左心室功能障碍是多种心脏疾病的共同终末通路。本文提供了一种经胸多巴酚丁胺负荷超声心动图技术的详细方案，用于全面评估心脏疾病小鼠模型的左心室功能及心脏表型。
本文内容
摘要
摘要
左心室（LV）功能障碍是多种心脏疾病发展的最终通路。通过在人体中应用无创高频经胸多巴酚丁胺负荷超声心动图，现已能够采用还原论的研究方法揭示心脏功能的细微变化。本文提供了一种在小鼠中应用该技术的实验方案，以促进对生理和病理状态下左心室结构与功能的深入分析，从而观察在非应激心脏中难以发现的心脏疾病模型中的功能改变。该检测可在同一只动物身上重复进行，既可获取基础状态下的数据，也可获得药物诱导应激状态下的测量结果。我们详细阐述了合适的麻醉标准、基于影像的左心室分析方法、对观察者内和观察者间变异性的考量，以及在接近生理条件下经腹腔注射多巴酚丁胺后小鼠体内可实现的正性肌力反应的获取方法。为了在小型动物模型中重现人类生理与疾病的特征，我们强调了评估过程中需注意的关键陷阱，例如小鼠中显著的博维奇效应（Bowditch effect）。为进一步实现转化研究目标，我们比较了人类与小鼠在应激诱导效应上的异同。在开展转化研究时，必须关注小鼠与人类之间的生理差异。由于小鼠模型在空间和时间分辨率方面的限制，实验严谨性要求对患者中常用的某些评估参数在小鼠中使用时必须谨慎对待。
引言
人类许多心脏疾病的特征是左心室（LV）的收缩和/或舒张功能受损。为了检测结构异常、诊断和管理收缩性心力衰竭，以及评估心力衰竭症状患者的舒张功能，超声心动图被用作一种基本的评估手段。
由于症状缺乏特异性，且超过三分之一具有心力衰竭临床综合征的患者实际上可能并未罹患心力衰竭，因此寻找与患者临床表现相对应的客观超声心动图指标至关重要。1此外，某些在静息或静态状态下隐匿的症状可能在活动或应激条件下出现。在冠状动脉疾病患者中，冠状动脉灌注的轻微改变即可导致节段性室壁运动异常。然而，这些细微变化无法通过常规超声心动图进行评估，因为心脏病变的改变可能在无应激状态下被掩盖。为了更深入地理解心脏的生理病理状态，应激超声心动图可在运动或药物诱导的应激条件下对心肌结构和功能进行动态评估，从而实现症状与心脏发现的对应分析2此外，在小型动物中，该方法是一种非侵入性的可靠方法 体内工具3,4,5与人类相似，可通过药物在小鼠和大鼠中诱导心肌的应激反应。多巴酚丁胺是一种常用药物，多巴酚丁胺应激超声心动图在人类中被广泛应用。6,7 但仅偶尔用于小型动物模型以评估心脏应激反应8,9,10,11多巴酚丁胺是一种合成的儿茶酚胺类药物，主要具有β1受体激动作用，可增强心肌收缩力和心率。为了实现从人类到小鼠的正确转化，必须考虑超声心动图的技术和概念框架，以及与小鼠体型小和心率快等相关的技术限制。在人类多巴酚丁胺负荷超声心动图中，目标心率为[(220－年龄)×0.85]，在健康志愿者中平均可使心率增加约150±10%12,13对于小鼠，尚缺乏此类公式。在人类中，应激性超声心动图显示射血分数（EF）可增加5-20%。12,14. 小鼠的射血分数（EF）根据心率不同，报道为58 ± 11%（< 450 次/分钟）和 71 ± 11%（≥ 450 次/分钟），在心率较高时变化近 20%4小鼠增加心输出量的主要机制是心率的增加。这一机制部分归因于博迪奇效应（Bowditch效应），即一种频率依赖性的钙介导正性肌力心脏反应，该效应在小鼠中比在人类中更为显著。15,16此外，（负荷）超声心动图存在观察者间和观察者内变异。因此，高度标准化的操作流程必不可少。17,18.
