将DNA晕圈制备与荧光原位杂交相结合，可实现对基因组与核骨架相互作用的高分辨率分析。与核骨架结合的基因组会使得杂交的荧光信号位于残留的提取细胞核内部，而未结合的基因组则位于环绕残留细胞核的DNA晕圈区域中。
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摘要
摘要
基因组与细胞核内的多种结构相关联，以调控其活性并将其锚定在特定位置。这些结构统称为核骨架，包括核纤层、核仁和核体。尽管目前已存在多种荧光原位杂交（FISH）技术用于研究基因组及其空间组织，但这些方法通常受限于分辨率，且难以充分揭示基因组与核内结构之间的关联信息。DNA晕圈法利用高盐浓度和非离子型去污剂处理，使基因组中锚定区域仍与核内结构相连，而其余DNA则形成伸展的环状结构。在此过程中，可溶性核蛋白（如组蛋白）、脂质以及未紧密结合于核基质的DNA被提取去除，从而形成围绕残余核的DNA晕圈。该残余核则保留了与核内结构紧密结合的DNA以及抗提取的蛋白质。这些延伸的DNA链可提高分辨率，并有助于物理图谱的构建。结合FISH技术后，该方法还能进一步研究基因组与所有锚定结构之间的相互作用。这种被称为HALO-FISH的技术具有高度灵活性，可将DNA晕圈与核酸探针联用，以显示基因位点、整条染色体、α卫星序列、端粒，甚至RNA。该技术为理解正常 细胞及疾病进展（如癌症）中的核结构与功能提供了重要视角。
引言
的 "细胞核 基质" 1974年由Berezney和Coffey首次描述1在对大鼠肝细胞核进行高盐浓度提取及核酸酶处理后，他们鉴定出一种蛋白质性质的结构骨架。随后由此方法衍生出DNA晕环技术，该技术通过去除可溶性蛋白，仅保留核基质（NM）以及与核基质相关的蛋白和染色体。DNA附着区域位于DNA环的基部，被称为基质附着区（MARs）或支架附着区（SARs），这些区域分别对高盐浓度和离子型去垢剂锂-3,5-二碘水杨酸盐（LIS）的提取具有抗性。在DNA晕环结构中，与MARs/SARs相关的DNA被固定在残余的核结构内，而DNA环则从这些位点向外延伸，形成DNA晕环。目前我们已知，基因组通过与核纤层相连的结构域（LADs）锚定于核纤层，并通过核仁相关区域（NADs）以及可能的其他核结构（如特定的核体）实现锚定。
DNA晕轮法可用于DNA、基因和染色体区域的物理作图，因为延伸的DNA和染色质具有更高的分辨率，此时染色质已去除组蛋白，DNA被充分拉伸2,3,4,5,6。然而，将DNA晕轮用于此目的时也存在一些局限性。例如，与DNA晕轮中残留核结构紧密结合的DNA可能无法被探针接触，从而无法进行分析和物理作图6。其他技术如纤维荧光原位杂交（fiber-FISH）2,4,5,7和分子梳技术（molecular combing）8也可实现物理作图，且具有操作相对快速简便的优势。这两种方法在基因的DNA作图中均优先于DNA晕轮法。这些方法通过溶剂或盐提取从细胞核中分离染色质纤维，其中分子梳技术通常具有更好的可重复性8,9。
越来越多的证据表明，核骨架在支持关键的核内过程方面发挥着重要作用，例如DNA的附着位点、染色质重塑、DNA转录、DNA修复和DNA复制11,12。因此，人们开发了DNA晕轮技术，用于研究在这些细胞活动中核骨架与基因组之间的相互作用，并已在研究中被常规使用和报道。该技术还被用于研究基因组与核骨架之间的相互作用，特别是在疾病进展方面，已发现与恶性肿瘤相关的核结构改变11。
DNA晕轮技术还被用于研究发育和分化过程中基因组与核骨架之间的关系12。许多研究采用了一种称为halosperm的DNA晕轮技术变体13，若与FISH联用则称为SpermHalo-FISH14。精子染色质紧密地与被称为鱼精蛋白的蛋白质结合，该技术的开发旨在提高对精子DNA的可及性。halosperm已被用于评估精子DNA的完整性，并判断是否存在DNA损伤。DNA损伤较少的精子对应较大的DNA晕轮尺寸，而DNA断裂和损伤程度较高的精子则表现为晕轮较小或完全无晕轮。因此，halosperm可作为评估体外受精（IVF）中胚胎质量和妊娠成功潜力的预后标志物13。这一实例突显了该技术潜在的临床应用价值。在我们的研究中，我们采用HALO-FISH技术来分析早衰症（Hutchinson-Gilford Progeria Syndrome, HGPS）中基因组行为的变化以及特定药物治疗的影响15。
这些研究及其他研究共同凸显了DNA晕轮技术可用于研究的过程和应用范围，以及该技术的实用性。
方案
1. 载玻片制备、灭菌与细胞培养
- 准备 500 mL 的 10% HCl（v/v），倒入一个大烧杯中。
- 将显微镜载玻片逐片放入酸中，在 2 ×g 的摇床上于室温孵育 1 小时。
注意：HCl 具有腐蚀性且为刺激物，可能引起严重的皮肤灼伤、眼部损伤，并对皮肤、眼睛和呼吸系统产生刺激。务必穿戴适当的个人防护装备，包括腈类手套、眼部防护装置和实验服。 - 将酸从烧杯中倾倒掉，用自来水清洗载玻片十次，再用去离子水清洗十次。
- 用甲醇冲洗载玻片两次，并将载玻片保存在甲醇中，直至通过火焰灭菌。
注意：甲醇为高度易燃液体，若吞咽、接触皮肤或吸入均有毒性。此外，甲醇可能造成器官损伤，具有腐蚀性和刺激性。应遵守工作场所暴露限值，穿戴适当的个人防护装备，包括丁基橡胶手套、眼部防护装置和实验服。尽可能在局部排气通风（LEV）通风柜中操作。 - 使用金属镊子或长柄钳从盛有甲醇的烧杯中取出一张显微镜载玻片，在本生灯火焰上灼烧以灭菌，然后转移至靠近本生灯的矩形细胞培养皿中，该培养皿内含四个用于放置载玻片的隔室。
注意：火焰灭菌可在使用前立即对显微镜载玻片进行灭菌，但该方法存在相关风险。由于甲醇高度易燃，盛放载玻片的烧杯必须远离本生灯放置。应使用能牢固夹持载玻片的长镊子或钳子。烧杯中的甲醇液面应刚好浸没载玻片，以尽量减少甲醇用量，并确保仅有镊子/钳子的末端接触甲醇。使用后务必确保甲醇已从镊子或钳子上完全蒸发，并在将其放回盛有载玻片和甲醇的烧杯前充分冷却。烧杯应用铝箔覆盖，以防甲醇着火时隔绝氧气。切勿在 II 级层流罩内进行火焰灭菌，因其内部空气处于循环状态。 - 或者，执行步骤 1.1 至 1.4，但在甲醇孵育后不进行火焰灭菌，而是将载玻片置于无绒布纸上自然晾干。干燥后用铝箔包裹，并放入灭菌烘箱或高压灭菌器中处理。
