽管在某些情况下，疾病本身也可能起到一定作用。与标准的10% FBS相比，有时在成纤维细胞培养基中使用15%或20%的FBS可改善细胞分裂情况。
重编程病毒载体的质量对实验成功至关重要。根据我们的经验，逆转录病毒载体相较于慢病毒载体或其他非整合型病毒效率更高；然而，这一结果可能依赖于病毒载体的质量和纯度。商业化的逆转录病毒载体试剂盒通常会标明病毒载体浓度，有时还会提供针对特定细胞系的感染复数（multiplicity of infection, MOI）。需要注意的是，原代成纤维细胞与公司用于测定病毒载体感染效率的细胞系存在差异。此外，即使订购相同的商业化试剂盒，不同批次之间也常存在差异。再者，不同成纤维细胞系对病毒载体的摄取效率也各不相同。某些细胞系可能更为敏感，导致转导后的细胞死亡，而另一些细胞系则可能对病毒感染更具抗性。因此，确定特定细胞系的转导效率尤为重要，特别是当该细胞系生长缓慢或先前的重编程尝试失败时。根据我们的经验，评估特定逆转录病毒载体所需用量的最佳方法是使用不同稀释度的病毒载体进行免疫荧光染色，随后计数各载体中表达外源基因的细胞数量，目标转导效率应达到70%或更高。在我们的实践中，大多数细胞系可使用相似的MOI值，但必要时也可进行调整。
在转化过程中，关键是要避免过早传代细胞。细胞何时准备好进行传代取决于多种因素，包括原代细胞系及其特性、所用病毒载体的质量以及培养基的质量。重要的是，当细胞保持高密度时，转化成功率更高。即使细胞开始出现形态变化，也应尽量延长其在第一代培养孔中的时间，避免过早传代。如果传代过早，转化过程可能停滞，并导致细胞重新分化为成纤维细胞样的形态和行为。此外，过早稀释细胞可能导致细胞体更加细长，而不同于此前观察到的神经前体细胞（NPCs）的小而紧凑的细胞形态。因此，首次传代应始终采取保守策略：与过度稀释相比，以1:1或1:2的比例传代、使细胞维持较高密度更为有利。初次传代后出现一定程度的细胞死亡是正常现象。值得注意的是，细胞在传代后的第一天通常会显得状态更差（更扁平），这是正常情况。对细胞形态的最佳判断应在传代后2-3天进行。此外，生长因子和培养基组分的质量也至关重要。建议配制小量含生长因子的培养基，确保完全配制好的培养基最多仅在5-7天内使用完毕。切勿将培养基长时间置于室温或37°C环境中。使用后应尽快完成换液操作，并立即冷藏保存。另外，将培养基体积维持在1 mL而非2 mL，可能特别有助于那些较难转化的细胞系。若细胞快速消耗培养基（可通过培养基颜色由红变黄来判断，即酸化速率加快），可将培养基体积调整至最多2 mL。快速消耗培养基是一个积极信号，常在转化后期伴随增殖能力增强而出现。
神经前体细胞（NPCs）对培养基中accutase的存在也非常敏感，因此必须严格控制accutase的孵育时间，保持较短。我们建议孵育时间为2–4分钟，并频繁在显微镜下观察细胞，以确定其何时已脱离培养皿表面。传代后必须对细胞进行离心，以从培养基中彻底去除酶混合物。同时需注意细胞传代次数，因为长期培养可能导致细胞系发生改变，从而引起表达谱的变化。因此，应在早期传代时冻存大量细胞种子至关重要。细胞应使用含10% DMSO和90% NPC培养基的冻存液进行冻存，并长期保存于液氮中。由于该培养基不含血清，必须使用冻存盒确保缓慢降温；冻存过夜后，应立即转移至液氮中。尽管本方案未进行克隆筛选，但长期培养和反复传代可能导致初始细胞群体中具有优势生长和存活能力的细胞被自然选择出来。因此，在开展实验时，必须始终注意细胞的传代次数和操作方式。我们倾向于在实验中使用较低传代次数的细胞，尽可能不超过20次传代。由于NPCs增殖迅速，可在较低传代阶段冻存大量细胞以供后续实验使用。增殖速度特别快的细胞系更容易引起培养基酸化，因此，鉴于不同细胞系的增殖速度存在差异，可能需要根据其增殖情况调整培养基用量。若细胞长期处于高度酸化的培养基中，将会影响对照组和疾病组细胞系的健康状态，甚至导致正常星形胶质细胞转变为反应性状态，进而影响其在后续分化和实验中的应用。
对于星形胶质细胞的分化，保持细胞处于低密度状态非常重要，因为高密度会抑制细胞分化，并导致细胞以更高的速率持续增殖。因此，需要根据每种细胞系的增殖速率调整接种密度。我们建议尝试不同的接种密度，并通过星形胶质细胞标志物的染色或RT-PCR检测，以确保实现充分的分化。诱导性星形胶质细胞（iAs）的质量可通过与健康对照组进行神经元共培养实验来评估。在疾病病理未引起反应性表型的前提下，神经元在与iAs接触的情况下应能维持数天的存活。星形胶质细胞的形态在不同细胞系之间可能存在显著差异，并可能受到疾病表型的影响。此外，在星形胶质细胞严重受损的疾病中，它们可能表现出反应性表型，具有较大且细长的突起结构。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢所有患者和健康志愿者为研究工作捐赠了关键样本。