贝克酵母糖精中线粒体基因组表达产品的标记和可视化

Summary

贝克的酵母线粒体基因组编码了八种多肽。当前协议的目标是将所有这些都标记为单独的频段，然后将其可视化为单独的频段。

Abstract

线粒体是能够有氧呼吸的真核细胞的基本细胞。它们含有圆形基因组和基因表达装置。面包师酵母的线粒体基因组编码八种蛋白质:细胞色素c氧化酶的三个亚单位（Cox1p， 考克斯2p和考克斯3p），ATP合成酶（Atp6p、Atp8p和Atp9p）的三个子单位，是紫基酚-细胞色素c氧化酶、细胞色素b（细胞色素b）和线粒体核糖体蛋白Var1p的子单位。这里描述的方法的目的是用 ³⁵S甲氨酸专门标记这些蛋白质，通过电磷分离它们，并将信号可视化为屏幕上的离散带。该过程涉及几个步骤。首先，酵母细胞在含角质的介质中培养，直到它们到达晚期对数生长阶段。其次，环素酰胺治疗阻断细胞质转化，仅允许 ³⁵S甲基氨酸在线粒体翻译产品中结合。然后，所有蛋白质都从酵母细胞中提取，并通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。最后，凝胶干燥并与存储磷屏幕一起孵育。屏幕扫描在荧光仪上，显示带子。该方法可用于比较突变酵母菌株线粒体中单个多肽的生物合成率与野生菌型，这有助于研究线粒体基因表达缺陷。此协议提供了有关所有酵母线粒体 mRNA 翻译速率的宝贵信息。然而，它需要几个控制和额外的实验，以作出适当的结论。

Introduction

线粒体是深陷真核细胞代谢的细胞器。他们的电子传输链为细胞提供ATP，ATP是用于多种生化途径的主要能量货币。此外，他们参与凋亡，脂肪酸和血红素合成，和其他过程。线粒体功能障碍是人类疾病的著名来源^。它可以是由于核基因或线粒体基因的突变，编码细胞器²的结构或调节成分。贝克的酵母 糖精 是研究线粒体基因表达的一个很好的模型有机体，原因有几个。首先，他们的基因组被完全测序^3，有很好的注释，由于与这种生物体进行的长期调查历史，大量的数据已经在文献中可用。其次，由于其快速的生长速度和高效的同源重组系统，其核基因组的处理相对快速和容易。第三，面包师的酵母 S.脑膜 是少数利用线粒体基因组进行操作的生物之一。最后，面包师的酵母是一种气样-厌食性有机体，它允许分离和研究呼吸缺陷突变体，因为它们可以在含有可发酵碳源的介质中生长。

我们描述了研究面包师酵母 S.cerevisiae 的线粒体基因表达的方法在转化水平^4。它的主要原则来自几个观察。首先，酵母线粒体基因组只编码八种蛋白质:细胞色素c氧化酶的三个亚单位（Cox1p， 考克斯2p和Cox3p），ATP合成酶（Atp6p、Atp8p和Atp9p）的三个子单位，ubiquinol-细胞色素c氧化酶、细胞....

Protocol

1. 酵母文化准备

1. 用适当的介质在新鲜盘子上冷冻库存培养物上的条纹酵母。将盘子放入30°C的文化孵化器中，24-48小时。
   注意:让对温度敏感的突变体在允许的温度下生长。
2. 接种酵母培养物在2 mL的YPGal介质（2%的肽，1%酵母提取物，2%的辣椒素）从新鲜条纹在15 mL管，并孵育他们过夜搅拌在200 rpm在30°C。
3. 以 600 nm （OD 600） 的波长测量培养的光学密度。
4. 以无菌管中对应0.2吸收单元的体积为例，在室温下以9，000 x g的 颗粒酵母细胞，在室温下丢弃超纳坦。
5. 用0.5 mL的无菌水清洗细胞，通过漩涡5s。颗粒酵母细胞在室温下在9，000 x g 30s，并丢弃超纳坦。稀释细胞在2 mL的新鲜YPGal介质。
6. 在 OD 600 达到 1.5-1.9 值之前，在 200 rpm 和₃₀ °C 下孵化搅拌。
   注意:酵母的增长率各不相同，所以请准备好等待。在清晨采取1.3-1.6步骤是合理的。它通常需要4-5小时，但可能需要更长的时间。

2. 放射性同位素结合

1. 传输相当于微中心管中的一个光学单元的培养量。以 3，000 x g 旋转 管子 1 分钟，然后丢弃超纳坦。用 0.5 mL 的无菌水....

