本方案采用免疫荧光法检测斑马鱼胚胎离体心脏中由PM2.5诱导的DNA损伤。
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方法文章
利用免疫荧光法检测细颗粒物 PM2.5 诱导的斑马鱼胚胎心脏 DNA 损伤
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
环境细颗粒物（PM2.5）暴露可导致心脏发育毒性，但其潜在的分子机制尚不明确。8-羟基-2'-脱氧鸟苷（8-OHdG）是氧化性DNA损伤的标志物，γH2AX是DNA双链断裂的敏感标志物。本研究旨在通过免疫荧光检测法，检测PM2.5诱导的斑马鱼胚胎心脏中8-OHdG和γH2AX的变化。在受精后2小时（hpf），将斑马鱼胚胎暴露于PM2.5的可提取有机成分（EOM）中，浓度为5 μg/mL，并同时加入或不加入抗氧化剂N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC，0.25 μM）。以DMSO作为溶剂对照。在72 hpf时，使用注射器针头从胚胎中分离心脏组织，并进行固定和通透处理。封闭后，样品与抗8-OHdG和抗γH2AX的一抗孵育，随后洗涤并加入二抗进行孵育。最终通过荧光显微镜观察结果，并使用ImageJ进行定量分析。结果显示，PM2.5来源的EOM显著增强了斑马鱼胚胎心脏中8-OHdG和γH2AX的信号表达；然而，作为活性氧（ROS）清除剂的NAC部分逆转了EOM诱导的DNA损伤。本文提供了一种免疫荧光实验方案，可用于研究DNA损伤在PM2.5诱导的心脏缺陷中的作用，该方法亦可推广应用于检测环境化学物质诱导的斑马鱼胚胎心脏中蛋白表达的变化。
引言
空气污染现已成为全球面临的一项严峻环境问题。环境细颗粒物（PM2.5）是空气质量最重要的指标之一，可携带大量有害物质并进入血液循环系统，对人体健康造成严重危害1。流行病学研究已表明，暴露于PM2.5会增加先天性心脏病（CHDs）的发病风险2,3。动物实验的证据也显示，PM2.5可导致斑马鱼胚胎及小鼠子代心脏发育异常，但PM2.5对心脏发育毒性的分子机制仍 largely 未知4,5,6。
DNA损伤可导致细胞周期阻滞并诱导细胞凋亡，这可能广泛破坏前体细胞的潜能，进而损害心脏发育7)。已有充分文献记载，包括PM2.5在内的环境污染物可通过氧化应激机制攻击DNA8,9。人类和斑马鱼的心脏发育均对氧化应激敏感10,11,12。8-OHdG是氧化性DNA损伤的标志物，γH2AX信号则是DNA双链断裂的标志物。N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）是细胞内半胱氨酸和谷胱甘肽的合成前体，被广泛用作抗氧化化合物。在本研究中，我们使用NAC来探究氧化应激在PM2.5诱导的DNA损伤中的作用13。
斑马鱼作为一种模式脊椎动物，已被广泛用于研究心脏发育及人类心血管疾病，因为脊椎动物间心脏发育的机制具有高度保守性14,15。使用斑马鱼作为模型的优势包括其体型小、繁殖能力强以及饲养成本低。尤其值得注意的是，斑马鱼胚胎在早期发育阶段不依赖循环系统，因而能够耐受严重的心脏畸形14。此外，其身体透明性使得整个个体可在显微镜下直接观察。因此，斑马鱼胚胎为评估暴露于各种环境化学物质后所引发的心脏发育毒性相关分子机制提供了极佳的研究机会5,16,17。我们此前已报道，PM2.5诱导的氧化应激会导致DNA损伤和细胞凋亡，从而引起斑马鱼心脏畸形18。本研究中，我们提供了一套详细的实验方案，用于研究PM2.5在斑马鱼胚胎心脏中诱导的DNA损伤。
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方案
本研究使用的野生型斑马鱼（AB）购自中国武汉的国家斑马鱼资源中心。文中所述所有动物实验程序均已通过苏州大学伦理委员会动物护理机构的审查和批准。
1. PM2.5 采样与有机化合物提取
注意：PM2.5 于2015年8月1日至7日在中国苏州城区采集，方法如前所述5。
- 将47 mm石英膜滤膜置于500 °C马弗炉中灼烧2小时，以去除有机成分。
- 将一张滤膜放入PM2.5采样器中，连续采样24小时。
- 取出滤膜，在室温下干燥24小时。
- 使用分析天平对滤膜进行称量。
- 采用索氏提取法，以二氯甲烷为溶剂，从滤膜中提取有机成分19。
- 在60 °C水浴中，通过旋转蒸发并通入氮气流使EOM干燥。将EOM溶解于DMSO中，并于-20 °C保存。