此外，我们感谢罗谢尔·罗德里戈（Rochelle Rodrigo）在组织培养方面持续提供的专业技术支持，以及劳拉·费拉尤奥洛（Laura Ferraiuolo）作为合作方在其实验室中独立验证了该技术。本研究获得了美国国立卫生研究院基金项目 R01 NS644912-4 和 RC2 NS69476-01（授予 A.L.S.）、帕卡德肌萎缩侧索硬化症研究中心基金项目 P2ALS 以及 Helping Link 基金会的资助。K.M. 还获得了瑞士国家科学基金会、肌肉萎缩症协会青年研究者发展奖、蕾特综合征研究信托基金以及 SCN2A 基因相关疾病家庭基金会的资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 100 mm × 2 mm 培养皿，细胞培养处理，无热原 | Corning | 430167 | 组织培养 |
| 15 ml 圆锥形螺帽离心管，共聚物聚丙烯材质 | USA Scientific | 1475-1611 | 用于细胞悬浮与离心 |
| 50 mL 圆锥形离心管 | USA Scientific | 1500-1811 | 培养基制备 |
| 抗生素-抗真菌剂（100X） | Gibco | 15240062 | 具有抗真菌活性的抗生素，用于培养基制备 |
| B-27 添加剂（50X），无血清 | Invitrogen | 17504044 | 用于神经前体细胞（NPC）及基础培养基 |
| 冻存管 1.2 mL | Corning | CLS430658-500EA | 用于细胞冻存 |
| DMEM，高糖，含 GlutaMAX 添加剂，含丙酮酸 | Gibco | 10569010 | 用于成纤维细胞和星形胶质细胞培养基 |
| DMEM/F-12，含 GlutaMAX 添加剂 | Gibco | 10565042 | 用于神经前体细胞（NPC）及基础培养基 |
| DMSO | Sigma | D2438-50ML | 用于细胞冻存 |
| Dulbecco’s 磷酸盐缓冲液（PBS） | Gibco | 14190136 | 在实验方案中简称为 PBS，用于纤连蛋白稀释和细胞洗涤 |
| EZ 逆转录病毒诱导多能干细胞重编程试剂盒 | ALSTEM | RF101 | 含有 Yamanaka 因子的逆转录病毒。病毒也可自行制备。 |
| 胎牛血清，经认证 | Gibco | 16000-036 | 在实验方案中简称为 FBS，用于成纤维细胞和星形胶质细胞培养基 |
| Fisherbrand 一次性无菌注射器 | Fisher | 14-955-461 | 过滤培养基（50 mL） |
| 来源于猪肠黏膜的肝素钠盐 | Sigma | H3149-10KU | 在实验方案中简称为肝素，用于转化培养基。粉末溶于超纯水，终储备浓度为 5000X |
| 人血浆纤连蛋白纯化蛋白 | Millipore Sigma | FC010-10MG | 在实验方案中简称为纤连蛋白，以 1:200 比例稀释用于包被 |
| 异丙醇（技术级） | Fisher Scientific | S25372A | 用于细胞冻存 |
| Mr. Frosty 冻存盒 | Thermo Fisher | 5100-0001 | 用于细胞冻存 |
| N-2 添加剂（100X） | Gibco | 17502048 | 用于星形胶质细胞、神经前体细胞（NPC）及基础培养基 |
| 重组人 EGF | Preprotech | AF-100-15 | 在实验方案中简称为 EGF，用于转化培养基。粉末溶于 PBS，终浓度为 1 mg/mL，分装后冷冻保存 |
| 重组人碱性 FGF | Preprotech | 100-18B | 在实验方案中简称为 FGF，用于神经前体细胞（NPC）及转化培养基。粉末溶于 PBS，终浓度为 1 mg/mL，分装后冷冻保存 |
| StemPro Accutase 细胞解离试剂 | Gibco | A1110501 | 在实验方案中简称为 Accutase，用于转化过程及神经前体细胞（NPC）的细胞悬浮 |
| Stericup Quick Release-GP 无菌真空过滤系统 | Millipore Sigma | S2GPU05RE | 培养基过滤 |
| 组织培养板，6 孔，平底，带低蒸发盖 | Fisher | 08-772-1B | 组织培养 |
| 胰蛋白酶-EDTA（0.05%），含酚红 | Invitrogen | 25300062 | 用于成纤维细胞和星形胶质细胞的细胞悬浮 |
| Whatman Puradisc 25 注射器滤器，0.2 μm，PES 材质，无菌 | Millipore Sigma | 80-2502 | 过滤培养基（50 mL） |
参考文献
