面包酵母线粒体基因组编码八种多肽。本实验方案的目标是对所有这些多肽进行标记，随后将它们作为独立的条带进行可视化观察。
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摘要
摘要
线粒体是真核细胞中能够进行有氧呼吸的重要细胞器，含有环状基因组及基因表达系统。酿酒酵母的线粒体基因组编码八种蛋白质：细胞色素c氧化酶的三个亚基（Cox1p、Cox2p和Cox3p），ATP合酶的三个亚基（Atp6p、Atp8p和Atp9p），泛醌-细胞色素c氧化还原酶的一个亚基——细胞色素b（Cytb），以及线粒体核糖体蛋白Var1p。本文所述方法的目的是利用35S标记的甲硫氨酸特异性地标记这些蛋白质，通过电泳分离后在成像屏上以清晰条带的形式观察信号。该实验流程包含多个步骤：首先，将酵母细胞在含半乳糖的培养基中培养至对数生长后期；随后，使用环己酰亚胺处理以抑制细胞质中的蛋白质翻译，从而使35S甲硫氨酸仅掺入线粒体翻译产物中；接着，从酵母细胞中提取全部蛋白质，并通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离；最后，将凝胶干燥后与储存磷屏孵育，再使用磷屏成像仪扫描以显示条带。该方法可用于比较突变型酵母菌株与野生型菌株中单个多肽在线粒体内的生物合成速率，有助于研究线粒体基因表达缺陷。本方案可提供有关所有酵母线粒体mRNA翻译速率的重要信息，但需设置多个对照及附加实验，才能得出准确结论。
引言
线粒体是真核细胞代谢中起重要作用的细胞器。其电子传递链为细胞提供ATP，而ATP是多种生物化学途径中主要的能量载体。此外，线粒体还参与细胞凋亡、脂肪酸和血红素的合成以及其他多种过程。线粒体功能障碍是人类疾病的重要已知成因之一1。这种功能障碍可能源于编码线粒体结构或调控组分的核基因或线粒体基因发生突变2。酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae是研究线粒体基因表达的优良模式生物，原因如下：首先，其基因组已完全测序3，注释完善，且由于长期对该生物进行研究，文献中已积累了大量相关数据；其次，由于其生长速度快且同源重组效率高，对其核基因组的操作相对快速简便；第三，酿酒酵母S. cerevisiae是少数几种已建立线粒体基因组操作方法的生物之一；最后，酿酒酵母是一种兼性好氧-厌氧生物，能够在含有可发酵碳源的培养基中生长，因此可用于分离和研究呼吸缺陷型突变体。
我们描述了一种在翻译水平上研究酿酒酵母S. cerevisiae线粒体基因表达的方法4。该方法的主要原理基于以下几项观察结果。首先，酵母线粒体基因组仅编码八种蛋白质：细胞色素c氧化酶的三个亚基（Cox1p、Cox2p和Cox3p）、ATP合酶的三个亚基（Atp6p、Atp8p和Atp9p）、泛醌-细胞色素c氧化还原酶的一个亚基——细胞色素b（Cytb），以及线粒体核糖体蛋白Var1p5。这些蛋白质数量较少，在适当条件下可通过电泳在一块凝胶上实现完全分离。其次，线粒体核糖体属于原核类而非真核类6，因此酵母细胞质核糖体与线粒体核糖体对抗生素的敏感性不同。这一特性使得我们可以使用环己酰亚胺特异性抑制细胞质中的翻译过程，从而确保标记氨基酸（35S-甲硫氨酸）仅掺入线粒体翻译产物中。因此，该实验可提供有关新合成的线粒体蛋白中氨基酸掺入速率的信息，反映这八种蛋白质各自线粒体翻译的整体效率。
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方案
1. 酵母培养物的制备
- 从冻存的酵母菌种中取菌，在含有适当培养基的新鲜平板上划线接种。将平板置于30 °C培养箱中培养24–48小时。
