贝克酵母糖精中线粒体基因组表达产品的标记和可视化

线粒体是深陷真核细胞代谢的细胞器。他们的电子传输链为细胞提供ATP，ATP是用于多种生化途径的主要能量货币。此外，他们参与凋亡，脂肪酸和血红素合成，和其他过程。线粒体功能障碍是人类疾病的著名来源^。它可以是由于核基因或线粒体基因的突变，编码细胞器²的结构或调节成分。贝克的酵母 糖精 是研究线粒体基因表达的一个很好的模型有机体，原因有几个。首先，他们的基因组被完全测序^3，有很好的注释，由于与这种生物体进行的长期调查历史，大量的数据已经在文献中可用。其次，由于其快速的生长速度和高效的同源重组系统，其核基因组的处理相对快速和容易。第三，面包师的酵母 S.脑膜 是少数利用线粒体基因组进行操作的生物之一。最后，面包师的酵母是一种气样-厌食性有机体，它允许分离和研究呼吸缺陷突变体，因为它们可以在含有可发酵碳源的介质中生长。

我们描述了研究面包师酵母 S.cerevisiae 的线粒体基因表达的方法在转化水平^4。它的主要原则来自几个观察。首先，酵母线粒体基因组只编码八种蛋白质:细胞色素c氧化酶的三个亚单位（Cox1p， 考克斯2p和Cox3p），ATP合成酶（Atp6p、Atp8p和Atp9p）的三个子单位，ubiquinol-细胞色素c氧化酶、细胞色素b（细胞）和线粒体核糖体蛋白Var1p⁵的子单位。这个数字很小，在适当条件下，所有凝胶上的电光可以分离。其次，线粒体核糖体属于原核糖体类，而不是真核生物^6，因此，酵母细胞质和线粒体核糖体对抗生素的敏感性不同。它允许用环氧化物抑制细胞质转化，为标记的氨基酸^（35S-甲基氨酸）仅在线粒体转化产品中结合提供条件。因此，该实验提供了有关线粒体蛋白中氨基酸的吸收率的信息，反映了八种产品中线粒体转化的整体效率。

1. 酵母文化准备

1. 用适当的介质在新鲜盘子上冷冻库存培养物上的条纹酵母。将盘子放入30°C的文化孵化器中，24-48小时。
   注意:让对温度敏感的突变体在允许的温度下生长。
2. 接种酵母培养物在2 mL的YPGal介质（2%的肽，1%酵母提取物，2%的辣椒素）从新鲜条纹在15 mL管，并孵育他们过夜搅拌在200 rpm在30°C。
3. 以 600 nm （OD 600） 的波长测量培养的光学密度。
4. 以无菌管中对应0.2吸收单元的体积为例，在室温下以9，000 x g的 颗粒酵母细胞，在室温下丢弃超纳坦。
5. 用0.5 mL的无菌水清洗细胞，通过漩涡5s。颗粒酵母细胞在室温下在9，000 x g 30s，并丢弃超纳坦。稀释细胞在2 mL的新鲜YPGal介质。
6. 在 OD 600 达到 1.5-1.9 值之前，在 200 rpm 和₃₀ °C 下孵化搅拌。
   注意:酵母的增长率各不相同，所以请准备好等待。在清晨采取1.3-1.6步骤是合理的。它通常需要4-5小时，但可能需要更长的时间。