- Leenaars, C. H. C., et al. Animal to human translation: a systematic scoping review of reported concordance rates. Journal of Translational Medicine. 17 (1), 223(2019).
- Rhrissorrakrai, K., et al. Understanding the limits of animal models as predictors of human biology: lessons learned from the sbv IMPROVER Species Translation Challenge. Bioinformatics. 31 (4), 471-483 (2015).
- Hartung, T. Thoughts on limitations of animal models. Parkinsonism & Related Disorders. 14, Suppl 2 81-83 (2008).
- Ladewig, J., Koch, P., Brustle, O. Leveling Waddington: the emergence of direct programming and the loss of cell fate hierarchies. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (4), 225-236 (2013).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Hamada, M., Malureanu, L. A., Wijshake, T., Zhou, W., van Deursen, J. M. Reprogramming to pluripotency can conceal somatic cell chromosomal instability. PLoS Genetics. 8 (8), 1002913(2012).
- Stricker, S. H., Gotz, M. Epigenetic regulation of neural lineage elaboration: Implications for therapeutic reprogramming. Neurobiology of Disease. 148, 105174(2020).
- Tang, Y., Liu, M. L., Zang, T., Zhang, C. L. Direct Reprogramming Rather than iPSC-Based Reprogramming Maintains Aging Hallmarks in Human Motor Neurons. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 359(2017).
- Kelaini, S., Cochrane, A., Margariti, A. Direct reprogramming of adult cells: avoiding the pluripotent state. Stem Cells Cloning. 7, 19-29 (2014).
- Kim, E., Tae, G. Direct reprogramming and biomaterials for controlling cell fate. Biomaterials Research. 20, 39(2016).
- Kim, J., et al. Direct reprogramming of mouse fibroblasts to neural progenitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (19), 7838-7843 (2011).
- Tian, C., et al. Direct conversion of dermal fibroblasts into neural progenitor cells by a novel cocktail of defined factors. Current Molecular Medicine. 12 (2), 126-137 (2012).
- Mertens, J., Marchetto, M. C., Bardy, C., Gage, F. H. Evaluating cell reprogramming, differentiation and conversion technologies in neuroscience. Nature Reviews Neuroscience. 17 (7), 424-437 (2016).