- 在含血清的适当培养基中，于 37 °C、5% CO2 条件下培养细胞至少 48 小时，直至细胞融合度达到 60–70%。本实验使用了早期传代的人类皮肤成纤维细胞（HDFs）、经典型早老综合征（HGPS）成纤维细胞（AG06297）以及非典型 2 型 HGPS 成纤维细胞（AG08466）。分别收获各类型细胞，使用血细胞计数板计数以确定细胞密度。每张载玻片接种 1 × 105 个细胞（10 mL 培养基）。
注意：细胞密度至关重要，若细胞密度过高，不同细胞核释放的 DNA 环可能相互重叠。接种密度需根据所用细胞类型进行优化，因为转化细胞增殖较快，而后期传代的细胞可能需要更长时间才能达到目标融合度。 - 若需使细胞在 G0 期停滞以进入静止状态，则每张载玻片接种 1 × 105 个细胞（10 mL 培养基），培养 24 小时。用无血清培养基洗涤细胞两次，随后在含低浓度血清（0.5% 新生牛血清 NCS 或胎牛血清 FBS）的标准培养基中孵育 7 天。
- 若需评估细胞在 DNA 晕环实验中的增殖状态，则可通过检测 DNA 复制过程中 5-溴-2'-脱氧尿苷（BrdU）的掺入情况，确定已通过 S 期的细胞。
- 正常接种细胞并培养 24 小时。移除培养基，更换为含 BrdU 和 5-氟-2'-脱氧尿苷（3 µg/µL）的培养基。继续培养 24 小时后，移除培养基，用培养基（10% NCS）洗涤细胞一次，再补充新鲜培养基（10% NCS）。继续孵育 24 小时，随后准备载玻片进行 DNA 晕环实验。
2. 探针制备
- 染色体全染色体及染色体臂显带探针
- 采用Telenius等人的方法，通过简并寡核苷酸引物聚合酶链式反应（DOP-PCR）扩增流式分选或显微切割的染色体来制备染色体探针。16使用DOP-PCR通过Biotin-16-dUTP或Digoxigenin-11-dUTP标记染色体探针，如图所示 表 1请查阅制造商提供的扩增程序说明，但本实验所用条件如下 如图所示 表2.
- 通过将8种组分混合，制备染色体臂或全染色体探针 µ标记的PCR产物L，7 µL of Cot-1 DNA，3 µ鲱鱼精子的 L，1/20th 3 M 醋酸钠（pH 5.4）溶液 1 体积和 100% 乙醇 2 体积。将探针溶液在 -80 ℃ 至少孵育 30 分钟 °C.
注意：该方法可用于制备单条染色体探针，或在对每条目标染色体使用不同标记（即 Biotin-16-UTP 和 Digoxigenin-11-dUTP）时，制备多条染色体探针。
注意：乙醇为高度易燃液体和蒸气，可能引起严重眼刺激。应远离热源、高温表面和点火源。遵守工作场所暴露限值，穿戴适当的个人防护装备，包括丁基橡胶手套、眼部防护用具和实验室外套。尽可能在局部排风设备中操作 通风橱 - 以13,700 x g离心探针溶液 g 4℃下孵育15分钟 °C，然后用70%乙醇洗涤。重复离心步骤并弃去上清液，注意不要扰动或丢失DNA沉淀。让DNA沉淀干燥。
- 加入12 µL 杂交缓冲液（50% 甲酰胺，10% 硫酸葡聚糖，10% 20× 柠檬酸钠盐水（SSC；3 M NaCl，0.3 M 三钠柠檬酸盐；pH 7.0），1%（v/v）聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯（Tween-20））加入 DNA 沉淀中。37 ℃ 孵育 °在杂交缓冲液中至少溶解2小时，以确保DNA沉淀完全溶解。
警告：甲酰胺具有致癌性和致畸性，可能对未出生胎儿造成严重危害。女性若已怀孕或怀疑怀孕，应避免接触甲酰胺。甲酰胺必须在局部排风罩（LEV）通风橱中使用。应遵守工作场所暴露限值，并穿戴适当的个人防护装备，包括丁基橡胶手套、护目用具和实验服。
- 从细菌人工染色体（BACs）中分离DNA
- 从BAC克隆的甘油保藏菌中取少量，划线接种于Luria-Bertani（LB）琼脂平板（1%（W/V）NaCl；1%（w/v）胰蛋白胨，0.5%（w/v）酵母提取物，1.5%（w/v）技术级琼脂，12.5 μg/mL氯霉素）上 µg/mL（w/v）氯霉素）。37℃过夜培养 °C.
- 从平板上挑选单个菌落，接种于10 mL LB培养基（1% (w/v) NaCl，1% (w/v) 胰蛋白胨，0.5% (w/v) 酵母提取物，12.5 µg/mL（w/v）氯霉素），37℃摇床过夜培养 °C.
警告：氯霉素可能致癌。请小心操作并减少接触。 - 将培养物在 1,700 x g 室温下孵育10分钟。
- 弃去上清液，加入 300 µP1 溶液 15 mM Tris（pH 8）、10 mM EDTA、100 µ将 g/mL RNase A 加入沉淀中，剧烈涡旋振荡，然后将细胞转移至 2 mL 微离心管中。
- 加入300 µL 的 P2 溶液（0.2 M NaOH，1% (w/v) 十二烷基硫酸钠 (SDS)）逐滴加入细胞中。将封闭的微量离心管颠倒 5 次，并在室温下静置最多 5 分钟。
注意：氢氧化钠具有腐蚀性，可能导致严重皮肤灼伤和眼部损伤。对金属也可能具有腐蚀性。操作时需小心，尽量减少接触。应遵守工作场所暴露限值，并穿戴适当的个人防护装备，包括丁腈橡胶手套、护目用品和实验室外套。尽可能在局部排风柜（LEV）中操作 通风橱
警告：十二烷基硫酸钠为易燃固体，吞食有害，可能引起皮肤和呼吸道刺激，还可能导致严重的眼损伤。务必穿戴适当的个人防护装备，包括丁腈橡胶手套、护目用具和实验室外套。尽可能在局部排风设施中操作 通风橱 - 加入300 µ加入 3 M 醋酸钾（P3）溶液 L 至细胞中，轻轻混匀。将微量离心管置于冰上 10 分钟。
- 8,100 x g 离心 g 4℃下10分钟 °C，将上清液转移至含有800 µL 冰冷的异丙醇。反复倒置离心管数次，并于 -20 °C 孵育。 °C 过夜。
注意：异丙醇是一种高度易燃的液体和蒸气，可能引起严重的眼部刺激、嗜睡或头晕。应远离热源、高温表面和点火源。遵守工作场所暴露限值，并确保佩戴适当的个人防护装备，包括丁腈橡胶手套、眼部防护用具和实验服。尽可能在局部排风罩（LEV）通风柜内操作。 - 8,100 x g 离心 g 4℃下15分钟 °C. 移除上清液并转移至另一试管中。加入 500 µ冰冻的70%乙醇L。倒置离心管数次，在8,100 x g 4℃下5分钟 °C.