2. 斑马鱼胚胎的收集与处理
- 将斑马鱼饲养于循环水养殖系统中，温度维持在 28.5 ± 0.5 °C，光照周期为 14 小时光照和 10 小时黑暗。
- 将健康的成年斑马鱼以 2:1 的雄雌比例放入养殖缸中。
- 次日收集胚胎，并用系统水（即斑马鱼繁育用水）清洗。
- 挑选发育正常（大小均匀、卵粒饱满、无卵凝固现象）的斑马鱼胚胎，随机分配至四个独立的直径为 7 cm 的玻璃培养皿中，每组约 50 个胚胎。
- 从受精后 2 小时（2 hpf）至 72 小时（72 hpf），用 PM2.5（5 mg/L）处理胚胎，同时设置或不设置 0.25 μM 的 NAC 共同处理。以 DMSO 作为溶剂对照，终浓度为 0.1%（v/v）。
3. 斑马鱼胚胎形态学观察及心脏解剖
- 在72 hpf时，将胚胎转移至玻璃载片上，在体视显微镜下观察。记录心脏畸形情况，如心包水肿、心管环化异常以及心脏尺寸减小。
- 计算畸形率（具有心脏缺陷的胚胎数占总存活胚胎数的百分比），并采用单因素方差分析（one-way ANOVA）结合Tukey多重比较检验分析组间差异（p < 0.05 表示差异具有统计学意义）。
- 使用0.6 mg/mL MS-222麻醉胚胎，使其在玻璃载片上固定不动。
- 记录30秒内心跳次数，并使用ImageJ软件5,20量化心率。
- 在体视显微镜下，使用一次性注射器针头解剖斑马鱼胚胎的心脏。注意：避免破坏心脏形态。
4. 免疫荧光检测
- 为了利用免疫荧光法检测细颗粒物 PM2.5 诱导的斑马鱼胚胎心脏 DNA 损伤，使用疏水性隔离笔在洁净的玻片表面画一个圆圈。
- 将 50 μL 的 4% 多聚甲醛加入 1.25 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）中，配制固定液。
- 将 3 个解剖获得的心脏组织置于一个疏水性隔离笔画出的圆圈内，在室温下孵育 20 分钟。
- 在显微镜下倾去溶液，并在室温下干燥样品至少 5 分钟，使心脏组织完全贴附于玻片表面。
- 用含 0.1% Tween 20 的 PBS（PBST）洗涤玻片三次，每次 5 分钟。
- 将 50 μL 牛血清白蛋白（BSA）加入 1000 μL PBST 中，配制成 5% BSA 溶液，并将玻片置于湿盒中孵育 1 小时，以阻断非特异性抗体结合。
- 倾去溶液，并用 PBST 洗涤样品三次，每次 5 分钟。
- 将 2 μL 针对 8-OHdG 的小鼠单克隆抗体和 2 μL 针对 γH2AX 的兔多克隆抗体溶于 296 μL PBST 中，配制成工作浓度的一抗混合溶液。
- 在湿盒中，用 50 μL 一抗混合溶液（针对 8-OHdG 和 γH2AX）孵育心脏样品，室温孵育至少 1 小时，或 4 °C 过夜（过夜孵育可增强信号强度）。
- 倾去溶液，并用 PBST 洗涤样品三次，每次 5 分钟。
- 将 1 μL FITC 标记的山羊抗小鼠二抗和 1 μL Cy3 标记的山羊抗兔二抗溶于 498 μL PBST 中，配制成工作浓度的二抗混合溶液，并将样品在避光条件下、室温孵育 1 小时（二抗稀释比例为 1:500，溶于 PBST）。
- 倾去溶液，并在避光条件下用 PBS 洗涤样品三次，每次 5 分钟。
- 向样品中加入 20 μL DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚），室温孵育 30 分钟，进行细胞核染色。
- 盖上盖玻片，并用指甲油封片以防止干燥和移动。随后在荧光显微镜下观察样品，并使用 ImageJ 软件定量心脏区域的荧光信号。以 DMSO 对照组样品的平均值为基准计算相对变化，并按照步骤 3.2 的方法确定数据的统计学显著性。
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结果
该免疫荧光检测是一种灵敏且特异的方法，用于检测暴露于环境化学物质的斑马鱼胚胎心脏中蛋白质表达水平的变化。
在此代表性分析中，评估了在有或无抗氧化剂NAC存在下暴露于PM2.5的胚胎是否出现心脏畸形（图1）。如结果所示，与经DMSO对照处理的心脏相比，PM2.5的有机提取物（EOM）显著增加了心脏致畸率，表现为心包水肿、心管环化异常以及心脏尺寸减小。暴露于EOM的胚胎心跳速率也显著降低（图1B）。添加NAC可显著减轻EOM引起的心脏缺陷（图1）。
本研究采用免疫荧光法检测斑马鱼胚胎中8-OHdG和γH2AX的表达水...
