酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）线粒体基因组表达产物的标记与可视化

摘要

面包酵母线粒体基因组编码八种多肽。本实验方案的目标是对所有这些多肽进行标记，随后将它们作为独立的条带进行可视化观察。

摘要

线粒体是真核细胞中能够进行有氧呼吸的重要细胞器，含有环状基因组及基因表达系统。酿酒酵母的线粒体基因组编码八种蛋白质：细胞色素c氧化酶的三个亚基（Cox1p、Cox2p和Cox3p），ATP合酶的三个亚基（Atp6p、Atp8p和Atp9p），泛醌-细胞色素c氧化还原酶的一个亚基——细胞色素b（Cytb），以及线粒体核糖体蛋白Var1p。本文所述方法的目的是利用³⁵S标记的甲硫氨酸特异性地标记这些蛋白质，通过电泳分离后在成像屏上以清晰条带的形式观察信号。该实验流程包含多个步骤：首先，将酵母细胞在含半乳糖的培养基中培养至对数生长后期；随后，使用环己酰亚胺处理以抑制细胞质中的蛋白质翻译，从而使³⁵S甲硫氨酸仅掺入线粒体翻译产物中；接着，从酵母细胞中提取全部蛋白质，并通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离；最后，将凝胶干燥后与储存磷屏孵育，再使用磷屏成像仪扫描以显示条带。该方法可用于比较突变型酵母菌株与野生型菌株中单个多肽在线粒体内的生物合成速率，有助于研究线粒体基因表达缺陷。本方案可提供有关所有酵母线粒体mRNA翻译速率的重要信息，但需设置多个对照及附加实验，才能得出准确结论。

引言

线粒体是真核细胞代谢中起重要作用的细胞器。其电子传递链为细胞提供ATP，而ATP是多种生物化学途径中主要的能量载体。此外，线粒体还参与细胞凋亡、脂肪酸和血红素的合成以及其他多种过程。线粒体功能障碍是人类疾病的重要已知成因之一¹。这种功能障碍可能源于编码线粒体结构或调控组分的核基因或线粒体基因发生突变²。酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae是研究线粒体基因表达的优良模式生物，原因如下：首先，其基因组已完全测序³，注释完善，且由于长期对该生物进行研究，文献中已积累了大量相关数据；其次，由于其生长速度快且同源重组效率高，对其核基因组的操作相对快速简便；第三，酿酒酵母S. cerevisiae是少数几种已建立线粒体基因组操作方法的生物之一；最后，酿酒酵母是一种兼性好氧-厌氧生物，能够在含有可发酵碳源的培养基中生长，因此可用于分离和研究呼吸缺陷型突变体。

我们描述了一种在翻译水平上研究酿酒酵母S. cerevisiae线粒体基因表达的方法⁴。该方法的主要原理基于以下几项观察结果。首先，酵母线粒体基因组仅编码八种蛋白质：细胞色素c氧化酶的三个亚基（Cox1p、Cox2p和Cox3p）、ATP合酶的三个亚基（Atp6p、Atp8....

方案

1. 酵母培养物的制备

1. 从冻存的酵母菌种中取菌，在含有适当培养基的新鲜平板上划线接种。将平板置于30 °C培养箱中培养24–48小时。
   注意：温度敏感型突变株应在允许温度下培养。
2. 从新鲜划线平板上挑取酵母菌落，接种于含有2 mL YPGal培养基（2% 蛋白胨，1% 酵母提取物，2% 半乳糖）的15 mL试管中，于30 °C、200 rpm振荡条件下过夜培养。
3. 测定菌液在600 nm波长处的光密度（OD₆₀₀）。
4. 取相当于0.2吸收单位的菌液体积，转移至无菌离心管中，在室温下以9,000 × g 离心30秒，收集菌体并弃去上清液。
5. 加入0.5 mL无菌水重悬菌体，涡旋振荡5秒进行洗涤。在室温下以9,000 × g 离心30秒，弃去上清液，将菌体重悬于2 mL新鲜YPGal培养基中。
6. 在30 °C、200 rpm振荡条件下继续培养，直至OD₆₀₀达到1.5–1.9。
   注意：酵母生长速率存在差异，需做好等待准备。建议在清晨尽早进行步骤1.3–1.6。通常需要4–5小时，但也可能更长时间。

2. 放射性同位素掺入

1. 将相当于一个光密度单位的培养物体积转移至微量离心管中。在3,000 × g 条件下离心....