- 移去上清液，并在室温下将沉淀空气干燥。待沉淀干燥后，重新悬浮于 40 µL 的焦碳酸二乙酯处理水（DEPC 处理）中，4 ℃ 放置 °C过夜。完全重悬后，移除5 µ1% 琼脂糖凝胶上加样 L 的溶液，检测 DNA 的存在。
- 通过缺口平移法进行BACs的单基因探针制备
- 使用市售的缺口平移标记试剂盒。或者，使用以下方案。参见 表3 用于成分和体积。
- 加入以下组分 表3 在微量离心管中混合，最后加入DNA聚合酶I，轻轻混匀，短暂离心数秒。将溶液在15 °C下孵育。 °C，2 小时。
- 为验证片段大小，加载 5 µ将溶液中的 L 加样至 2% 琼脂糖凝胶上。DNA 片段大小范围应在 200–600 bp 之间。如果 DNA 片段尺寸较大，则需将溶液继续在 15 °C 下孵育额外 15 分钟。 ˚C 并在 2% 琼脂糖凝胶上电泳分离产物。
- 通过加入 10 mM EDTA 和 0.1% SDS（2.5）终止缺口平移反应 µ0.5 M EDTA，pH 8.0，100 L µL 和 1 µ100 毫升含 10% 十二烷基硫酸钠的溶液 µL）。将溶液在 65 °5分钟，C
- 为了去除未掺入的核苷酸，将BAC探针加入离心柱中。商用离心柱可直接购买，也可使用注射器自行制备，步骤如下：
- 加入30 g Sephadex G-50至500 mL柱缓冲液（10 mM Tris-HCl（pH 8），1 mM EDTA，0.1% SDS）中。将混合物高压灭菌。同时，配制500 mL柱缓冲液（不含Sephadex G-50），并高压灭菌。
- 通过将经高压灭菌的玻璃棉置于1 mL注射器底部来制备离心柱。用含柱缓冲液的Sephadex G-50填满1 mL注射器。将该1 mL注射器放入一个15 mL离心管中，离心管底部放置一个无盖的微量离心管。在1,600 x g 5 分钟。
- 移除注射器并丢弃底部的微量离心管。将一支新的微量离心管放回15 mL离心管中。向1 mL注射器中加入柱缓冲液（不含Sephadex G-50），并重新插入15 mL离心管中。在1,600 x g 5分钟。重复此步骤两次。
- 移除注射器并插入含有新洁净微量离心管的15 mL离心管中。将探针加入注射器，并在微量离心管中收集探针。
- 加入5以沉淀DNA探针 µL鲱鱼精子DNA（10 mg/mL），10 µL 醋酸钠和 2.25 倍体积的 100% 乙醇加入 DNA 溶液中。轻轻混匀溶液，并于 -80 ℃孵育。 ˚C 至少 1 小时。在 13,700 x g 4℃下15分钟 °C.
- 弃去上清液，用 200 µ4 ℃下，用 15 mL 冰冷的 70 % 乙醇处理 15 分钟 °C. 移除上清液并空气干燥。干燥后，将沉淀重悬于 20 µL 的 DEPC 处理水，室温下数小时，或 4 ℃ 过夜 °C. 探针现已可直接使用，或可在 -20 ℃ 保存 °C.
- 每个载玻片混合5 µ用5标记探针DNA µ加入Cot-1 DNA，使用Speed Vac真空浓缩仪干燥。待沉淀干燥后，重悬于12 µL 的杂交混合液。
3. DNA晕轮制备
- 从培养箱中取出装有载玻片及贴壁细胞的方形培养皿。弃去培养基，用铅笔标记载玻片，并将其放入盛有 50 mL 冰冷细胞骨架（CSK）缓冲液（含 100 mM NaCl、3 mM MgCl2、0.3 M 蔗糖、10 mM 哌嗪-1,4-二乙磺酸（PIPES；pH 7.8）、0.5% (v/v) Triton X-100，溶于去离子水中）的考普林瓶中。在冰上或 4 °C 下孵育 15 分钟。
注意：Triton X-100 可引起皮肤刺激和严重眼损伤。操作时应佩戴适当的个人防护装备，包括丁腈手套、护目镜和实验服。 - 弃去 CSK 缓冲液，迅速用 50 mL 1x DNA 晕环缓冲液（DHB；140 mM NaCl、27 mM KCl、110 mM NaHPO4、15 mM KH2PO4；pH 7.4）冲洗载玻片三次，即：将载玻片浸入盛有 DHB 的考普林瓶中后立即取出。
- 将载玻片转移至盛有 50 mL 提取缓冲液（含 2 M NaCl、10 mM PIPES（pH 6.8）、10 mM 乙二胺四乙酸（EDTA）、0.1% (w/v) 皂苷、0.05 mM (v/v) 精胺、0.125 mM (v/v) 亚精胺）的考普林瓶中。室温孵育 4 分钟。
注意：皂苷如吞咽或与皮肤接触有毒，吸入可致死。确保在局部排风柜中操作皂苷，并穿戴实验服、丁腈手套（双层）、护目镜和口罩。精胺和亚精胺均可能引起严重皮肤灼伤和眼损伤，而 EDTA 可引起严重眼刺激，因此需谨慎操作每种化学品。
备注：将皂苷粉末溶于 60–70 °C 的水中单独配制。待其冷却后加入提取缓冲液。为保持生物活性，最后向提取缓冲液中加入精胺、亚精胺和皂苷。 - 将载玻片依次在 50 mL 的 10x DHB（1.4 M NaCl、270 mM KCl、1.1 M NaHPO4、150 mM KH2PO4；pH 7.4）、5x、2x 和 1x DHB 中孵育，每次 1 分钟。
- 将载玻片垂直浸入并取出，依次通过 50 mL 的 10%、30%、70% 和 95% (v/v) 乙醇梯度溶液。
- 将载玻片自然晾干，并于 -80 °C 保存，直至进行二维荧光原位杂交（2D FISH）实验。
4. 二维荧光原位杂交
- 配制20× SSC：3 M NaCl，0.3 M 三钠柠檬酸盐，pH 7.0。该缓冲液可高压灭菌，室温保存，按需稀释使用。
- 配制70%（v/v）甲酰胺、2x SSC（pH 7.0），加热至70℃ °在水浴中，37°C。
- 将载玻片依次浸入70%、90%和100%乙醇中，每种浓度各孵育5分钟，每次50 mL。
- 在加热板上晾干载玻片，然后于70℃烘箱中烘烤 °C 水浴 5 分钟。
- 将载玻片置于70%甲酰胺、2x SSC溶液中，在70℃下变性2分钟 °C.