注意：温度敏感型突变株应在允许温度下培养。 - 从新鲜划线平板上挑取酵母菌落，接种于含有2 mL YPGal培养基（2% 蛋白胨，1% 酵母提取物，2% 半乳糖）的15 mL试管中，于30 °C、200 rpm振荡条件下过夜培养。
- 测定菌液在600 nm波长处的光密度（OD600）。
- 取相当于0.2吸收单位的菌液体积，转移至无菌离心管中，在室温下以9,000 × g 离心30秒，收集菌体并弃去上清液。
- 加入0.5 mL无菌水重悬菌体，涡旋振荡5秒进行洗涤。在室温下以9,000 × g 离心30秒，弃去上清液，将菌体重悬于2 mL新鲜YPGal培养基中。
- 在30 °C、200 rpm振荡条件下继续培养，直至OD600达到1.5–1.9。
注意：酵母生长速率存在差异，需做好等待准备。建议在清晨尽早进行步骤1.3–1.6。通常需要4–5小时，但也可能更长时间。
2. 放射性同位素掺入
- 将相当于一个光密度单位的培养物体积转移至微量离心管中。在3,000 × g 条件下离心1分钟，弃去上清液。加入0.5 mL无菌水，涡旋振荡5秒进行洗涤。
- 在室温下以9,000 × g 离心30秒，沉淀酵母细胞，并弃去上清液。将酵母细胞重悬于0.5 mL无菌翻译缓冲液中，将悬液转移至15 mL离心管中。
注意：翻译缓冲液为含有2%半乳糖（w/v）和50 mM磷酸钾（pH 6.0）的溶液。
- 在室温下以9,000 × g 离心30秒，沉淀酵母细胞，并弃去上清液。将酵母细胞重悬于0.5 mL无菌翻译缓冲液中，将悬液转移至15 mL离心管中。
- 向细胞悬液中加入环己酰亚胺，使其终浓度达到0.2 mg/mL。在200 rpm振荡条件下于30 °C孵育5分钟，以抑制胞质翻译。
注意：环己酰亚胺溶液（20 mg/mL，溶于乙醇）应在实验前新鲜配制。氯霉素可成功地以相同浓度的放线菌酮替代7。 - 向细胞悬液中加入25–30 μCi的35S-甲硫氨酸，在200 rpm振荡条件下于30 °C孵育30分钟。
注意：也可使用35S-甲硫氨酸与35S-半胱氨酸的混合物。纯35S-甲硫氨酸可产生最强信号及最佳信噪比。通常甲硫氨酸比半胱氨酸更有效，因为线粒体蛋白中甲硫氨酸含量更高。然而，EasyTag品牌的35S-甲硫氨酸与半胱氨酸混合物成本较低，且结果相当7。
警告：35S-甲硫氨酸具有放射性。操作放射性物质时应遵循常规安全规范。
注意：已知放射性标记的掺入量会达到一个极限，导致总信号随时间趋于平稳。一旦达到该极限，几乎无法确定不同翻译产物的合成速率。为了分析线粒体翻译速率，必须确保信号强度随35S-甲硫氨酸孵育时间呈线性增长。对于常见的实验室野生型菌株，信号在远短于30分钟的孵育时间内即已饱和。翻译突变体的行为可能差异显著。因此，至少在使用新菌株时，应进行时间进程实验以确定放射性掺入动力学，从而评估翻译速率。建议取样时间点间隔数分钟（例如2.5、5.0、7.5、10和20分钟）。 - 加入未标记的"冷"甲硫氨酸（终浓度应为20 mM）和嘌呤霉素（终浓度应为1–10 μg/mL）以终止标记。在200 rpm振荡条件下于30 °C继续孵育10分钟。
注意：此步骤至关重要，可为核糖体提供完成肽链翻译所需的时间。否则，所有短于全长的多肽将在不同分子量处被检测到。在此步骤可进行脉冲-追踪时间进程实验（pulse-chase），以测定线粒体翻译产物的稳定性。为此，可继续孵育并每隔30分钟取样（例如30、60、90和120分钟）。
3. 酵母细胞裂解及蛋白质提取
- 通过在 9,000 × g 条件下离心 30 秒收集酵母细胞。加入 0.5 mL 无菌水，涡旋振荡 5 秒以洗涤细胞。在室温下以 9,000 × g 离心 30 秒，收集酵母细胞沉淀。弃去上清液。
注意：此步骤可暂停。将样品储存于 -20 °C。 - 向沉淀中加入 75 μL 裂解缓冲液，涡旋振荡 5–10 秒。