本文介绍了多巴酚丁胺负荷超声心动图的详细操作步骤，旨在获取标准化图像，以揭示健康和疾病模型小鼠心脏功能的细微变化。关键步骤包括适当的麻醉、充分的心率监测，以及小鼠应激成像中可能遇到的陷阱。关键参数包括收缩功能和舒张功能的评估，并需考虑左心室射血分数（LVEF）。由于小鼠对后负荷诱导的心功能障碍具有抵抗性17，该方案也可为瓣膜性心脏病模型的研究提供有价值的信息。
方案
所有方法和操作均按照相关法规（《用于实验和其他科学目的的脊椎动物保护欧洲公约》（指令 2010/63/EU））进行，并符合动物护理的机构指南。人类受试者的数据分析符合所有机构、国家和国际人类福利指南，并已获得当地伦理委员会批准（20-9218-BO）。所有实验均使用 12 周龄的雄性 C57BL/6JRj 小鼠进行。
1. 材料与仪器的准备
注意：图1 展示了一个小动物超声工作场所的示例。
- 确保在安静且光线可调的受控环境中操作。
- 预热超声耦合剂，例如使用耦合剂加热器，使其升温至 37 °C。此过程可能需要一定时间。
- 使用消毒湿巾清洁所有器械，包括平台。
- 开启平台并预热至 37 °C。
- 打开超声成像设备，输入动物编号、实验方案编号及其他相关信息。对体重约为 30 g 的小鼠，使用中心发射频率为 30 MHz 的高频超声探头。
- 务必使用活性气体排出系统。
注意：若使用活性炭过滤器吸附呼出气流中的异氟烷，需定期检查滤芯重量，当达到规定的最大增重时应及时更换。 - 必要时，向蒸发器中加入适量异氟烷。
警告：避免吸入挥发性麻醉剂。 - 通过稀释现成的注射液或按照生产商说明将多巴酚丁胺盐酸盐粉末溶于 0.9% 生理盐水中，配制浓度为 2.5 µg/µL 的多巴酚丁胺工作液。该溶液在室温下保存至少 24 小时内稳定。
图1小型动物心脏超声工作站 人体工学设置对于小动物应激性超声心动图检查至关重要，因为检查时间必须保持较短。工作区域包括一台超声设备、一套配备氧气供应和主动废气排出功能的小动物麻醉系统，以及一个内置心电图监测和可调节运动功能的加热超声心动图检查平台。 通过 作为集成导轨系统一部分的显微操作器以及生理监测装置。用于加热超声耦合剂的凝胶加热器和加热灯是有用的辅助设备。 请点击此处以查看此图的放大版本。
2. 成像前小鼠的准备及麻醉诱导
- 将诱导室中充满含3%-4%（v/v）异氟烷的富氧气体混合物（以1 L/min流速通入100% O2）。
- 称量小鼠体重。轻轻抓住小鼠尾巴，将其转移至诱导室中。通过密切观察动物活动，确保其在数秒内进入镇静状态。
- 如有必要，将气流切换至连接麻醉系统的鼻罩（维持1.0-1.5 vol%异氟烷，同时以1 L/min流速通入100% O2，以保持稳定的镇静状态）。将小鼠从诱导室中取出，并小心放置于预热平台上。确保四肢置于平台内置的ECG传感器上。
- 为防止巩膜干燥，将眼膏涂抹于双眼。
注意：应力测量需要一定时间。 - 在ECG传感器上涂抹极少量导电膏。使用胶带轻轻固定小鼠四肢。用少量胶带固定小鼠头部于鼻罩中的位置。ECG用于在图像采集期间记录心率。调节生理成像系统，以获得稳定且清晰的ECG信号。
注意：导电膏过多可能导致ECG信号质量下降。 - 为防止小鼠在操作过程中受到应激，通过维持心率在400-450次/分钟（bpm）范围内来评估镇静深度是否合适。心率由ECG获取，允许在此范围内波动50 bpm。
注意：动物的活动可能提示镇静深度不足。麻醉不应导致小鼠心脏抑制。可根据上述目标心率范围调整镇静程度。 - 使用润滑剂后，轻柔插入直肠温度计以持续监测体温。将体温维持在生理范围内（通常根据小鼠品系和实验设置，介于36.5 °C至37.5 °C之间）。在未进行环境控制的小动物心脏超声实验室中，可考虑使用红外照明。
- 使用化学脱毛膏去除胸部体毛。用干净的湿纸巾擦拭胸部，确保清除所有残留的脱毛膏成分（图2A）。
注意：也可在使用脱毛膏前先用电动剪毛器进行初步处理。此时小鼠已准备就绪，可进行成像。由于必须尽量缩短成像时间，整个成像前准备过程应少于3分钟。
图2：动物与探头的放置位置。（A）将小鼠固定于加热平台上，四肢分别贴附在银质心电图电极上。插入直肠温度计以监测体温，鼻部轻轻插入麻醉系统的鼻罩中。（B）胸骨旁长轴切面（PSLAX）的探头方向；见步骤3.2。（C）胸骨旁短轴切面（PSSAX）的探头方向；见步骤3.3。（D）心尖四腔心切面（4CH）的探头方向；见步骤3.4。请点击此处查看该图的放大版本。