- Kim, J., Ambasudhan, R., Ding, S. Direct lineage reprogramming to neural cells. Current Opinion in Neurobiology. 22 (5), 778-784 (2012).
- Ieda, M., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell. 142 (3), 375-386 (2010).
- Ambasudhan, R., et al. Direct reprogramming of adult human fibroblasts to functional neurons under defined conditions. Cell Stem Cell. 9 (2), 113-118 (2011).
- Kogiso, T., Nagahara, H., Otsuka, M., Shiratori, K., Dowdy, S. F. Transdifferentiation of human fibroblasts into hepatocyte-like cells by defined transcriptional factors. Hepatology International. 7 (3), 937-944 (2013).
- Grath, A., Dai, G. Direct cell reprogramming for tissue engineering and regenerative medicine. Journal of Biological Engineering. 13, 14(2019).
- Meyer, K., et al. Direct conversion of patient fibroblasts demonstrates non-cell autonomous toxicity of astrocytes to motor neurons in familial and sporadic ALS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (2), 829-832 (2014).
- Lee, M., et al. Direct Reprogramming to Human Induced Neuronal Progenitors from Fibroblasts of Familial and Sporadic Parkinson's Disease Patients. International Journal of Stem Cells. 12 (3), 474-483 (2019).
- Meyer, K., Kaspar, B. K. Glia-neuron interactions in neurological diseases: Testing non-cell autonomy in a dish. Brain Research. 1656, 27-39 (2017).
- Verkhratsky, A., Parpura, V., Pekna, M., Pekny, M., Sofroniew, M. Glia in the pathogenesis of neurodegenerative diseases. Biochemical Society Transactions. 42 (5), 1291-1301 (2014).
- Ettle, B., Schlachetzki, J. C. M., Winkler, J. Oligodendroglia and Myelin in Neurodegenerative Diseases: More Than Just Bystanders. Molecular Neurobiology. 53 (5), 3046-3062 (2016).
- Ferraiuolo, L., et al. Oligodendrocytes contribute to motor neuron death in ALS via SOD1-dependent mechanism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (42), 6496-6505 (2016).
- Palpagama, T. H., Waldvogel, H. J., Faull, R. L. M., Kwakowsky, A. The Role of Microglia and Astrocytes in Huntington's Disease. Frontiers in Molecular Neuroscience. 12, 258(2019).
- Maezawa, I., Swanberg, S., Harvey, D., LaSalle, J. M., Jin, L. W. Rett syndrome astrocytes are abnormal and spread MeCP2 deficiency through gap junctions. Journal of Neuroscience. 29 (16), 5051-5061 (2009).
- Hautbergue, G. M., et al. SRSF1-dependent nuclear export inhibition of C9ORF72 repeat transcripts prevents neurodegeneration and associated motor deficits. Nature Communications. 8, 16063(2017).
- Almad, A., Maragakis, N. J. A stocked toolbox for understanding the role of astrocytes in disease. Nature Reviews Neurology. 14 (6), 351-362 (2018).
- Gatto, N., et al. Directly converted astrocytes retain the ageing features of the donor fibroblasts and elucidate the astrocytic contribution to human CNS health and disease. Aging Cell. , (2020).
- Caiazzo, M., et al. Direct conversion of fibroblasts into functional astrocytes by defined transcription factors. Stem Cell Reports. 4 (1), 25-36 (2015).
- Vangipuram, M., Ting, D., Kim, S., Diaz, R., Schule, B. Skin punch biopsy explant culture for derivation of primary human fibroblasts. Journal of Visualized Experiments. (77), e3779(2013).
- Pear, W. Transient transfection methods for preparation of high-titer retroviral supernatants. Current Protocols in Molecular Biology. , Chapter 9 Unit 9 11(2001).
- Boczonadi, V., et al. Mutations in glycyl-tRNA synthetase impair mitochondrial metabolism in neurons. Human Molecular Genetics. 27 (12), 2187-2204 (2018).
- Rinaldi, F., Motti, D., Ferraiuolo, L., Kaspar, B. K. High content analysis in amyotrophic lateral sclerosis. Molecular and Cellular Neuroscience. 80, 180-191 (2017).
重印与许可
标签