2. 放射性同位素结合

1. 传输相当于微中心管中的一个光学单元的培养量。以 3，000 x g 旋转 管子 1 分钟，然后丢弃超纳坦。用 0.5 mL 的无菌水洗净， 漩涡 5 s 。
   1. 颗粒酵母细胞在室温下在9，000 x g 30s，并丢弃超纳坦。在0.5 mL的无菌翻译缓冲中重新悬念酵母细胞。将悬架放置在 15 mL 管中。
      注:翻译缓冲区是一种含有2%辣椒酸（w/v）和50 mM磷酸钾的溶液，pH 6.0。
2. 将环氧化物添加到细胞悬浮物中，最终浓度为 0.2 毫克/mL。在 200 rpm 和 30 °C 下孵化 5 分钟搅拌，以抑制细胞自体翻译。
   注:环氧化物溶液（乙醇中20毫克/mL）应在实验前新鲜制备。氯霉素可以成功地用同浓度⁷的异霉素替代。
3. 在细胞悬浮液中加入35 S-甲氨酸的 ^25-30微分，在200转/分和30°C下孵育30分钟搅拌。
   注^:35S-甲基氨酸和³⁵S-半胱氨酸的混合物也可用于。纯³⁵S-甲氨酸导致最强的信号和最好的信号噪声比。一般来说，甲基氨酸比西斯泰因更有效，因为线粒体蛋白中这种氨基酸的含量更高。然而^，35S-甲基氨酸和半胱氨酸的EasyTag混合物更便宜，并给出可比的结果^7。
   警告 ^:35S-甲氨酸是放射性的。遵循处理放射性物质的通常安全做法。
   注:众所周知，放射性的结合达到了一个极限，因此总信号会随着时间而趋于平止。一旦达到此限制，几乎不可能确定合成不同翻译产品的速率。要分析线粒体转换速率，必须处于信号强度随 ³⁵S-甲氨酸的潜伏时间而增加的条件下。对于常见的实验室野生型菌株，信号已经饱和，潜伏时间远短于30分钟。转化突变体的行为可能非常不同。应执行时间过程，以确定放射性结合的动能，从而确定翻译速率，至少在处理新菌株时是这样。为此，我们建议每隔几分钟采集样本（例如，2.5、5.0、7、5、10 和 20 分钟）。
4. 添加未标记的"冷"甲基氨酸（最终浓度应为20mM）和紫杉醇（最终浓度应为1-10μg/mL）以阻止标签。在 200 rpm 和 30 °C 下孵化 10 分钟搅拌。
   注意:这一步骤对于给核糖体时间完成多肽的翻译至关重要。否则，所有短于全长的多肽都将以不同的尺寸被检测到。在此步骤中可以进行时间过程实验（脉冲追逐），以确定线粒体翻译产品的稳定性。为此，继续以30分钟（例如，30、60、90和120分钟）的间隔采集样品。

3. 酵母细胞裂解和蛋白质提取

1. 以9，000 x g 的离心收集酵母细胞，30s。用0.5 mL的无菌水清洗细胞，旋涡5s。在室温下，30s 的颗粒酵母细胞在 9，000 x g。 丢弃超纳坦。
   注意。协议可在此处暂停。将样品存放在-20°C。
2. 将 75μL 的裂解缓冲器添加到颗粒和漩涡中，达到 5-10 s。
   注:裂解缓冲液是1.8 M NaOH、1M β甲醇和1米PMSF在水中的溶液。避免过度孵化与裂解缓冲，导致碱性水解的蛋白质。立即进入步骤 3.3。
3. 添加 500μL 的 0.5 M 特里斯-HCl 缓冲区，带 pH 6.8。漩涡短暂。

4. 蛋白质沉淀

注意:甲醇和氯仿是有机溶剂。遵循处理有机物质的通常安全做法。

1. 在样品中加入600μL的甲醇。漩涡为5s。
2. 向样品中添加 150μL 的氯仿。漩涡为5s。
3. 在12，000 x g时将样品离心2分钟。使用取样器小心地丢弃上部。
4. 在样品中加入600μL的甲醇。通过多次倒置管子仔细混合。
5. 在12，000 x g时将样品离心2分钟。丢弃超纳坦。
6. 在 80 °C 下将颗粒空气干燥 2 分钟。
   注意:所有的液体都应该蒸发。如果颗粒干燥不足，凝胶中蛋白质有异常分离的风险。但是，不可能将颗粒过度干燥，因此它甚至可以在 4 °C 下存放过夜。
7. 溶解沉淀蛋白在60μL的1x莱姆利样品缓冲区。
8. 在40°C下加热10分钟。
   注意:避免在95°C下煮沸样品，因为这会导致聚合。如果聚合仍然形成，在 12，000 x g 下旋转样品 2 分钟，并收集超纳坦。样品可储存在-20°C。 协议可在此处暂停。