注意：步骤 4.5 中的温度和时间至关重要。如果温度过低，DNA 将无法变性，探针无法杂交，从而无法获得 DNA 晾衣绳 FISH 的信号。 - 将变性后的载玻片置于50 mL冰浴70%乙醇中5分钟，随后在室温下依次经过90%、95%和100%乙醇各5分钟。
- 在加热板上风干
- 按照制造商说明书操作直接标记的全人类染色体探针。在本实验中，我们使用了 人类全染色体涂染探针1、13、15、17和18。此外，在本实验中， CCND1 和 CTNNA1 使用了基因探针。
注意：整条染色体探针和BAC基因特异性探针均使用生物素-11-dUTP进行标记，并通过与Cy3（Cyanine 3）偶联的链霉亲和素进行检测。对于通过DOP-PCR制备的染色体涂染探针以及通过缺口平移法标记的BAC DNA，此后在本实验方案中统称为DNA探针，并按如下方式处理。 - 变性DNA探针（全染色体涂染探针或基因特异性探针）于75 °在热块或水浴中于 C 下加热 10 分钟。
- 将DNA探针在37℃下预热 °在移液前，于金属浴或水浴中 30 分钟内升温至 C µ将L置于合适的载玻片上。
注意：此步骤对于阻断染色体重复序列至关重要。若不执行，可能在DNA晕FISH中产生非特异性信号。 - 用21 mm × 21 mm的盖玻片覆盖探针，并使用橡胶水泥密封。
- 37℃下孵育载玻片至少18 h ˚在加湿的杂交室中。
注意：可使用夹心盒制作加湿的杂交室，盒内放置多层湿润的纸巾，并用剪裁过的10 mL塑料移液管搭建一个抬高的平台以承载载玻片。表面覆盖铝箔以最大限度减少光照暴露。 - 用镊子小心地移除橡胶胶水。
- 将载玻片置于50 mL 50% (v/v) 甲酰胺、2x SSC、pH 7.0 的溶液中孵育，溶液预先加热至45 ˚C，每次孵育5分钟，共三次。
注意：在50% (v/v) 甲酰胺、2x SSC、pH 7.0 溶液中的第一次孵育时，应让盖玻片自然从载玻片上脱落。此举可防止因“拖拽”盖玻片而对DNA晕环制备物造成损伤。可通过镊子夹持载玻片在缓冲液中轻轻振荡，以帮助盖玻片脱落。 - 接下来，将载玻片放入50 mL预热至60℃的0.1x SSC、pH 7.0溶液中 ˚C，但置于45 ˚C 水浴中孵育 5 分钟，并更换缓冲液两次，每次孵育 5 分钟。
- 将载玻片放入盛有50 mL 4x SSC（pH 7.0）溶液的柯铂兰染色缸中，室温下孵育15分钟，期间更换缓冲液三次。
- 加入100 µ每张载玻片上加入含4% BSA的4x SSC溶液100 μL，覆盖一层石蜡膜，室温孵育10分钟。此步骤可防止抗体的非特异性结合。
- 为检测标记探针（biotin-16-dUTP），与100 µ1% BSA、4x SSC 中按 1:200 稀释的链霉亲和素-Cy3 溶液，室温孵育 1 小时。
注意：使用抗体时应遵循制造商提供的稀释说明，并在实验前进行预实验以确定最佳稀释比例，确保获得良好的信号 - 将载玻片放入盛有50 mL 4x SSC（0.5% Tween-20）pH 7.0溶液的柯林瓶中，室温下孵育15分钟，期间更换缓冲液三次。若无需进行免疫荧光染色，此时可按照步骤4.21所示进行封片。
- 若需确定制成DNA晕环的细胞的增殖状态，可在FISH步骤后、封片前使用抗pKi67抗体染色，或对掺入的BrdU进行染色。
- 将载玻片在50 mL 1×磷酸盐缓冲液（PBS）中洗涤3次，每次5分钟，随后在室温下用含4% NCS的PBS封闭1小时。
- 加入200 µ将所需的一抗（兔抗人 pKi67；小鼠抗 BrdU）各 L 加至载玻片上，覆盖一段石蜡膜，室温孵育 1 小时。
- 将载玻片用1×PBS洗涤3次，每次5分钟，然后在室温下于200中孵育1小时 µL 氟素标记的二抗（pKi67：猪抗兔 TRITC；BrdU：驴抗鼠 Cy3）。用 PBS 再洗涤 3 次，每次 5 分钟。所有稀释均使用含 1% (v/v) NCS 的 PBS，按生产商推荐的稀释范围进行。
- 将载玻片用20 µ含 DAPI 的封片剂 L，用 22 mm × 50 mm 盖玻片封片。
5. 端粒PNA荧光原位杂交
- 为检测端粒，请使用端粒PNA FISH试剂盒 - FITC，并按照制造商说明书进行操作。除特别说明外，所有步骤均应在室温下进行。
- 将载玻片浸入Tris缓冲盐水（TBS，pH 7.5）中2分钟，随后放入3.7%甲醛（溶于TBS，v/v）中，精确处理2分钟。
注意：TBS溶液含有10-30%三羟甲基氨基甲烷（trometamol）和10-30% 2-氨基-2-(羟甲基)丙烷-1,3-二醇盐酸盐，可能引起严重的眼部和皮肤刺激，操作时应佩戴防护手套及护目镜/面部防护装置。请在通风良好的环境中使用。 - 在Coplin染色缸中用TBS清洗载玻片两次，每次5分钟。
- 将载玻片浸入预处理溶液中10分钟，随后用TBS清洗两次，每次5分钟。
- 接着将载玻片依次浸入冰浴乙醇系列中，分别为70%、85%和95%（v/v）乙醇各50 mL，每种浓度处理2分钟。之后让载玻片自然晾干。
- 根据所选荧光标记颜色，向每张载玻片上加10 µL端粒PNA探针/FITC（或Cy3），并加盖盖玻片。在预热至80 °C的烘箱中孵育5分钟，随后置于暗处约1小时。
注意：端粒PNA探针/FITC含有6-100%甲酰胺，可引起严重眼部刺激，且具有致畸性，可能对胎儿造成严重危害。女性若已怀孕或怀疑怀孕，应避免接触甲酰胺。甲酰胺应在局部排风罩（LEV）中使用，并佩戴适当的眼部或面部防护装备。 - 为去除盖玻片，先将载玻片浸入“冲洗液”中1分钟，然后置于“洗涤液”中，在65 °C下处理5分钟。
注意：洗涤液含有1-5%聚氧乙烯辛基苯基醚和1-5%氯化钠，具有腐蚀性，可导致严重眼部损伤。处理洗涤液时务必佩戴护目镜或面部防护装置。 - 将载玻片依次通过50 mL冰浴乙醇系列（70%、85%和95%，v/v），每种浓度处理2分钟，随后自然晾干。干燥后，用含DAPI的封片剂封片，并加盖盖玻片。
6. 图像采集与分析
- 使用落射荧光显微镜（例如 Leica DM4000 显微镜），配合 HC PL FLUOTAR 100X/1.30 油镜物镜和 DFC365FX 相机，采集图像以观察 DNA 晕环和染色体区域。
- 采集灰度图像，并为每个采集的通道定义颜色，以实现图像的伪彩显示。本实验使用了商业软件（例如，LAS AF 版本 4.5.0 软件）。各个颜色通道以 TIFF 格式导出。
- 使用 Java 图像处理程序 Fiji ImageJ 分析图像。通过按下上传图像 文件 以及 开放.