3. 基本心血管成像
注意：图像可以通过两种基本的探头位置（胸骨旁和心尖超声窗）（图2）以及至少三种超声模式（B（亮度）模式、M（运动）模式和多普勒模式（彩色多普勒和脉冲波（PW）多普勒））获取（图3、图4、图5）。有关成像基础，请参阅先前发表的文章16,18。获取清晰的图像以与后续获得的负荷图像进行比较至关重要。
- 将预热的超声耦合剂无气泡地涂抹于胸部。
注意：使用未加热的超声耦合剂会导致动物体温迅速下降，从而影响心率。 - 进行胸骨旁长轴（PSLAX）切面检查。
注意：PSLAX用于观察左心室的长轴视图。通过该切面可获取主动脉根部直径、近端主动脉直径以及左心室长度等参数。- 使动物头部背向操作者，将操作台向左倾斜约10–20°，向前倾斜5–10°，以尽可能使心脏前移。将探头置于胸骨旁，与心脏长轴对齐，探头标记（凹槽）朝向动物右肩（图2B）。
- 使用微调装置调整至最佳图像视野，并利用图像控制面板优化图像质量。在心室中部水平至少获取一幅二维B模式图像和一幅M模式图像。
- 根据具体研究需求获取其他额外图像。至少采集100帧图像，并包含至少3(–6)个完整的心动周期。
- 进行胸骨旁短轴（PSSAX）切面检查。
注意：PSSAX用于观察左心室的短轴视图。由此视图可计算左心室收缩末期容积（LVESV）、左心室舒张末期容积（LVEDV）、每搏输出量（SV）和心输出量（CO）。- 将探头顺时针旋转90°，保持角度不变（此时标记朝向动物左肩）（图2C）。在基底部、心室中部（乳头肌水平）和心尖部水平各至少获取一幅B模式图像。
- 为确定最基底和最心尖的切面，沿长轴方向移动至仍能完整观察左心室腔心动周期的最远端点。在心室中部水平，大致位于乳头肌层面的中间位置进行图像采集。
- 在心室中部短轴切面至少获取一幅M模式图像。
注意：部分超声设备为不同切面提供预设模式；建议在图像采集前确认选择合适的预设参数。
- 进行心尖四腔（4CH）切面检查。
注意：4CH切面非常重要，因其主要用于通过脉冲多普勒（PW doppler）评估二尖瓣功能。- 调整平台使动物处于改良的头低脚高位（Trendelenburg位），探头朝向小鼠头部，探头标记朝向动物左侧（图2D）。
- 至少获取一幅B模式图像，以及二尖瓣和三尖瓣的彩色多普勒与脉冲多普勒图像。根据实验需求，可在4CH切面应用组织多普勒成像。
注意：到达心尖四腔切面最简便的方法是从PSAX切面倾斜操作台并调整探头角度。操作时应避免对胸壁施加过大压力，以免干扰舒张功能等参数的测量。
4. 多巴酚丁胺负荷成像
注意：一旦达到目标心率，只要目标心率保持稳定，就应采集标准化切面图像。此过程通常需要在胸骨旁长轴切面（PSLAX）与胸骨旁短轴切面（PSSAX）之间进行多次切换。由于在 PSLAX 与 PSSAX 之间切换仅需旋转 90°，因此可轻松完成这两个切面的成像。
- 在同一动物身上进行多巴酚丁胺应激试验，并保持相同的麻醉状态，以确保结果具有可比性。确保起始心率稳定在400–450次/分钟范围内。记录心电图读数，并将其与所获取的图像一并保存。确保心电图信号清晰；否则，尝试重新粘贴四肢电极，直至显示清晰的心电图信号。
- 再次获取胸骨旁长轴切面（B模式和M模式图像），并将图像保存为“基线”图像。务必同时记录并记住初始心率。
- 预先抽取药物，使用27 G针头和1 mL注射器，按5 µg/g体重剂量将多巴酚丁胺经腹腔注射。密切观察心率变化，在达到目标心率前持续记录超声心动图图像，并将心率升高情况用于后续分析。通常在注射后约1分钟，心率增加15–30%即可达到稳定且显著的多巴酚丁胺诱导心率升高。
注意：每次对动物注射时均应使用一次性无菌注射针头，以防止感染。多巴酚丁胺的敏感性及（次）最大负荷可能因小鼠品系不同而异，也可能受实验条件影响，应在预实验中予以确定。建议根据具体实验设计调整多巴酚丁胺剂量。
警告：请遵循机构关于锐器及潜在感染性物品使用的安全指南。使用后的针头必须始终丢弃至经批准的医疗废物容器中！ - 当达到目标心率并保持稳定约30秒后，按照步骤3所述方法获取胸骨旁长轴切面的B模式和M模式图像。
- 随后，顺时针旋转探头以获取胸骨旁短轴切面，操作方法同步骤3所述。在此切面，获取基底部、中段心室（乳头肌水平）和心尖部的B模式图像，以及中段心室（乳头肌水平）的M模式图像。确保目标心率保持稳定；若心率波动，则切换回胸骨旁长轴切面位置，并重新开始成像。