注意：裂解缓冲液为含有 1.8 M NaOH、1 M β-巯基乙醇和 1 mM PMSF 的水溶液。避免与裂解缓冲液孵育过久，以防蛋白质发生碱性水解。立即进行步骤 3.3。 - 加入 500 μL pH 6.8 的 0.5 M Tris-HCl 缓冲液，短暂涡旋振荡。
4. 蛋白质沉淀
警告：甲醇和氯仿为有机溶剂。操作有机物质时应遵循常规安全规范。
- 向样品中加入 600 µL 甲醇。涡旋振荡 5 秒。
- 向样品中加入 150 µL 氯仿。涡旋振荡 5 秒。
- 在 12,000 x g 条件下离心样品 2 分钟。用移液器小心弃去上层液相。
- 向样品中加入 600 µL 甲醇。通过反复倒置试管充分混匀。
- 在 12,000 x g 条件下离心样品 2 分钟。弃去上清液。
- 在 80 °C 下空气干燥沉淀 2 分钟。
注意：所有液体应完全蒸发。如果沉淀干燥不充分，可能导致蛋白质在凝胶中发生异常分离。然而，沉淀不会过度干燥，因此即使在 4 °C 下储存过夜也是可行的。 - 将沉淀的蛋白质溶解于 60 µL 1x Laemmli 上样缓冲液中。
- 在 40 °C 下加热 10 分钟。
注意：避免在 95 °C 下煮沸样品，因为这会导致蛋白聚集。如果仍出现聚集物，可在 12,000 x g 条件下离心 2 分钟，并收集上清液。样品可保存于 -20 °C。此步骤可作为暂停点。
5. SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
- 制备17.5% Laemmli SDS-聚丙烯酰胺凝胶。
注意：可在凝胶中加入6 M尿素，以更好分离atp8和atp9。使用15%–20%梯度凝胶也可获得更佳分辨率。 - 在每个加样孔中加入 15 μL（40–50 µg）样品。
注意：如果 OD600 若步骤1.6中的数值接近。否则，使用含去垢剂兼容性试剂的检测方法测定蛋白质浓度。 - 在冷室中电泳，直至蓝色染料迁移至凝胶长度的约65%处。
注意：对于所使用的系统（例如 Protean II xi 细胞），可采用以下两种模式之一：5 V/cm 恒压电泳 16–17 小时，或 15 V/cm 恒压电泳 5 小时。蛋白质的迁移速度不会超过溴酚蓝染料，但长时间电泳可能导致 atp8 和 atp9 信号模糊。 - 用考马斯亮蓝染色凝胶，并进行扫描或拍照，作为上样对照。
注意：制备上样对照的另一种方法是使用针对线粒体“看家”基因（如 porin 1）的抗体进行免疫印迹。
6. 自显影技术
- 将凝胶在凝胶干燥仪中干燥。将干燥后的凝胶置于暗盒中，并与存储磷屏一起存放3–5天。
注意：除直接检测干燥凝胶外，另一种方法是通过电转印将蛋白质转移至硝酸纤维素膜，随后进行检测。该方法可产生更强的信号和更清晰的条带。 - 使用磷屏成像仪扫描磷屏。
注意：除磷屏成像外，也可使用X射线胶片来显示信号。
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结果
根据上述方案，我们对两种酿酒酵母（S. cerevisiae）菌株的线粒体翻译产物进行了鉴定：野生型（WT）和AIM23基因缺失突变体（AIM23Δ），后者编码线粒体翻译起始因子3（表1）8。线粒体翻译产物通过放射性标记，并在SDS-PAAG中分离。在信号饱和前每2.5分钟收集一次样品，以构建时间进程（图1A）。凝胶经染色、干燥后，进行5天曝光检测（图1A）。
若实验成功，图中应显示八条与标准模式相对应的条带4。然而，各条带的强度可能因菌株和实验条件的不同而存在显著差异。每一条带对应一种翻译产物。数据（图1A）表明，AIM23Δ 菌株具备线粒体蛋白质合成能力，因为在野生型（WT）中出现的所...