- 分别加载图像通道或通过点击将复合图像拆分为独立的灰度通道 图像 | 颜色 | 拆分通道. 选择一个图像通道并单击 图像 | 调整 然后选择 亮度 & 对比. 相应调整并用其他通道重复操作。
- 通过选择显示细胞核的DAPI染色通道，创建残余细胞核的掩膜。点击 图像 | 调整 然后选择 阈值. 将出现一个对话框，可在其中调整阈值，请勾选 深色背景 盒中。调整至残余细胞核清晰后按压 应用 并关闭对话框。
注意：这会基于像素强度生成二值掩膜，其中白色像素显示感兴趣区域，黑色像素显示背景。在探针通道上重复相同的操作。 - 使用手绘选区工具勾勒出残余细胞核的边缘，然后单击 编辑 以及 清晰外部将探针通道叠加到残余细胞核上。此操作可通过按下 图像 | 颜色 | 合并通道.
- 在 ImageJ 中设置测量尺度，需在标尺上或两个已知距离的点之间画一条线。然后前往 分析 并按压 设置比例尺. 在对话框中输入距离长度，然后单击 OK. 测量距离时，在待测点之间画一条线，然后单击 分析 | 测量这将把距离值传输到数据窗口。
- 测量最亮的 DAPI 荧光强度，该位置对应于细胞核的中心。由此测量从核中心到最远染色体区域边缘（CTE）的距离。测量核中心到核边缘（NE）的距离。
- 将结果表示为 CTE/NE 比值。此处，从细胞核中心到每条染色体区域最远边缘（CTE）的距离除以从细胞核中心到相应核边缘（NE）的距离。该计算应在至少 50 个细胞核上进行。结果可用柱状图或箱形图表示。
- 对于端粒的分析，每个数据集至少分析30个细胞核。可使用Fiji ImageJ软件或手动分析图像，统计残余细胞核内及DNA晕环内的端粒数量。通过BrdU或pKi67标记可区分增殖期（BrdU/pKi67阳性）与衰老/静止期（BrdU/pKi67阴性）的细胞核。数据可用柱状图表示，误差线代表均值的标准误（SEM）。
- 使用非配对样本 t 检验对结果进行统计学比较，p 值小于 0.05 被认为具有统计学显著性。> 0.05 被认为具有显著性。
结果
这种DNA晕圈制备方法有助于我们研究年轻细胞与衰老细胞之间基因组行为的差异，同时也可用于研究来源于早衰性疾病、具有异常核骨架蛋白的细胞。15. 图1 展示了DNA晕轮的示例，其中可观察到残余细胞核的边缘、残余细胞核内保留的DNA，以及延伸至周围区域形成DNA晕轮的游离DNA。图中还描绘了用于获取残余细胞核以及进行核边缘（NE）和细胞质延伸（CTE）测量的分析方法。可通过在S期细胞中掺入标记核苷酸（如BrdU），或使用增殖标志物抗pKi67抗体进行检测，以区分增殖与非增殖细胞；后者可显示G1期细胞中的核仁及异染色质区域。17,18. 在高血清条件下培养但未达到汇合状态且增殖标志物呈阴性的原代细胞，被认为处于衰老状态。在低血清条件下培养或已达到汇合状态（即接触抑制）且增殖标志物呈阴性的原代细胞，则被视为静息状态，在给予适当营养和条件的情况下能够重新进入增殖细胞周期。能够区分Ki67阳性与阴性细胞，使我们得以明确增殖中、静息态及衰老态人皮肤成纤维细胞之间的差异。 图2 显示了增殖性人皮肤成纤维细胞的DNA晕轮结构，这些细胞在DNA复制过程中掺入了BrdU，该机制不存在于非增殖细胞中，随后用抗BrdU抗体进行染色。同时可见增殖标志物抗-pKi67抗体的染色结果 图2。该抗原稳定性强，可耐受FISH实验流程，因此可在FISH后、封片前进行染色。因此，增殖细胞在左列显示BrdU和抗pKi67抗体阳性（红色），而非增殖细胞，尤其是衰老细胞在 图2 显示在右侧栏中。绿色信号是使用端粒PNA FISH/FITC试剂盒检测出的单个端粒。将免疫荧光与DNA晕轮技术相结合，可实现对不同细胞状态下的分析，如图所示。 图2 在研究增殖、静息和衰老细胞时。根据所选抗体的不同，还可检测其他条件，例如分化、通过辐照引起的DNA损伤等。
染色体区域也可通过FISH在DNA晕中进行可视化。由于制备过程中允许DNA从细胞核中解旋释放，染色体区域的形态可能受到干扰，其部分可能出现在DNA晕中，出现程度大小不一，这取决于基因组在残余细胞核及其结构内的锚定情况。 图3 显示了一组DNA晕轮图像，其中使用特异性的全染色体臂涂染探针（红色）揭示了染色体1、13、17和18的个体形态。抗-pKi67抗体（绿色）用于标记增殖细胞，而在同一培养物、同一载玻片上缺乏该标记的细胞则代表衰老细胞。从图像及以CTE/NE形式呈现的数据可以明显看出，基因贫乏的小型染色体18与残余细胞核结构的连接较少，其DNA晕轮从残余细胞核向外延伸更远，显著地比其他染色体更远离残余细胞核中心。然而，染色体1也表现出类似特征。通过增殖标志物抗-pKi67，可在同一培养物和同一载玻片上比较增殖细胞与衰老细胞，该分析显示，在这两种状态截然不同的细胞中，染色体与残余核结构的连接程度并无显著差异。
有趣的是，在经过DNA晕（DNA Halo）制备后，增殖细胞与衰老细胞之间在基因定位方面也显示出统计学上的显著差异，具体表现为基因在残余细胞核内或DNA晕中的分布情况。图4展示了用红色标记的BAC探针界定的基因位点（loci），以及绿色的抗Ki67染色结果。在DNA晕制备后，增殖细胞与衰老细胞之间的基因定位未见显著差异。然而，与几乎很少见的细胞周期蛋白D1 CNDD1 位点相比，连环蛋白α1 CTNNA1 位点在DNA晕中显著更多。图5展示了以绿色显示端粒的DNA晕制备结果。背景信号被有意保留较高，以便在DNA晕内可视化端粒信号。在本组数据中，包含了静止期细胞（即经血清饥饿处理7天的细胞），有趣的是，与增殖细胞和衰老细胞相比，静止期细胞中未连接且位于DNA晕内的端粒数量显著更多。在图5a中可以观察到DNA晕中端粒所占比例，尤其是“实验2”的图像。这与图5b相对应，其中静止期细胞中位于DNA晕内的端粒平均比例约为17%。有部分证据表明，并非衰老细胞中的所有端粒均可被观察到，因为其中一些可能非常短。
采用DNA晕轮法，我们已成功用于研究疾病细胞核内基因组相互作用的改变15。图6展示了原代对照成纤维细胞与典型（核纤层蛋白A突变）及非典型Hutchinson-Gilford早衰综合征疾病细胞在染色体锚定方面的差异，后者表达不同的SUN1异构体且无核纤层蛋白A突变19。与对照组DNA晕轮相比，染色体1和13在残留细胞核内的锚定位置显示出统计学上的显著差异。图6b将整个染色体区域的位置与残留细胞核及DNA晕轮进行关联。数值等于或小于1表示染色体位于残留细胞核内，而大于1的数值则表示染色体或其部分位于DNA晕轮中。
总体而言，这凸显了HALO-FISH在研究全染色体、特定基因和端粒在多种影响细胞周期（增殖、静息和衰老）或疾病细胞（如早衰症和癌细胞系）条件下的基因组相互作用方面的实用性。事实上，这些状态之间相互作用的差异表明，核骨架在调控细胞核内关键生物学过程中具有重要作用。