注意：由于停止持续输注多巴酚丁胺后心率会下降12（本文未涉及持续输注方法），图像应在两分钟内完成采集。胸骨旁长轴和短轴切面图像对于大多数与应激相关的关键测量指标至关重要（详见“代表性结果”部分）。 - 接下来，再次获取心尖四腔切面图像（操作方法见步骤3.4）。使用脉冲多普勒（PW Doppler）测量感兴趣的血流模式（见步骤3.4.2说明）。在非应激状态下，通过脉冲多普勒可观察到两个特征性波形：一个代表心室的被动充盈（E（早期）波），另一个代表心房收缩后的主动充盈（A（心房）波）。随着心率升高，这两个波形趋于融合，在多巴酚丁胺诱导的应激状态下可能无法清晰分辨。
5. 最后步骤
- 大约5分钟后，当心率再次开始下降时，确保已采集所有切面图像。
- 使用干净的湿纸巾轻轻擦除胸部的超声耦合剂。小心移除固定胶带，特别注意固定动物头部的胶带，避免牵拉导致胡须被拔出。
- 关闭麻醉装置。如果使用主动式废气排出系统，请确保继续进行废气排出。将动物放置在独立的加热笼内，并在一张纸巾上使其苏醒。密切观察动物状态，在其恢复足够的意识以维持胸卧位之前，不得无人看管。待动物清醒并完全恢复后，将其转移回饲养笼中。
注意：由于该技术并非终点性操作，动物可依据所有相关法规继续参与实验。
6. 离线评估
- 将图像数据转移至工作站上的离线分析软件，以对心脏功能进行详细评估。需特别注意静息状态与应激状态下心脏功能的差异。心率应始终被记录并呈现。
注意：由于不同软件的分析方法存在差异，本方案未涵盖具体软件操作。请参考制造商提供的说明书。
结果
在PSLAX切面下获取的生理状态下无应激的超声心动图图像如图3所示。在舒张期，心室壁表现均匀（图3A），并出现一定程度的增厚（图3B、C）。腹腔注射5 µg/g体重剂量的多巴酚丁胺可显著提高心率（正性变时效应）12 和左心室射血分数（LVEF）（正性肌力效应）（图3，图6）。正性肌力效应在图3D–F中表现为左心室前壁在舒张期（LVAWd）增厚，收缩期（LVAWs）增厚更为明显，以及左心室后壁在舒张期和收缩期（LVPWd；LVPWs）均增厚（图3D、E）。该效应可能导致出现“心室壁接触”现象（图3F），即左心室内径（LVIDs）缩短至前壁与后壁似乎相互接触的程度（图3E）。LVEF可在PSLAX B模式下通过平面测量法测定（图3A、B、D、E）。
在PSSAX切面中，除了左室前壁（LVAW）和左室后壁（LVPW）外，还可观察到室间隔壁（LVSW）和侧壁（LVLW）（图4）。在心脏处于应激状态时，心室向中心呈均匀的环形收缩（图4D、E）。在PSSAX的M型超声中也可观察到“室壁接触”现象（图4F）。
二尖瓣血流频谱的脉冲多普勒（PW Doppler）记录显示舒张早期流速（E波）和舒张晚期心房收缩波（A波），E波与A波之间具有明显分离（图5A）。等容舒张时间（IVRT）用于评估舒张功能，而等容收缩时间（IVCT）反映收缩功能。在健康但处于应激状态的心脏中，这两个参数均显著降低（图6C，D）。图5B 显示E波与A波几乎融合，这种情况常随心率增快而出现。请注意，由于收缩期左心室内径（LVID）显著减小，在测量二尖瓣血流时可能会观察到流出道信号（图5B）。
利用专用软件，可在未受应力和受应力的心脏中对左心室心肌的应变和应变率进行斑点追踪评估（图7，图8），以测量心肌内在收缩特性中早期或亚临床的变化。进行计算时，必须准确定义心动周期中的各个收缩时相。应变反映的是物体相对于其原始形状和大小的形变程度4，相当于心肌纤维长度相对于其原始长度的变化6；应变率则代表心肌形变的速率。应变可在径向、圆周向和纵向三个方向上进行测量。例如，在胸骨旁短轴切面（PSSAX）测量径向应变，可描述心动周期中心肌壁厚度的增加情况，并反映其向左心室中心方向的形变19。心脏收缩同步性是评估左心室六个节段收缩功能的指标（图9E）20,21。在临床实践中，人类常用的全局纵向应变（GLS）已被广泛接受为评价左心室收缩功能的整体标志。
在小鼠应激超声心动图中，我们观察到左心室整体长轴应变（GLS，于 PSLAX 切面测量）向负值减小的方向增加，而整体圆周应变（GCS，于 PSSAX 切面测量）向负值增大的方向减小（图 9A、B）。多巴酚丁胺给药降低了整体达峰应变时间（图 9C），表现为所有六个节段的达峰应变时间均缩短（图 9D）。此外，它还导致所有节段的径向应变率均一性增加（图 9F）。
