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一种可重复的面向重症监护病房的大鼠内毒素模型

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DOI：

10.3791/62024

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2021年2月20日

 , 
1Institute of Physiology, University of Zurich, 2Institute of Anesthesiology, University Hospital of Zurich

本文内容

摘要

本文介绍了一种可重复的大鼠重症监护病房导向型内毒素模型。

摘要

脓毒症和脓毒性休克仍然是重症监护病房死亡的首要原因。尽管脓毒症管理已取得显著进展，但病死率仍介于20%至30%之间。迫切需要新的治疗方法以减少脓毒症相关的多器官功能衰竭和死亡。可靠的动物模型可用于一种或多种治疗方案，并可检测其对生理和分子参数的影响。本文介绍了一种简单的动物模型。

首先，通过使用挥发性麻醉剂或腹腔注射麻醉剂对动物实施全身麻醉。放置静脉导管（尾静脉）、进行气管切开术以及插入动脉导管（尾动脉）后，开始机械通气。记录平均动脉血压、动脉血氧饱和度和心率的基线值。

将脂多糖（1 毫克/千克体重）溶解于磷酸盐缓冲液中注射，可通过Toll样受体4诱导强烈且可重复的炎症反应。液体纠正以及去甲肾上腺素的应用均依据已建立完善的方案进行。

本文介绍的动物模型易于掌握，且高度贴近重症监护病房中临床脓毒症治疗的实际情境，包括镇静、机械通气、持续血压监测以及重复采血等操作。此外，该模型具有良好的可靠性，能够在符合动物研究“3R”原则（减少、替代、优化）的前提下，使用较少数量的动物获得可重复的实验数据。尽管脓毒症研究中的动物实验尚难以完全替代，但通过重复测量可减少所需动物数量，同时使脓毒症动物在麻醉状态下维持实验过程，从而减轻其痛苦。

引言

脓毒症及其更严重的形态——脓毒性休克，是由感染引发的综合征，可导致过度的炎症反应，伴随细胞因子释放，引起生理和生化改变，造成免疫防御功能受抑，并产生致命后果1,2。这种失衡的炎症反应会导致肺、肾、肝等多个重要器官的功能障碍甚至器官衰竭。脓毒症是患者入住重症监护病房（ICU）最常见的原因之一，占比达37%3。目前，脓毒症的死亡率约为20-30%4。早期且有效的抗生素治疗至关重要5。液体复苏和血管加压药的使用需尽早实施，除此之外，治疗均为支持性措施6。

脓毒症定义为存在明确或疑似由细菌、真菌、病毒或寄生虫引起的感染，并伴有器官功能障碍。当患者出现对单纯液体治疗无反应的进一步心血管衰竭，且乳酸水平超过2毫摩尔/升时，即符合脓毒性休克的标准2。与脓毒症相关的器官衰竭可发生在任何器官，但在心血管系统、脑、肾、肝和肺中尤为常见。大多数脓毒症患者需要进行气管插管，以确保气道通畅、防止误吸，并通过高吸氧浓度实施呼气末正压通气，从而预防或纠正低氧血症。为了耐受气管导管和机械通气，患者通常需要接受镇静治疗。

内毒素（如革兰氏阴性菌细胞膜组分脂多糖（LPS））可通过Toll样受体4（TLR4）7引发强烈的炎症反应。特定信号通路的激活可确保炎症反应的稳定。细胞因子如细胞因子诱导的中性粒细胞趋化蛋白1（CINC-1）、单核细胞趋化蛋白1（MCP-1）和白细胞介素6（IL-6）在此模型中被公认为评估疾病严重程度和预后的预测因子8。静脉注射LPS已成功用于研究大鼠脓毒症的多个方面8,9。

脓毒症的治疗仍然是一个挑战，尤其是由于缺乏可预测的动物模型。内毒素血症是否能够通过激活全身性炎症反应，成为药物治疗研究的合适模型，目前尚存争议。然而，通过众所周知的LPS诱导的TLR4通路，仍可获得重要的科学认识。

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方案

本方案中所述的所有实验均获得瑞士苏黎世州兽医管理局的批准（批准编号：134/2014 和 ZH088/19）。此外，本实验中进行的所有操作均遵循瑞士医学科学学会（SAMS）发布的《动物实验指南》以及欧洲实验动物科学联合会（FELASA）的指导原则。