图1：人真皮成纤维细胞（HDF）提取的细胞核显示残余细胞核与DNA晕圈，以及分析方法概览。（a）通过DNA晕圈实验制备的人真皮成纤维细胞（HDF）细胞核，并用DAPI复染。染色较亮的残余细胞核显示DNA锚定在核骨架上，其周围为未附着的DNA，形成环绕的DNA晕圈结构。放大倍数 = ×100；比例尺 10 µm。（b）蓝色通道捕捉DAPI染色的细胞核及其周围DNA信号。使用ImageJ软件选取并去除残余细胞核。箭头表示从细胞核中心至残余核边缘（NE）的距离。（c）红色通道显示探针信号。（d）标注为“结果”的图像为红色通道与蓝色通道图像叠加后的结果，可用于测量从细胞核中心至最远端染色体区域边缘（CTE）的距离。请点击此处查看该图的高清版本。
图2：增殖性与衰老性人真皮成纤维细胞（HDFs）的DNA晕圈制备结合端粒PNA FISH分析。对经DNA晕圈实验处理的人真皮成纤维细胞（HDFs）进行端粒PNA FISH检测。端粒信号以绿色（FITC）显示，残留DNA与晕圈DNA用DAPI复染呈蓝色，增殖性细胞核则通过间接免疫荧光法使用抗-BrdU或抗-pKi67抗体在红色（TRITC）中检测。放大倍数 = ×100；比例尺 = 10 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3： 利用DNA晕环实验分析核骨架-染色体相互作用。（a）对经DNA晕环制备的人成纤维细胞（HDFs）进行针对染色体1、13、15、17和18的2D-FISH实验。整条染色体以红色（Cy3）标记，细胞核同时用pKi67探针检测以判断其处于增殖或衰老状态。增殖细胞（pKi67+）以绿色（FITC）勾勒轮廓，而衰老细胞（pKi67-）无绿色信号，保持未染色状态。放大倍数 = ×100；比例尺为10 µm。（b）在经历HALO-FISH处理的增殖期与衰老期HDFs中，核骨架对染色体的锚定情况。图中数据显示增殖（pKi67+）与衰老（pKi67-）细胞中染色体区域边缘（CTE）至相应核边缘（NE）的距离比值。误差线表示±标准误（SEM）。（c）pKi67+与pKi67-细胞核中特定染色体的染色体区域边缘（CTE）至相应核边缘（NE）的改良箱型图表示。Q1 = 下四分位数；Min = 记录的最小值；Med = 中位数；Max = 记录的最大值；Q3 = 上四分位数。 请点击此处查看该图的高清版本。
图4： 使用HALO-FISH技术在HDF细胞中检测基因特异性相互作用。（a）通过基因特异性探针（CCND1 和 CTNNA1）对提取的DNA晕圈核进行杂交，以研究这些基因在增殖细胞和衰老细胞中与核基质（NM）的锚定情况。基因信号显示为红色（Cy3），抗-pKi67 标记增殖细胞，信号显示为绿色（FITC）。在增殖细胞的 CCND1 图像中，残留细胞核位于白色圆圈内，白色与绿色圆圈之间的区域代表DNA晕圈。放大倍数 = ×100；比例尺 10 µm。（b）比较残留细胞核与DNA晕圈之间的 CCND1 和 CTNNA1 基因特异性信号，以及增殖细胞与衰老细胞之间的信号差异。误差线表示 ± 标准误（SEM）。请点击此处查看该图的高清版本。
图 5： 利用端粒 PNA-FISH 探针检测静止期 HDF 细胞的 DNA 晕轮实验。（a）通过在低血清培养基中培养 7 天诱导 HDF 细胞进入静止状态。进行 DNA 晕轮实验，PNA-FISH 利用 FITC 信号（绿色）显示端粒，残余细胞核及周围的 DNA 晕轮用 DAPI 复染（蓝色）。同时使用抗-pKi67 抗体对细胞进行染色，以确认细胞核处于非增殖状态。该实验独立重复了两次。放大倍数 = ×100；比例尺 10 µm。（b）增殖期、衰老期和静止期 HDF 细胞中定位于 DNA 晕轮内的端粒平均百分比比较。误差线表示 ± 标准误（SEM）。请点击此处查看该图的放大版本。
图6：利用HALO-FISH技术检测HGPS细胞中整条染色体与核骨架的锚定情况26。（a）对照组HDF（2DD）、经典型HGPS（AG06297）和非典型2型HGPS（AG08466）细胞核经过DNA晕圈制备后，使用针对染色体1、13、15和17的全染色体涂染探针进行2D-FISH。整条染色体以绿色（FITC）显示，DNA用DAPI复染呈蓝色。放大倍数 = ×100；比例尺为10 µm。（b）通过测量染色体区域边缘（CTE）平均值与细胞核边缘（NE）的比值，确定提取后细胞核内染色体的位置。比值大于1表明最远的CTE位于DNA晕圈内的相应NE之外，而比值小于1则表明最远的CTE位于残余细胞核内的NE之内。请点击此处查看该图的高清版本。
| 组分 | 体积(μL) |
| 5XDOP-PCR缓冲液 | 10 |
| dNTP混合液（不含dTTP）(2 mM) | 5 |
| dTTP (2 mM) | 2 |
| 生物素-16-dUTP 或 地高辛-11-dUTP | 10 |
| DOP引物 (20 μM) | 5 |
| Taq DNA聚合酶 (1 U/μL) | 1 |
| PCR级水 | 12 |
| 模板 | 5 |
表1：显示DOP-PCR组分及单次反应体积的表格
| 步骤 | 循环次数 | 温度（摄氏度） | 时间 |
| 初始变性 | 1 | 95 | 3 min |
| 变性 | 34 | 98 | 20 s |
| 引物退火 | 62 | 1 min | |
| 延伸 | 72 | 30 s | |
| 最终延伸 | 1 | 72 | 5 min |
| 冷却 | 4 | 保持 |
表2：显示DOP-PCR循环、温度和时间程序的表格。
| 组分 | 体积μL) |
| 10x NT缓冲液（0.5 M Tris-HCl pH 8，50 mM MgCl₂，0.5 mg/ml BSA） | 5 |
| 0.1 M β-巯基乙醇 | 5 |
| 10倍核苷酸储备液（0.5 mM dATP，0.5 mM dCTP，0.5 mM dGTP，0.5 mM dTTP，0.5 mg/ml 生物素-16-dUTP） | 5 |
| Dnase I (1 ng/ml) | 2 |
| DNA聚合酶 I | 5U 每 μg DNA的 |
| DNA模板 (1 μg) | 1 |
| DEPC处理水 | 为了 50 μL |
表3：显示单个探针的切口平移组分及体积的表格。
讨论
在分析核骨架与基因组之间的相互作用时，DNA晕圈法是一种理想的选择方法，但有一些关键步骤必须严格遵守。其中最重要的参数之一是细胞接种密度的优化。如果细胞过度融合，DNA晕圈将与邻近细胞重叠，从而无法进行分析。CSK缓冲液和提取缓冲液必须在使用当天新鲜配制，并在提取缓冲液制备过程的最后阶段加入亚精胺、精胺和皂苷，以保持其生物活性。若进行Halo-FISH实验，必须特别注意DNA晕圈的变性温度，以确保探针或染料能够随后有效杂交。
电子显微镜已被用于观察核基质，并已鉴定出丝状结构20。然而，电子显微镜存在局限性，因为难以推断基质与染色质之间的关联。事实上，与电子显微镜相比，DNA晕环法更具多功能性，可检测特定基因、染色体以及细胞状态。此外，目前正对核基质蛋白进行蛋白质组学分析21,22。该方法适用于比较核基质组分，特别是在比较病变细胞时效果良好，但它无法提供标准DNA晕环技术所揭示的空间分布和连接信息。
DNA晕轮实验确实存在一些局限性。首先，由于需要提取细胞基质，该实验只能在固定细胞上进行，因此无法实现活细胞成像。尽管DNA晕轮实验本身操作相对快速简便，但若将细胞培养、探针制备、晕轮FISH（Halo-FISH）以及数据分析等整个流程综合考虑，整体过程可能较为耗时。