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讨论
尽管斑马鱼是研究环境化学物对心脏发育毒性的优良脊椎动物模型，但由于胚胎心脏体积微小，难以获取足够的蛋白质用于蛋白质印迹分析。因此，我们提出一种灵敏的免疫荧光方法，用于定量分析暴露于PM2.5的斑马鱼胚胎心脏中DNA损伤生物标志物的蛋白表达水平。
在解剖过程中，保持心脏结构的完整性至关重要。根据我们的经验，在受精后72小时（72 hpf）进行心脏分离相对容易。此外，心脏组织在取出后应尽快放入固定液中。另一个关键步骤是干燥样品，以确保解剖后的心脏完全贴附在玻片上；否则，在标记过程中样品可能会从玻片上被冲洗掉。
进行双重免疫荧光染色以检测分离心脏中8-OHdG和γH2AX信号。该方法不仅节省人力并可减少样本用量，还有助于两种信号的共定位分析。尽管这种基于抗体的方法无法检测活体胚胎中的荧光信号，但该快速方案可用于检测分离的斑马鱼胚胎心脏中的蛋白质表达。
已有大量报道表明，氧化应激介导了PM2.5诱导的DNA损伤
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作得到中国国家自然科学基金（资助号：81870239、81741005、81972999）和江苏省高校优势学科建设工程项目的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 8-OHdG 抗体 | Santa Cruz Biotechnology, USA | sc-66036 | 一抗 |
| 分析天平 | Sartorius,China | BSA124S | |
| BSA | Solarbio,Beijing,China | SW3015 | 用于封闭 |
| DAPI | Abcam, USA | ab104139 | 用于细胞核复染 |
| DMSO | Solarbio,Beijing,China | D8371 | |
| 荧光显微镜 | Olympus, Japan | IX73 | 用于荧光信号成像 |
| 羊抗兔 IgG Cy3 | Carlsbad,USA | CW0159 | 二抗 |
| 羊抗兔 IgG FITC | Carlsbad,USA | RS0003 | 二抗 |
| N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC） | Adamas-Beta, Shanghai, China | 616-91-1 | |
| 旋转摇床 | QILINBEIER,China | TS-1 | |
| 多聚甲醛 | Sigma,China | P6148 | 配制 4% 多聚甲醛用于固定 |
| 磷酸盐缓冲液 | HyClone,USA | SH30256.01 | 配制含 0.1% Tween 的 PBS 用于洗涤 |
| PM2.5 采样器 | TianHong,Wuhan, China | TH-150C | 用于连续 24 小时 PM2.5 采样 |
| 循环水养殖系统 | HaiSheng,Shanghai,China | 用于斑马鱼的饲养 | |
| 索氏提取器 | ZhengQiao,Shanghai, China | BSXT-02 | 用于有机成分提取 |
| 体视显微镜 | Nikon,Canada | SMZ645 | 用于斑马鱼胚胎心脏解剖 |
| 三卡因甲磺酸盐（MS222） | Sigma,China | E10521 | 用于麻醉斑马鱼胚胎 |
| Tween 20 | Sigma,China | P1379 | |
| γH2AX 抗体 | Abcam, USA | ab26350 | 一抗 |
参考文献
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