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讨论
基因表达研究在现代生命科学中占据核心地位。人们已开发出多种方法以深入了解这一复杂过程。本文描述了一种用于检测酿酒酵母S. cerevisiae线粒体中蛋白质生物合成的方法。该方法通常用于比较突变型酵母菌株与野生型菌株线粒体中mRNA的翻译效率，从而评估所研究突变的影响。当研究人员研究可能影响线粒体功能的突变酵母细胞时，这是他们常进行的一项基础实验8,11,12,13。该实验常与氧气消耗速率和线粒体膜电位的测定相结合。然而，该方法所提供的信息尚不足以区分基因表达的哪个阶段受到了影响，因此需要一系列附加实验来进一步确定。首先，需通过Northern印迹或RT-qPCR检测线粒体mRNA，以评估转录水平的变化。其次，应使用特异性抗体对总蛋白提取物进行Western印迹分析，以评估蛋白质表达水平。第三，应先用标记的35S-甲硫氨酸（“热”脉冲）进行脉冲...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由俄罗斯基础研究基金会资助，项目编号 18-29-07002。P.K. 得到俄罗斯联邦科学与高等教育部国家任务的支持，项目编号 AAAA-A16-116021660073-5。M.V.P. 得到俄罗斯联邦科学与高等教育部的支持，项目编号 075-15-2019-1659（库尔恰托夫基因组研究中心项目）。部分工作使用了根据莫斯科国立大学发展计划购置的设备完成。I.C.、S.L. 和 M.V.B. 还得到了莫斯科国立大学“诺亚方舟”领先科学学派项目的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 2-巯基乙醇 | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| 丙烯酰胺 | Sigma-Aldrich | A9099 | |
| 过硫酸铵 | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| 细菌用琼脂 | Sigma-Aldrich | A5306 | |
| Biowave 细胞密度计 CO8000 | BIOCHROM US BE | 80-3000-45 | |
| BRAND 标准一次性比色皿 | Sigma-Aldrich | Z330361 | |
| 氯仿 | Sigma-Aldrich | 288306 | |
| 放线菌酮 | Sigma-Aldrich | C1988 | |
| D-(+)-半乳糖 | Sigma-Aldrich | G5388 | |
| D-(+)-葡萄糖 | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| 数字式恒温金属浴 | Thermo Scientific | 88870001 | |
| EasyTag L-[35S]-甲硫氨酸，500µCi (18.5MBq)，稳定水溶液 | Perkin Elmer | NEG709A500UC | |
| Eppendorf 离心机 5425 | Thermo Scientific | 13-864-457 | |
| GE 储存式磷屏 | Sigma-Aldrich | GE29-0171-33 | |
| L-甲硫氨酸 | Sigma-Aldrich | M9625 | |
| 甲醇 | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| N,N,N′,N′-四甲基乙二胺 | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| N,N′-亚甲基双丙烯酰胺 | Sigma-Aldrich | M7279 | |
| New Brunswick Innova 44/44R 摇床培养箱 | New Brunswick Scientific | ||
| 肉源性蛋白胨，细菌用 | Millipore | 91249 | |
| 苯甲基磺酰氟 | Sigma-Aldrich | P7626 | |
| Pierce 660 nm 蛋白检测试剂盒 | Thermo Scientific | 22662 | |
| PowerPac Basic 电源供应器 | Bio-Rad | 1645050 | |
| Protean II xi 电泳槽 | Bio-Rad | 1651802 | |
| 来自白色链霉菌的盐酸嘌呤霉素 | Sigma-Aldrich | P8833 | |
| 氢氧化钠 | Sigma-Aldrich | 221465 | |
| Storm 865 磷光成像仪 | GE Healthcare | ||
| Trizma 基础缓冲液 | Sigma-Aldrich | 93352 | |
| 真空加热凝胶干燥器 | Cleaver Scientific | CSL-GDVH | |
| 酵母提取物 | Sigma-Aldrich | Y1625 |
参考文献
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