结果

根据上述方案，我们对两种酿酒酵母（S. cerevisiae）菌株的线粒体翻译产物进行了鉴定：野生型（WT）和AIM23基因缺失突变体（AIM23Δ），后者编码线粒体翻译起始因子3（表1）⁸。线粒体翻译产物通过放射性标记，并在SDS-PAAG中分离。在信号饱和前每2.5分钟收集一次样品，以构建时间进程（图1A）。凝胶经染色、干燥后，进行5天曝光检测（图1A）。

若实验成功，图中应显示八条与标准模式相对应的条带⁴。然而，各条带的强度可能因菌株和实验条件的不同而存在显著差异。每一条带对应一种翻译产物。数据（图1A）表明，AIM23Δ 菌株具备线粒体蛋白质合成能力，因为在野生型（WT）中出现的所.......

讨论

基因表达研究在现代生命科学中占据核心地位。人们已开发出多种方法以深入了解这一复杂过程。本文描述了一种用于检测酿酒酵母S. cerevisiae线粒体中蛋白质生物合成的方法。该方法通常用于比较突变型酵母菌株与野生型菌株线粒体中mRNA的翻译效率，从而评估所研究突变的影响。当研究人员研究可能影响线粒体功能的突变酵母细胞时，这是他们常进行的一项基础实验^8,11,12,13。该实验常与氧气消耗速率和线粒体膜电位的测定相结合。然而，该方法所提供的信息尚不足以区分基因表达的哪个阶段受到了影响，因此需要一系列附加实验来进一步确定。首先，需通过Northern印迹或RT-qPCR检测线粒体mRNA，以评估转录水平的变化。其次，应使用特异性抗体对总蛋白提取物进行Western印迹分析，以评估蛋白质表达水平。第三，应先用标记的³⁵S-甲硫氨酸（“热”脉冲）进行脉冲.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2-巯基乙醇	Sigma-Aldrich	M3148
丙烯酰胺	Sigma-Aldrich	A9099
过硫酸铵	Sigma-Aldrich	A3678
细菌用琼脂	Sigma-Aldrich	A5306
Biowave 细胞密度计 CO8000	BIOCHROM US BE	80-3000-45
BRAND 标准一次性比色皿	Sigma-Aldrich	Z330361
氯仿	Sigma-Aldrich	288306
放线菌酮	Sigma-Aldrich	C1988
D-(+)-半乳糖	Sigma-Aldrich	G5388
D-(+)-葡萄糖	Sigma-Aldrich	G7021
数字式恒温金属浴	Thermo Scientific	88870001
EasyTag L-[35S]-甲硫氨酸，500µCi (18.5MBq)，稳定水溶液	Perkin Elmer	NEG709A500UC
Eppendorf 离心机 5425	Thermo Scientific	13-864-457
GE 储存式磷屏	Sigma-Aldrich	GE29-0171-33
L-甲硫氨酸	Sigma-Aldrich	M9625
甲醇	Sigma-Aldrich	34860
N,N,N′,N′-四甲基乙二胺	Sigma-Aldrich	T9281
N,N′-亚甲基双丙烯酰胺	Sigma-Aldrich	M7279
New Brunswick Innova 44/44R 摇床培养箱	New Brunswick Scientific
肉源性蛋白胨，细菌用	Millipore	91249
苯甲基磺酰氟	Sigma-Aldrich	P7626
Pierce 660 nm 蛋白检测试剂盒	Thermo Scientific	22662
PowerPac Basic 电源供应器	Bio-Rad	1645050
Protean II xi 电泳槽	Bio-Rad	1651802
来自白色链霉菌的盐酸嘌呤霉素	Sigma-Aldrich	P8833
氢氧化钠	Sigma-Aldrich	221465
Storm 865 磷光成像仪	GE Healthcare
Trizma 基础缓冲液	Sigma-Aldrich	93352
真空加热凝胶干燥器	Cleaver Scientific	CSL-GDVH
酵母提取物	Sigma-Aldrich	Y1625