多巴酚丁胺给药的效果在不同物种间存在差异，这对转化医学研究具有重要意义。当达到（次）最大负荷时，小鼠的平均心率升高了+33%，而人类的平均心率升高了+144%（图10A）。在（次）最大负荷下，小鼠的多巴酚丁胺诱导射血分数（EF）平均升高+61%，人类的EF平均升高+14%（图10B）。
图3：在未应激和应激动物中获取的胸骨旁长轴（PSLAX）图像的代表性结果。（A）舒张期的PSLAX图像（未应激状态）。可见左心室前壁（LVAWd）、左心室后壁（LVPWd）、左心室腔及主动脉瓣（Ao）。（B）收缩期的PSLAX图像（未应激状态）。可见左心室前壁（LVAWs）、左心室后壁（LVPWs）、左心室腔及主动脉瓣（Ao）。（C）心室中段PSLAX的M型图像（未应激状态）。可见LVAWd、舒张期心室内径（LVIVDd）、LVPWd、LVAWs、LVIVDs、LVPWs。未应激图像的心率为425 bpm。（D）舒张期的PSLAX图像（应激状态）。可见LVAWd、LVPWd、左心室腔及主动脉瓣（Ao）。（E）收缩期的PSLAX图像（应激状态）。可见LVAWs、LVPWs、左心室腔及主动脉瓣（Ao）。（F）心室中段PSLAX的M型图像（应激状态）。可见LVAWd、LVIVDd、LVPWd、LVAWs、LVIVDs、LVPWs。应激图像的心率为545 bpm。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4：非应激与应激动物在胸骨旁短轴切面（PSSAX）获取图像的代表性结果。（A）舒张期（非应激状态）PSSAX图像。可见左心室前壁（LVAWd）、左心室后壁（LVPWd）、左心室内径（LVIDd；箭头）、左心室间隔壁（LVSWd）和左心室侧壁（LVLWd）。（B）收缩期（非应激状态）PSSAX图像。可见左心室前壁（LVAWs）、左心室后壁（LVPWs）、左心室内径（LVIDs；箭头）、左心室间隔壁（LVSWs）和左心室侧壁（LVLWs）。（C）非应激状态下心室中段PSSAX的M型图像。可见LVAWd、LVIVDd（箭头）、LVPWd、LVAWs、LVIVDs（箭头）和LVPWs。非应激图像的心率为400 bpm。（D）舒张期（应激状态）PSSAX图像。可见LVAWd、LVPWd、LVIDd（箭头）、LVSWd和LVLWd。（E）收缩期（应激状态）PSSAX图像。可见LVAWs、LVPWs、LVIDs（箭头）、LVSWs和LVLWs。（F）应激状态下心室中段PSLAX的M型图像。可见LVAWd、LVIVDs、LVPWd、LVAWs、LVIVDs和LVPWs。应激图像的心率为550 bpm。请点击此处查看该图的放大版本。
图5：在无应激和应激动物中通过心尖四腔心切面（4CH）获取图像的代表性结果：二尖瓣血流。 （A）二尖瓣流入道脉冲波多普勒（无应激状态）。E/A 比值可通过舒张早期（E）心室充盈和舒张期心房收缩（A）计算得出。等容舒张时间（IVRT）是舒张功能的指标，而等容收缩时间（IVCT）反映收缩期功能。为充分显示 IVRT 和 IVCT，在采集图像时应降低超声设备的壁滤波。无应激图像的心率：400 bpm。（B）二尖瓣流入道脉冲波多普勒（应激状态）。随着心率增加，E 波和 A 波的高度趋于接近，并进一步融合。在采集多巴酚丁胺负荷超声心动图时，由于应激引起左心室腔尺寸减小，可能会出现流出道信号（*）。应激图像的心率：560 bpm。 请点击此处查看该图的放大版本。
图 6：多巴酚丁胺负荷超声心动图中心脏功能参数的变化。（A）心率增加，单位为每分钟心跳次数（bpm）。（B）左心室射血分数升高。（C）等容舒张时间（IVRT）缩短。（D）等容收缩时间（IVCT）缩短。所有数据：n = 3，均值 ± 标准差，* = p < 0.05，采用学生t检验。请点击此处查看此图的放大版本。
图 7：非应激与应激动物在胸骨旁长轴切面（PSLAX）下获取图像的应变分析。 （A,B）利用应变分析软件，可计算包括整体纵向应变（GLS）在内的各项心脏功能参数。在健康动物中，心壁信号呈现均匀的红/蓝模式。请点击此处查看该图的放大版本。
图 8：非应激与应激动物在胸骨旁短轴切面（PSSAX）下获取图像的应变分析。 （A,B）利用应变分析软件，可计算包括整体周向应变（GCS）在内的各项心脏功能参数。在健康动物中，心壁信号呈均匀分布（红/蓝模式）。 请点击此处查看该图的放大版本。
