使用免疫荧光检测斑马鱼胚胎心脏PM2.5诱发DNA损伤

摘要

该协议使用免疫荧光检测检测斑马鱼胚胎解剖心脏中_PM2.5诱发的DNA损伤。

摘要

环境细颗粒物（PM_2.5）暴露可导致心脏发育毒性，但潜在的分子机制尚不清楚。8-羟基-2'脱氧酶（8-OHdG）是氧化DNA损伤的标记，+H2AX是DNA双链断裂的敏感标记。在这项研究中，我们旨在通过免疫荧光检测斑马鱼胚胎心脏的PM_2.5诱导8-OHDG和+H2AX变化。斑马鱼胚胎在受精后2小时（hpf）2小时时，以5微克/mL的PM_2.5 处理可提取的有机物质（EOM）。DMSO 被用作车辆控制。在72马力，心脏被解剖从胚胎使用注射器针和固定和渗透。被阻塞后，用原样抗体对8-OHdG和+H2AX进行探测。然后用二次抗体清洗和孵育样品。由此产生的图像在荧光显微镜下观察，并使用 ImageJ 进行量化。结果表明，EOM从下午_2.5 显著增强8-OHDG和+H2AX信号在斑马鱼胚胎的心脏。然而，NAC作为活性氧物种（ROS）的清除剂，部分抵消了EOM引起的DNA损伤。在这里，我们提出了一个免疫荧光方案，用于研究DNA损伤在PM_2.5诱发的心脏缺陷中的作用，可用于检测斑马鱼胚胎心脏中环境化学诱发的蛋白质表达变化。

引言

空气污染是目前世界面临的一个严重的环境问题。环境细颗粒物（PM_2.5）是空气质量最重要的指标之一，可携带大量有害物质进入血液循环系统，对^{人体健康造成}严重危害。流行病学研究表明，PM_2.5暴露可导致先天性心脏缺陷（CHDs）2，3的风险增加。动物实验的证据表明_，PM2.5可导致斑马鱼胚胎和小鼠后代心脏发育异常，但_PM2.5心脏发育毒性的分子机制仍鲜为人知^。

DNA损伤可引起细胞周期骤停并诱发凋亡，从而可能广泛破坏祖细胞的潜力，进而损害心脏发育^。有充分证据表明，环境污染物，包括_PM2.5，有可能通过氧化应激机制^8，9攻击DNA。人类和斑马鱼心脏发育都对氧化应激^10、11、12

方案

本研究中使用的野生斑马鱼（AB）是从中国武汉国家斑马鱼资源中心获得的。这里概述的所有动物程序都经过了苏乔大学伦理委员会动物护理研究所的审查和批准。

1. 下午_2.5 采样和有机化合物提取

注:下午_2.5 收集于中国苏州市区，2015年8月1-7日，如前^5日所述。

1. 在 500 °C 消声炉中烘烤 47 mm 石英膜过滤器 2 小时，以去除有机成分。
2. 将过滤器放到 PM_2.5 取样器中，进行 24 小时的不间断取样。
3. 取出过滤器，在室温下干燥 24 小时。
4. 使用分析平衡对过滤器进行量化。
5. 使用二氯甲烷作为溶剂¹⁹从过滤器中提取有机成分。
6. 在 60 °C 的水浴和氮流中旋转蒸发，干燥 EOM。在 DMSO 中溶解 EOM，并在 -20 °C 下存储。

2. 斑马鱼胚胎收集和治疗

1. 将斑马鱼保持在 28.5 ± 0.5 °C 的循环水产养殖系统中，具有 14 h 光和 10 h 深色光周期。
2. 以2:1的雄性与雌性比例将健康的成年斑马鱼放入水箱中。<....

结果

这种免疫荧光检测是测量暴露于环境化学物质的斑马鱼胚胎心脏蛋白质表达变化的一种敏感而具体的方法。

在这个具有代表性的分析中，在没有抗氧化剂NAC的情况下暴露于_PM2.5的胚胎被评估为存在心脏畸形（图1）。观察到，与 DMSO 控制治疗的心脏相比，PM_2.5导致心脏畸形发生显著增加，如心周水肿、循环改变和尺寸缩小。暴露于 EOM 的胚胎的心跳率也显著下降（图 1B）。NAC的加入显著减轻了EOM引起的心脏缺陷（图1）。

在这里，免疫荧光检测用于测量斑马鱼胚胎中的8-OHdG和+H2AX表达，以评估EOM处理组织DNA.......

讨论

虽然斑马鱼是研究环境化学物质心脏发育毒性的极好的脊椎动物模型，但由于胚胎心脏体积小，很难获得足够的蛋白质进行西方污点分析。因此，我们提出了一种敏感的免疫荧光方法，用于量化暴露在PM_2.5下的斑马鱼胚胎心脏中DNA损伤生物标志物的蛋白质表达水平。

在解剖过程中，保持心脏的完整性是很重要的。根据我们的经验，在 72 hpf 下执行隔离相对容易。此外，心脏需要在收集后尽快投入固定解决方案。另一个关键步骤是干燥样品，以确保解剖的心完全附着在玻璃滑梯上。否则，样品可能会在标记过程中从幻灯片中冲走。

进行双免疫荧光染色，以检测孤立心脏中的 8-OHdG 和 +H2AX 信号。这种方法不仅节省了劳动力，允许使用减少的样本量，而且还有助于两个信号的共同定位。虽然这种基于抗体的方法不能检测活体胚胎中的荧光信号，但这种快速协议可用于检测孤立斑马鱼胚胎心脏中的蛋白质表达。

据经常报道，氧化应激调解_PM2.5诱发DNA损伤

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
8-OHdG 抗体	Santa Cruz Biotechnology， USA	sc-66036	一抗
分析天平	Sartorius，中国	BSA124S
BSA	Solarbio，中国北京	SW3015	用于封闭
DAPI	Abcam， USA	ab104139	用于细胞核复染剂。
DMSO	Solarbio，中国北京	D8371
荧光显微镜	日本奥林巴斯	IX73	用于成像荧光信号/
山羊抗兔 IgG Cy3	美国卡尔斯巴德	CW0159
山羊抗兔 IgG 二抗 FITC	美国卡尔斯巴德	RS0003	二抗
N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）	Adamas-Beta，中国上海	616-91-1
轨道摇床	QILINBEIER，中国	TS-1
多聚甲醛	Sigma，中国	P6148	制备 4% 多聚甲醛进行固定。
磷酸盐缓冲盐水	HyClone，美国	SH30256.01	在 PBS 中制备 0.1% 吐温用于洗涤。
PM2.5 采样器	TianHong，Wuhan， China	TH-150C	用于 24 小时不间断的 PM2.5 采样。
再循环水产养殖系统	HaiSheng，上海，中国		斑马鱼被养在其中。
索氏萃取仪	ZhengQiao，中国上海	BSXT-02	用于有机成分萃取。
立体显微镜	加拿大尼康	SMZ645	用于斑马鱼胚胎的心脏解剖。
甲磺酸三卡因 （MS222）	Sigma，中国	E10521	麻醉斑马鱼胚胎
Tween 20	Sigma，中国	P1379
γH2AX 抗体	Abcam， USA	ab26350	一抗