采用超分辨率显微镜对DNA晕和HALO-FISH进行成像，将显著提高DNA特异性探针和抗体的分辨率。此外，由于荧光染料在光谱上更容易被区分，有可能在单次实验中同时使用多种DNA探针，从而提供更丰富的信息。染色体构象捕获（3C）等分子生物学技术的进步已被用于确定基因位点间的相互作用，并分析细胞内染色质的空间组织结构。DNA晕实验与3C技术可结合使用，该联合方法称为M3C23，再次体现了DNA晕技术的可扩展性与适应性。
本文展示的原始数据旨在演示基因组行为研究的可能性以及如何呈现这些数据。通过这些数据，我们证明了可以利用以下方法确定基因组附着性的显著差异：（1）染色体涂染探针，在本研究中揭示染色体18是所分析染色体中附着性最低的（图3）；（2）基因位点，两个基因位点之间存在显著差异（图4）；（3）端粒，在静止细胞中其附着强度低于增殖细胞和衰老细胞（图5）。我们能够通过增殖标志物Ki67抗原的存在与否来区分增殖与非增殖细胞，该抗原为不溶性蛋白，因此保留在残余细胞核中；或者通过核苷酸掺入法标记在特定时间段内经历S期的细胞（图2）。该技术还使我们能够分析核骨架受损细胞（即层蛋白病细胞）中的基因组行为；在此以及Bikkul等（2018年）的研究中，我们发现与对照细胞相比，此类细胞的基因组附着性较弱，而在使用特定药物治疗后，可缓解经典HGPS细胞中lamin A突变的影响，从而恢复基因组附着性15。然而，本文首次报道了非典型HGPS AGO8466细胞的新数据：这类细胞缺乏lamin A突变，但含有异常形式的LINC复合物蛋白SUN119，其染色体13的附着性较弱（图6）。
HALO-FISH 是一种独特的方法，可通过结合间接免疫荧光技术研究基因组与核骨架的相互作用，从而检测在提取过程中未被去除的蛋白质。已有研究表明，核骨架在多种疾病（如某些癌症类型19）中发生改变，并且一些与核骨架相关的蛋白质作为诊断生物标志物具有重要意义24,25。因此，该技术在研究核骨架对疾病状态下染色质结构有序性或紊乱性的影响方面具有重要作用15,24,25,27，且不仅限于人类细胞；使用来自其他动物的染色体涂染探针，同样可采用相同的DNA晕环实验方案28。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢 Michael Bittner 教授慷慨赠送染色体臂涂染探针。LG 得到了欧盟资助的 EURO-Laminopathies 项目和 Brunel 早衰症研究基金的支持。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 10X PBS | Thermo Fisher Scientific | 10388739 | 用于形成DNA晕环 |
| 5-溴-2′-脱氧尿苷 | Sigma-Aldrich | B5002-100MG | 标记核苷酸 |
| 5-氟-2′-脱氧尿苷 | Sigma-Aldrich | F0503-100MG | 标记核苷酸 |
| 琼脂（技术级） | Thermo Fisher Scientific | 15562141 | BAC克隆的DNA分离 |
| 琼脂糖 | Sigma-Aldrich | A939-50G | 检测DOP-PCR和缺口平移产物大小 |
| 非典型2型HGPS成纤维细胞（AG08466） | Coriell研究所 | AG08466 | 细胞系 |
| 胰蛋白胨 | Thermo Fisher Scientific | 16269751 | BAC克隆的DNA分离 |
| 生物素-16-dUTP | Roche诊断 | 11093711103 | 标记核苷酸 |
| 氯霉素 | Sigma-Aldrich | C0378-25G | BAC克隆的DNA分离 |
| 经典型Hutchinson-Gilford早衰综合征（HGPS）成纤维细胞（AG06297） | Coriell研究所 | AG0297 | 细胞系 |
| 考普林瓶 | Thermo Fisher Scientific | 12608596 | 可容纳5张或8张背靠背放置的载玻片 |
| Cot-1 DNA | Thermo Fisher Scientific | 15279011 | 在HALO FISH中阻断非特异性杂交 |
| DEPC处理水 | Sigma-Aldrich | 693520-1L | BAC克隆的DNA分离 |
| 硫酸葡聚糖 | Sigma-Aldrich | S4030 | 杂交混合液组分 |
| 皂苷 | Sigma-Aldrich | D141 | 提取缓冲液组分 |
| 地高辛-11-dUTP | Sigma-Aldrich | 11093088910 | 标记核苷酸 |
| 驴抗小鼠Cy3 | Jackson实验室 | 715-165-150 | 二抗 |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E6758 | 提取缓冲液组分 |
| 乙醇 | 提取缓冲液组分 | ||
| 乙醇 | Sigma-Aldrich | 443611 | 探针沉淀和HALO FISH |
| 胎牛血清系统 | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | 细胞培养用血清 |
| 甲酰胺 | Thermo Fisher Scientific | 10523525 | DNA晕环的二维FISH |
| 玻璃棉 | Sigma-Aldrich | 18421 | 离心柱 |
| 鲱鱼精子DNA | Sigma-Aldrich | D7290 | 探针沉淀 |
| HXP™ 灯（金属卤化物显微镜灯） | OSRAM | HXP-R120W45C VIS | DNA晕环成像 |
| 盐酸 | Thermo Fisher Scientific | 10313680 | 清洗显微镜载玻片 |
| 异丙醇 | Sigma-Aldrich | I9516-25ML | BAC克隆的DNA分离 |
| KAPA HiFi PCR试剂盒 | KAPA生物系统 | KK2103 | PCR试剂盒 |
| 配备DFC365 FX相机和LAS AF（版本：4.5.0）图像采集软件的Leica DM4000荧光显微镜 | Leica显微系统 | DNA晕环成像 | |
| LB琼脂 | Thermo Fisher Scientific | 13274843 | BAC克隆的DNA分离 |
| 氯化镁 | Sigma-Aldrich | M8266 | CSK缓冲液组分 |
| 甲醇 | Thermo Fisher Scientific | 10284580 | 清洗和灭菌显微镜载玻片 |
| 小鼠抗BrdU抗体 | BD Pharmingen | B2531-100UL | BrdU可视化 |
| 新生牛血清 | Thermo Fisher Scientific | 16010159 | 细胞培养用血清及封闭试剂 |