图 9：非应激与应激状态下动物应变参数的变化。（A）整体纵向应变下降。（B）整体周向应变增加。（C）整体达峰时间缩短。（D）六个节段的应变达峰时间均缩短。（E）短轴切面解剖节段的示意图。（F）多巴酚丁胺给药后径向应变率升高。由于数值依赖于软件，且目前尚无小鼠的参考值，因此各实验设置需单独评估其数值。该图展示了图 7和图 8的结果。AFW = 前侧壁；LW = 侧壁；PW = 后壁；IFW = 下侧壁；PS = 后间隔；AS = 前间隔。请点击此处查看该图的放大版本。
图10：多巴酚丁胺诱导应激超声心动图中小鼠与人类心脏功能参数的差异。（A）心率的百分比增加。（B）左心室射血分数的百分比增加。数据来源于文献13,22以及临床常规检测。所有组：n = 3，均值 ± 标准差。请点击此处查看该图的放大版本。
讨论
在临床环境中，通常通过运动试验或药物负荷试验对人类进行应激状态下心脏功能的评估6,7。由于小鼠在运动后需进行镇静，导致其运动后即刻超声心动图检查受到极大限制，因此多巴酚丁胺诱导的负荷超声心动图可能是评估应激相关心脏生理病理变化最具转化价值的方法。在最终评估中，可通过实时压力-容积分析获得关于心脏功能的可靠信息23。超声心动图可提供长期观察的重要信息，因而也进一步符合3R原则（替代、减少、优化）的要求。
在患者中，应激超声心动图最常见的用途是检测室壁运动异常和心肌存活性，以及评估心脏瓣膜疾病，其重要性已在近期指南中指出24,25。然而，这些应用仅是心功能衰竭病理生理学拼图中的一部分。因此，我们认为，在临床前研究中采用药物应激试验将有助于揭示疾病模型和心脏表型分析中心脏功能的潜在且细微的变化。
麻醉与心率
除了少数情况下对小鼠进行清醒状态下的超声心动图检查26外，镇静状态下的超声心动图是目前在小鼠中最广泛使用的超声心动图方法3,4。尽管1.5 vol%以下的异氟烷即可实现充分镇静，但异氟烷——与人类不同——会导致小鼠心率下降。因此，在镇静程度与心率影响之间找到合适的平衡尤为关键，尤其是在进行应激试验时。不过，与其他麻醉剂相比，异氟烷引起的心肌抑制作用较轻27。小鼠的生理心率通常>450 bpm4，考虑到麻醉会引起心率轻度降低，我们将未受应激小鼠的目标心率设定为400–450 bpm，以便在注射多巴酚丁胺后能够观察到显著的心率升高。因此，必须密切监测心率，因为心率既是判断麻醉深度是否合适的首要控制指标，也是验证多巴酚丁胺是否成功诱导预设心率升高的关键依据。需要注意的是，在同组小鼠内以及不同组小鼠之间，应使用相同的心率范围进行比较。还应注意到，多巴酚丁胺的作用主要表现为增强心肌收缩力（正性肌力作用），而非显著加快心率（正性变时作用）。
多巴酚丁胺给药
在小鼠超声心动图检查中，多巴酚丁胺可通过静脉（i.v.）或腹腔（i.p.）途径给药，剂量范围为每克体重1–5 µg11,28,29,30。给药剂量至关重要，因为多巴酚丁胺的血浆浓度与心脏功能参数呈线性相关13。本文选择以每克体重5 µg的剂量进行腹腔注射，因其在所用的雄性C57BL6/6JRj小鼠中可引起显著、稳定、可重复且短暂的心脏功能参数升高，并达到（亚）最大负荷状态。由于该实验方案与临床患者不同，并不旨在探究实验小鼠群体中的个体间差异，因此要求每只受试小鼠均需达到相同的（亚）最大负荷水平，故每只动物应接受相同的给药剂量。在此需要强调的是，应根据小鼠品系及实验条件，在正式实验前预先开展剂量-效应测试，直至确定能够引起显著、稳定、可重复且短暂的心脏功能参数升高的适宜剂量。
腹腔注射是一种可行的给药途径，因为静脉注射在小鼠中操作更为困难。此外，假设多巴酚丁胺在小鼠腹膜中的吸收速率具有可比性，腹腔注射可避免尾静脉注射的技术障碍和操作误差，尤其是在纵向实验中进行多次重复检测时，尾静脉注射需对先前已穿刺的血管反复操作。然而，类似于人类临床操作，静脉给药途径也可被采用。9,27,31由于不同的药效学和药代动力学特性，可能需要预先进行额外的剂量-反应测试。由于主要为选择性β1-肾上腺素能药物中，多巴酚丁胺常被选用，因其在临床前研究中具有增强心肌收缩力和变时性作用，且对血压的直接作用较小9作为多巴酚丁胺的替代药物，可以使用异丙肾上腺素。异丙肾上腺素是一种非选择性β-肾上腺素能受体激动剂，对β₁和β₂受体均具有作用。1-和 β2-肾上腺素受体，与多巴酚丁胺不同，因其引起血管扩张，给药后导致平均动脉压降低。该处理可诱导心肌肥厚和纤维化，常用于模拟应激诱导的心脏损伤（急性给药）以及作为心力衰竭模型（慢性给药）。9,32因此，在计划进行纵向动物实验中的重复应激超声心动图检查时，其适用性略逊于多巴酚丁胺。然而，两种物质在健康小鼠中的正性肌力和负性肌松弛效应比较并未显示出显著差异。33总体而言，多巴酚丁胺在临床环境中更常用于应激试验，而异丙肾上腺素则多见于实验研究环境。27,33.