5. SDS页

1. 铸造17.5%莱姆利SDS-聚丙烯酰胺凝胶。
   注:6 M尿素可以添加到凝胶中，以解决更好的atp8和atp9。梯度 15%-20% 凝胶也可以给出更好的分辨率。
2. 在口袋中加载每个样品的 15 μL （40-50μg）。
   注:如果OD_{600值在第1.6} 步接近，则无需测量蛋白质浓度。如果没有，使用与洗涤剂兼容的试剂进行检测来测量蛋白质浓度。
3. 在寒冷的房间里运行凝胶，直到蓝色染料达到凝胶长度的大约 65%。
   注:对于所使用的系统（例如 Protean II xi 单元），我们使用两种模式中的任何一种:5 V/cm 时的 16-17 小时或 15 V/cm 的 5 小时。没有蛋白质比溴酚蓝色染料跑得快，但长跑会导致 atp8 和 atp9 信号模糊。
4. 用库马西明亮的蓝色染色凝胶，并做扫描或照片，这是作为加载控制所必需的。
   注:进行装载控制的另一种方法是用抗体对线粒体"保管"基因进行免疫，例如，孔1。

6. 自传

1. 将凝胶干燥机干燥。将其保存在带存储磷屏幕的盒式磁带中 3-5 天。
   注:筛选干凝胶的替代方案是通过电污迹将蛋白质转移到硝基纤维素膜，然后进行筛选。它产生更强的信号和更清晰的波段。
2. 扫描荧光片上的屏幕。
   注:作为磷成像的替代品，X射线膜也可用于显示信号。

按照上述协议，我们从两个 S. Cerevisiae 菌株中分配线粒体翻译产品:野生类型（WT）和 AIM23 基因的突变轴承删除（AIM23Δ），编码线粒体翻译启动因子 3 （表 1）8.线粒体翻译产品在SDS-PAAG9中被放射性标记和分离。样本在饱和前每2.5分钟收集一次，以建立一个时间过程（图1A）。凝胶在为期5天的展览（图1A）后被染色、干燥和筛选。

在实验成功的情况下，图片展示了根据标准模式4分配的8个波段。然而，根据应变和实验条件，单个频段的强度可能变化很大。每个波段对应一个翻译产品。数据（图1A）表明 ，AIM23Δ 菌株能够线粒体蛋白合成，因为WT中出现的所有产品都可见于这种突变体中。然而，波段的强度与WT不同，这意味着 AIM23 的删除会影响线粒体基因表达8。库马西辉煌的蓝色染色作为负载控制。

由此产生的数据可以量化 （图1B），使用 ImageJ10 或 ImageQuant 软件识别菌株或实验条件之间的差异。为此，计算了与每个产品对应的信号与总信号的比率。平均值和标准偏差至少在三个独立实验中计算。

合成蛋白周转的动能在脉冲追逐实验（图1C）中研究。样品在标签反应被冷甲基氨酸和紫杉酸在第2.4步停止后，在指示的时间点收集。这种控制对于估计产品的稳定性是必要的，因为信号的强度是两个相反过程的结果:新链的合成和蛋白质降解。用抗孔1抗体免疫是一种加载控制。

图1:酵母线粒体翻译产品的代表性放射性标签。（A） 在WT和AIM23Δ菌株的活酵母细胞中加入线粒体合成蛋白的35个S-甲基氨酸的时间过程。库马西辉煌的蓝色染色是一个负载控制。（B） 线粒体编码蛋白水平，5分钟后用35S-甲基氨酸标记。相对表达与线粒体编码蛋白质基因的总表达正常化。错误条表示至少三个独立实验的平均值的标准偏差。（C） 野生类型线粒体合成蛋白的周转量和Aim23Δ菌株。标签被停止，样品在指示的时间点收集。用抗孔素1抗体免疫是一种加载控制。（D） 对旧的35S-甲基氨酸、放射性成像术进行次优实验。图1A，B，C改编自8，稍作修改。请点击这里查看此数字的较大版本。

表 1. S. 塞雷维西亚 菌株的基因型

作者没有什么可透露的。