| 缺口平移试剂盒 | Invitrogen | ||
| PCR级水 | Sigma-Aldrich | 693520-1L | PCR和BAC克隆的DNA分离 |
| PCR引物 | Sigma-Aldrich | ||
| PIPES | Sigma-Aldrich | P1851 | CSK缓冲液和提取缓冲液组分 |
| 乙酸钾 | Sigma-Aldrich | P1190-100G | BAC克隆的DNA分离 |
| QuadriPERM® 4 X 12 | SARSTEDT | 94.6077.307 | 方形细胞培养皿，聚苯乙烯材质，含四个隔室。 具有疏水表面，无菌、无热原/内毒素，且无细胞毒性。 |
| 兔抗Ki67抗体 | Sigma-Aldrich | ZRB1007-25UL | 增殖标志物 |
| RNase A | Sigma-Aldrich | R6513 | BAC克隆的DNA分离 |
| 橡胶胶水 | Halford's | 101836 | DNA晕环的二维FISH |
| Sephadex G-50 | Sigma-Aldrich | S6022-25G | 离心柱 |
| 乙酸钠 | Sigma-Aldrich | S2889 | 探针沉淀 |
| 氯化钠 | Sigma-Aldrich | S5886 | CSK、提取缓冲液和SSC缓冲液组分 |
| 柠檬酸钠 | Sigma-Aldrich | C8532 | SSC缓冲液组分 |
| 十二烷基硫酸钠 | L3771-100G | BAC克隆的DNA分离 | |
| 氢氧化钠 | Sigma-Aldrich | S8045-500G | BAC克隆的DNA分离 |
| 亚精胺 | Sigma-Aldrich | S2626 | 提取缓冲液组分 |
| 精胺 | Sigma-Aldrich | S4264 | 提取缓冲液组分 |
| 链霉亲和素-Cy3 | Amersham生命科学有限公司，科学实验室用品 | pa43001 | 探针抗体 |
| 蔗糖 | Sigma-Aldrich | S0389 | CSK缓冲液组分 |
| 蔗糖 | Sigma-Aldrich | S0389 | CSK缓冲液+A66:D68 |
| SuperFrost™ 显微镜载玻片 | Thermo Fisher Scientific | 12372098 | 显微镜载玻片：厚度1 mm，长度76 mm，宽度26 mm，未包被。 |
| 猪抗兔TRITC | Dako | ||
| TELO-PNA FISH试剂盒 | Agilent Dako | K532511-8 | 端粒界定 |
| Tris-HCl | Sigma-Aldrich | T3253-100G | 柱缓冲液 |
| Triton™ X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | CSK缓冲液组分 |
| 胰蛋白胨 | Thermo Fisher Scientific | 10158962 | BAC克隆的DNA分离 |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416- 100ML | 去垢剂 |
| 含DAPI的Vectashield封片剂 | Vector Laboratories | H-1200 | DNA晕环的二维FISH |
| 全人类染色体探针 | Calbiochem | DNA晕环的二维FISH | |
| 酵母提取物 | Thermo Fisher Scientific | 10108202 | BAC克隆的DNA分离 |
参考文献
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- Foster, H. A., Griffin, D. K., Bridger, J. M. Interphase chromosome positioning in in vitro porcine cells and ex vivo porcine tissues. BMC Cell Biology. 13 (1), 30(2012).
重印与许可
勘误
Formal Correction: Erratum: Fluorescence In Situ Hybridization on DNA Halo Preparations to Reveal Whole Chromosomes, Telomeres and Gene Loci
Posted by JoVE Editors on 6/05/2023. Citeable Link.
An erratum was issued for: Fluorescence In Situ Hybridization on DNA Halo Preparations to Reveal Whole Chromosomes, Telomeres and Gene Loci. The Authors section was updated from:
Lauren S. Godwin1
Joanna M. Bridger1
Helen A. Foster2
1Laboratory of Nuclear and Genomic Health, Centre for Genome Engineering and Maintenance, Division of Biosciences, Department of Life Sciences, College of Health, Medicine and Life Sciences, Brunel University London
2Biosciences, Department of Clinical, Pharmaceutical and Biological Science, School of Life and Medical Sciences, University of Hertfordshire
to:
Lauren S. Godwin1
Emily Roberts2
Joanna M. Bridger1
Helen A. Foster2
1Laboratory of Nuclear and Genomic Health, Centre for Genome Engineering and Maintenance, Division of Biosciences, Department of Life Sciences, College of Health, Medicine and Life Sciences, Brunel University London
2Biosciences, Department of Clinical, Pharmaceutical and Biological Science, School of Life and Medical Sciences, University of Hertfordshire