Results

按照上述协议，我们从两个 S. Cerevisiae 菌株中分配线粒体翻译产品:野生类型（WT）和 AIM23 基因的突变轴承删除（AIM23Δ），编码线粒体翻译启动因子 3 （表 1）^8.线粒体翻译产品在SDS-PAAG9中被放射性标记和分离。样本在饱和前每2.5分钟收集一次，以建立一个时间过程（图1A）。凝胶在为期5天的展览（图1A）后被染色、干燥和筛选。

在实验成功的情况下，图片展示了根据标准模式⁴分配的8个波段。然而，根据应变和实验条件，单个频段的强度可能变化很大。每个波段对应一个翻译产品。数据（图1A）表明 ，AIM23Δ 菌株能够线粒体蛋白合成，因为WT中出现的所有产品都可见于.......

Discussion

基因表达研究在现代生命科学中占有核心地位。已开发出许多方法，为这一复杂的过程提供见解。在这里，我们描述了允许在面包师酵母S.脑线粒体中获取蛋白质生物合成的方法。它通常用于比较突变酵母菌株线粒体中的mRNA的翻译效率与野生类型，以获得研究突变的后果。这是研究人员在研究带有突变的酵母细胞线粒体功能时进行的基本实验之一，该细胞被建议影响线粒体^{8、11、12、13。}它通常与氧气消耗率和线粒体膜潜力的测量相结合。然而，它提供的信息不足以区分基因表达的哪个阶段受到影响。需要一组额外的实验来找出它。首先，对线粒体 mRNA 的北部污点或 RT-qPCR 评估对于评估转录步骤是必要的。其次，应使用具有特定抗体的蛋白质提取物的西层污点来评估蛋白质水平。第三，应继续添加未标记的（冷）甲基氨酸（追逐），并在凝胶上收集和分析几个时间点，以研究蛋白质的稳定性。

.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-巯基乙醇	Sigma-Aldrich	M3148
丙烯酰胺	Sigma-Aldrich	A9099
过硫酸铵	Sigma-Aldrich	A3678
细菌琼脂	Sigma-Aldrich	A5306
Biowave 细胞密度计 CO8000	BIOCHROM US BE	80-3000-45
BRAND 标准一次性比色皿	Sigma-Aldrich	Z330361
氯仿	Sigma-Aldrich	288306
放线菌酮	Sigma-Aldrich	C1988
D-（+）-半乳糖	Sigma-Aldrich	G5388
D-（+）-葡萄糖-	Aldrich	G7021
数字模块加热器	Thermo Scientific	88870001
EasyTag L-[35S]-蛋氨酸，500µCi （18.5MBq），稳定水溶液	Perkin Elmer	NEG709A500UC
Eppendorf 离心机 5425	Thermo Scientific	13-864-457
GE 存储荧光粉筛选	Sigma-Aldrich	GE29-0171-33
L-蛋氨酸	Sigma-Aldrich	M9625
甲醇	Sigma-Aldrich	34860
N，N，N′，N′-四甲基乙二胺	Sigma-Aldrich	T9281
N，N′-亚甲基双丙烯酰胺	Sigma-Aldrich	M7279
新不伦瑞克省 Innova 44/44R 摇床培养箱	新不伦瑞克省 Scientific
蛋白胨来自肉类，细菌学	Millipore	91249
苯基甲磺酰氟	Sigma-Aldrich	P7626
Pierce 660nm 蛋白质检测试剂盒	Thermo Scientific	22662
PowerPac 基本电源	Bio-Rad	1645050
Protean II 习细胞	Bio-Rad	1651802
来自白链霉菌的盐酸嘌	Sigma-Aldrich	P8833
氢氧化钠	Sigma-Aldrich	221465
Storm 865 荧光粉成像仪	GE Healthcare
Trizma 底座	Sigma-Aldrich	93352
真空加热凝胶干燥机	Cleaver Scientific	CSL-GDVH
酵母提取物	Sigma-Aldrich	Y1625