心脏功能评估
应激诱导的变化可通过B型模式进行视觉评估，而M型模式在时空分辨率方面具有优势，因此在应激成像中略占优势。在未经处理的健康小鼠或无室壁异常的小鼠（如化疗药物诱导的心脏毒性模型19）中，采用PSLAX或PSSAX切面获取的左心室中段M型图像可用于充分评估左心室收缩功能34。然而，当存在节段性室壁（运动）异常时（例如心肌梗死后35），采用B型模式图像进行平面测量法可能更适用于评估心肌收缩储备。
尽管已有大量研究，射血分数保留的舒张性心力衰竭仍是心力衰竭中尚未解决的一类疾病36。为了深入理解其潜在机制，对舒张性心力衰竭的小动物模型进行分析至关重要37。在舒张功能评估中，二尖瓣血流模式、等容舒张时间（IVRT）和等容收缩时间（IVCT）是已被广泛认可的指标4,38。在负荷试验中，这些指标会发生变化。由于目前尚缺乏小鼠负荷试验中的标准参考值，因此必须将这些变化与未经处理的对照组进行严密比较。我们的研究结果可作为参考值使用。尽管我们已通过负荷试验提高了检测心肌功能细微及早期变化的敏感性，但若采用斑点追踪成像技术，敏感性还可进一步提高，因为心肌应变能够提前检测到早期的亚临床改变39。如我们代表性结果所示，应变衍生的指标在负荷试验下可能发生改变，这在比较心肌梗死等心脏病模型时具有重要意义，尤其是在需要进行节段性分析的情况下。尽管已有努力推动小鼠超声心动图的标准化4，但目前仍缺乏参考值，因此这些效应需针对每一种独立的实验条件重新评估。在进行负荷试验下的应变分析时需格外注意，因为高心率以及显著变化的心功能参数的分析依赖于对收缩周期中各阶段准确识别后的计算结果。
观察者内与观察者间可靠性
作为一种依赖操作者的超声检查，超声心动图可能存在观察者内和观察者间的变异，尤其是在同一动物身上进行检查时3。目前已有公认的指南用于评估超声心动图测量结果的可重复性40。随着软件技术的发展，已开发出自动分析算法41。我们建议在可能的情况下，采用盲法进行图像采集，并采用盲法进行基于软件的离线图像分析。为确保可重复性，特别是在应激性超声心动图检查中，应分析具有相似心率升高程度的图像。
小鼠与人类之间：转化应用
尽管临床前超声应用具有诸多优势并不断发展，其转化应用的局限性仍值得探讨。
正如我们所展示的，多巴酚丁胺在小鼠和人类之间的效应存在差异。转化型临床前研究人员不应期望在人类患者中观察到的心脏功能参数的升高程度会与在小鼠中相同，反之亦然。然而，如果必须进行比较，我们建议仅比较（次）最大负荷时的对应点。在转化临床前超声心动图测量结果时，必须考虑到更显著的博维第效应15,16。
此外，由于超声窗口较小，注射多巴酚丁胺后心率和收缩力的变化，以及肺循环应激评估等指标42，尚无法在小鼠中直接进行。仍需进一步研究以评估小鼠中的应变分析。然而，多巴酚丁胺诱导的应激超声心动图在临床前研究领域是一种可行、可重复且有价值的工具，可用于揭示潜在的细微变化。
本方案的应用能够提供关于心脏收缩功能障碍和舒张功能障碍的生物学高度相关见解，除可用于不同小鼠品系的心脏表型分析外，还可扩展至慢性压力超负荷、心肌梗死、舒张功能障碍以及左心室射血分数保留的心力衰竭和瓣膜性心脏病等不同模型的研究。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢以下资助来源：德国研究基金会（UMEA 青年临床科学家项目，Stephan Settelmeier；RA 969/12-1，Tienush Rassaf；HE 6317/2-1，Ulrike Hendgen-Cotta），Else-Kroener-Fresenius 基金会（2014_A216，Tienush Rassaf）。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 活性炭过滤器 | UNO BV | 180000140 | http://www.unobv.com/Rest%20Gas%20Filters.html |
| Aquasonic 100 超声传导凝胶 | Parker Laboratories | 001-02 | https://www.parkerlabs.com/aquasonic-100.asp |