1. 麻醉诱导与动物监测

  1. 将体重为250–300克（g）的雄性Wistar大鼠饲养于通风良好的笼具中，维持无病原体环境。保持12小时光照/12小时黑暗的循环，环境温度为22 ± 1 °C，并自由供应食物和饮水。
  2. 通过异氟烷挥发诱导（在麻醉诱导箱中浓度为3–5%）30秒（图1A）进行全身麻醉；或 alternatively，通过单次注射氯胺酮/赛拉嗪（每100 g体重10/1毫克（mg））诱导麻醉。
  3. 将动物转移至操作台，并在整个实验过程中将其置于加热垫上。维持体温在36.5至37 °C之间。
  4. 使用鼻导管提供氧气（600 mL/分钟）。若选择挥发性麻醉维持麻醉状态，则加入2–3%异氟烷。确保动物自主呼吸。
  5. 在实施气管切开术以及动脉和静脉导管置入前，通过脚趾夹捏反射消失 来确认麻醉深度。
  6. 通过外周血氧饱和度监测验证充分的氧合状态（正常血氧饱和度为98–100%）。
  7. 使用眼膏（维生素A眼膏）保护眼睛。
  8. 在侧边操作台上准备无菌外科器械和导管，如图1B所示。
  9. 此外，准备压力和血氧饱和度监测装置，如图1C所示。

2. 静脉通路

  1. 在大鼠尾部近端绑扎止血带，以方便静脉穿刺（图2A）。
  2. 用酒精对尾部消毒3次。
  3. 将G26静脉导管插入两条侧尾静脉之一。
    注意：根据我们的经验，在大鼠尾部远端放置静脉通路更为容易，因为此处静脉更靠近皮肤表面。此外，若穿刺失败，仍有足够空间向近端移动进行再次尝试。
  4. 严格避免注入空气。
  5. 放置静脉导管后，松开止血带。
  6. 用胶带固定静脉导管位置（图2B）。
  7. 将注射泵连接至静脉通路，用于持续输注液体和药物。
  8. 使用三通阀进行推注给液、给药以及静脉采血。

3. 气管切开术

  1. 剃除动物颈部前侧的毛发。
  2. 用聚维酮碘溶液对剃毛后的皮肤消毒3次。
  3. 使用手术刀（10号刀片）进行约2厘米的纵向切口。
  4. 用2-0丝线缝合牵开皮肤。
  5. 用手术剪钝性分离喉部和气管（图 3A).
  6. 务必使用显微外科剪刀切开气管 3-5 处的剪刀th 气管夹
  7. 插入无菌气管插管至气管内。注意避免插入过深，以防发生单侧通气。
  8. 使用2-0丝线缝合固定套管。
  9. 将套管连接至呼吸机，进行压力或容量控制通气（图3B).

4. 动脉通路

  1. 用聚维酮碘溶液对大鼠尾巴进行三次消毒。
  2. 使用手术刀（10号刀片）在腹侧纵向切开皮肤，长度约1厘米。
  3. 操作时需小心，避免切得过深，以防损伤尾动脉。
  4. 使用手术显微镜仔细暴露动脉，并用显微外科剪剪开动脉周围的筋膜。
  5. 用6-0丝线结扎动脉的远端部分。
  6. 预先准备好近端的6-0丝线，但暂不收紧（图4A）。
  7. 将G-26导管插入远端和近端丝线之间的动脉内。
  8. 导管进入动脉后，收紧近端丝线并固定导管位置（图4B）。
  9. 将导管连接至压力传感器，以实现持续的动脉压监测（正常平均动脉压：60 - 100 mmHg）（图4C）。
  10. 此外，在连接压力传感器的导管与G-26导管之间安装一个三通旋塞阀，用于动脉采血。

5. 基线测量、脓毒症诱导及随访测量

  1. 当动物达到稳态后，注射脂多糖（LPS）。
  2. 在达到稳态时采集血样（通常在15–30分钟后）。
  3. 以1:4的比例用林格氏液补充因采血造成的液体丢失。
  4. 为诱导脓毒症，可将脂多糖（LPS）作为推注给药或持续输注应用。
  5. 对于推注给药，将1 mg/kg体重（kg）的脂多糖（LPS）溶解于磷酸盐缓冲液（PBS）中，浓度为1 mg/mL，进行注射。
  6. 对于持续输注，使用注射泵在整个实验过程中以300 µg/kg/小时的速度输注脂多糖（LPS）（LPS储备液：1 mg/mL溶于PBS中）。
  7. 务必始终避免空气注射，以防发生空气栓塞。
  8. 在开始实验前，应预先确定液体补充方案、血管收缩剂应用方案以及实验终止标准（例如，尽管进行了液体补充，平均动脉压仍持续低于50 mmHg超过30分钟即定义为低血压）。
    注意：我们建议以10 mL/kg/小时的速度持续输注林格氏液。
  9. 从输注总量中扣除任何持续给予的液体量（例如用于持续LPS输注的液体），以确保与对照组的结果具有可比性。
    注意：在实验结束时，若需采集肝脏、肾脏或脾脏等器官进行组织学或生化分析，可通过切开下腔静脉的方式处死动物。如果需要评估器官中的炎症标志物，建议在切开下腔静脉前先使动物达到外科麻醉深度，并向左心室注射冰冻生理盐水，作为推荐的安乐死方法。务必遵守相关法律法规和本地指导原则。为验证脓毒症相关的器官功能障碍，可分析促凋亡标志物如caspase-3，以及α1-微球蛋白以确认肾脏小管损伤。对CINC-1、MCP-1和IL-6等标志物进行器官特异性分析 也可提供有关器官特异性炎症反应的信息。

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结果

如先前报道所述9，本系统可在血流动力学稳定的动物中建立内毒素血症模型。尽管给予脂多糖（LPS）刺激与未给予LPS刺激的动物其平均动脉压均保持稳定，但LPS处理组动物表现出脓毒症的特征，例如出现负碱剩余以及通过血浆细胞因子检测到的强烈炎症反应（给药后6小时），包括CINC-1（867 ng/mL）、MCP-1（5027 ng/mL）和IL-6（867 ng/mL）8，图5。

手术设备设置和显示心电监测数据的心电图仪。
图1：设备准备：

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讨论

本文所述方案可建立一种高度可重复且易于掌握的脓毒症模型，并可根据具体研究问题进行调整。实验过程中可连续采集与器官功能相关的关键体内数据，如心率、血压和外周动脉血氧饱和度，同时可多次进行血液采样。此外，还可根据需要调整液体复苏方案和血管加压支持措施。由于动物血流动力学状态稳定，实验可持续数小时，如先前报道所述8。

必须指出，为了回答特定的研究问题，应选择合适的脓毒症模型10,11。所有脓毒症模型均有其优势，但也存在局限性。本文介绍了一种内毒素血症模型，可诱导强烈但无菌的炎症反应。该模型具备脓毒症的关键特征，例如强烈的炎症反应12、内皮功能障碍与损伤13以及多器官衰竭14。因此，本研究所采用的模型符合"脓毒症临床前研究国际专家共识"此前发布的动物脓毒症模型定义

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披露

作者们对本研究所述内容无任何利益冲突。Martin Schläpfer 已提交一项专利，旨在减轻患者因使用医用气体（特别是氧气（O2）和二氧化碳（CO2））而产生的手术和/或麻醉的负面影响。他曾获得来自瑞典 Sedana Medical 和瑞士 Roche 公司的非限制性研究资助，但这些资助与本研究无关。

致谢

作者谨此感谢 Beatrice Beck-Schimmer（医学博士）和 Erik Schadde（医学博士）对本文的审阅以及所做出的宝贵贡献。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
2-0 丝线缝合线Ethicon, Sommerville, NJK833标准外科手术器械
26 号静脉导管Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ391349标准麻醉设备
6-0 LOOK 黑色编织丝线Surgical Specialties Corporation, Wyomissing, PASP114标准外科手术器械
Alaris 注射泵Becton Dickinson
聚维酮碘（Betadine）Mundipharma, Basel, 瑞士7.68034E+12GTIN 编号
带弧度精细尖头显微镊World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL504513便于血管准备
精细尖头显微镊World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL501976尖端需定期抛光
Infinity Delta XL 麻醉监护仪Draeger, Lübeck, 德国
异氟烷，250 mL 瓶装Attane, Piramal, Mumbai, 印度LDNI 22098标准兽医设备
氯胺酮（Ketalar）Pfizer, 纽约, NY
来自 Escherichia coli 血清型 055:B5 的脂多糖（LPS）Sigma, Buchs, 瑞士
小号棉签Carl Roth GmbH, Karlsruhe, 德国EH11.1标准外科手术器械
林格氏液（Ringerfundin）B. Braun, Melsungen, 德国
Tec-3 异氟烷蒸发器Ohmeda, GE-Healthcare, 芝加哥, IL已不再供应标准兽医设备
赛拉嗪（Xylazin Streuli）Streuli AG, Uznach, 瑞士

参考文献

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