| 化学脱毛乳液 | General Supply | - | |
| 棉签 | General Supply | - | |
| ddH2O | General Supply | - | |
| 多巴酚丁胺 | Carinopharm | 71685.00.00 | https://www.carinopharm.de/stammsortiment/#103 |
| 实验动物麻醉用流量计 | UNO BV | SF3 | http://www.unobv.com/Flowmeters.html |
| 气体排气装置 | UNO BV | - | http://www.unobv.com/Gas%20Exhaust%20Unit.html |
| 加热灯 | Philips | - | |
| 诱导麻醉箱 | UNO BV | - | http://www.unobv.com/Induction%20box.html |
| 医用锐器盒 | BD | 305626 | https://legacy.bd.com/europe/safety/de/products/sharps/ |
| MX400 超声换能器（20–46 MHz） | VisualSonics | MX400 | https://www.visualsonics.com/product/transducers/mx-series-transducers |
| Octenisept 消毒剂 | Schuelke | 173711 | https://www.schuelke.com/de-de/produkte/octenisept.php |
| Omnican F 注射器（带针头，1 mL） | B. Braun | 9161502S | https://www.bbraun.de/de/products/b60/omnican-f.html |
| 纸巾 | General Supply | - | |
| Signacreme 电极导电膏 | Parker Laboratories | 017-05 | https://www.parkerlabs.com/Signacreme.asp |
| 标准纱布垫 | BeeSana Meditrade | 4852728 | https://www.meditrade.de/de/wundversorgung/verbandstoffe/beesana-mullkompresse/ |
| Thermasonic 凝胶加热器 | Parker Laboratories | 82-03-20 CE | https://www.parkerlabs.com/thermasonic_apta_sbp.asp |
| Transpore 胶带 | 3M | 1527NP-0 | https://www.3mdeutschland.de/3M/de_DE/unternehmen-de/produkte/~/3M-Transpore-Fixierpflaster/ |
| Vaporizer Sigma Delta 麻醉蒸发器 | UNO BV | - | http://www.unobv.com/Vaporizers.html |
| Vevo 3100 高频临床前超声成像系统 | VisualSonics | Vevo3100 | https://www.visualsonics.com/product/imaging-systems/vevo-3100 * 所需软件包：心血管软件包；B 模式、M 模式、脉冲波多普勒模式 |
| 集成导轨系统、加热平台及生理监测单元的 Vevo 成像工作站 | VisualSonics | - | https://www.visualsonics.com/product/accessories/imaging-stations |
| VevoLab 分析软件 | VisualSonics | 版本 3.2.5 | https://www.visualsonics.com/product/software/vevo-lab *所需软件包：Vevo Strain、左心室分析 |
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