本文介绍了一种可重复的大鼠重症监护病房导向型内毒素模型。
本文内容
摘要
摘要
脓毒症和脓毒性休克仍然是重症监护病房死亡的首要原因。尽管脓毒症管理已取得显著进展，但病死率仍介于20%至30%之间。迫切需要新的治疗方法以减少脓毒症相关的多器官功能衰竭和死亡。可靠的动物模型可用于一种或多种治疗方案，并可检测其对生理和分子参数的影响。本文介绍了一种简单的动物模型。
首先，通过使用挥发性麻醉剂或腹腔注射麻醉剂对动物实施全身麻醉。放置静脉导管（尾静脉）、进行气管切开术以及插入动脉导管（尾动脉）后，开始机械通气。记录平均动脉血压、动脉血氧饱和度和心率的基线值。
将脂多糖（1 毫克/千克体重）溶解于磷酸盐缓冲液中注射，可通过Toll样受体4诱导强烈且可重复的炎症反应。液体纠正以及去甲肾上腺素的应用均依据已建立完善的方案进行。
本文介绍的动物模型易于掌握，且高度贴近重症监护病房中临床脓毒症治疗的实际情境，包括镇静、机械通气、持续血压监测以及重复采血等操作。此外，该模型具有良好的可靠性，能够在符合动物研究“3R”原则（减少、替代、优化）的前提下，使用较少数量的动物获得可重复的实验数据。尽管脓毒症研究中的动物实验尚难以完全替代，但通过重复测量可减少所需动物数量，同时使脓毒症动物在麻醉状态下维持实验过程，从而减轻其痛苦。
引言
脓毒症及其更严重的形态——脓毒性休克，是由感染引发的综合征，可导致过度的炎症反应，伴随细胞因子释放，引起生理和生化改变，造成免疫防御功能受抑，并产生致命后果1,2。这种失衡的炎症反应会导致肺、肾、肝等多个重要器官的功能障碍甚至器官衰竭。脓毒症是患者入住重症监护病房（ICU）最常见的原因之一，占比达37%3。目前，脓毒症的死亡率约为20-30%4。早期且有效的抗生素治疗至关重要5。液体复苏和血管加压药的使用需尽早实施，除此之外，治疗均为支持性措施6。
脓毒症定义为存在明确或疑似由细菌、真菌、病毒或寄生虫引起的感染，并伴有器官功能障碍。当患者出现对单纯液体治疗无反应的进一步心血管衰竭，且乳酸水平超过2毫摩尔/升时，即符合脓毒性休克的标准2。与脓毒症相关的器官衰竭可发生在任何器官，但在心血管系统、脑、肾、肝和肺中尤为常见。大多数脓毒症患者需要进行气管插管，以确保气道通畅、防止误吸，并通过高吸氧浓度实施呼气末正压通气，从而预防或纠正低氧血症。为了耐受气管导管和机械通气，患者通常需要接受镇静治疗。
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方案
本方案中所述的所有实验均获得瑞士苏黎世州兽医管理局的批准（批准编号：134/2014 和 ZH088/19）。此外，本实验中进行的所有操作均遵循瑞士医学科学学会（SAMS）发布的《动物实验指南》以及欧洲实验动物科学联合会（FELASA）的指导原则。
1. 麻醉诱导与动物监测
- 将体重为250–300克（g）的雄性Wistar大鼠饲养于通风良好的笼具中，维持无病原体环境。保持12小时光照/12小时黑暗的循环，环境温度为22 ± 1 °C，并自由供应食物和饮水。
- 通过异氟烷挥发诱导（在麻醉诱导箱中浓度为3–5%）30秒（图1A）进行全身麻醉；或 alternatively，通过单次注射氯胺酮/赛拉嗪（每100 g体重10/1毫克（mg））诱导麻醉。
- 将动物转移至操作台，并在整个实验过程中将其置于加热垫上。维持体温在36.5至37 °C之间。
- 使用鼻导管提供氧气（600 mL/分钟）。若选择挥发性麻醉维持麻醉状态，则加入2–3%异氟烷。确保动物自主呼吸。
- 在实施气管切开术以及动脉和静脉导管置入前，通过脚趾夹捏反射消失 来确认麻醉深度。
- 通过外周血氧饱和度监测验证充分的氧合状态（正常血氧饱和度为98–100%）。
- 使用眼膏（维生素A眼膏）保护眼睛。
- 在侧边....
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结果
如先前报道所述9，本系统可在血流动力学稳定的动物中建立内毒素血症模型。尽管给予脂多糖（LPS）刺激与未给予LPS刺激的动物其平均动脉压均保持稳定，但LPS处理组动物表现出脓毒症的特征，例如出现负碱剩余以及通过血浆细胞因子检测到的强烈炎症反应（给药后6小时），包括CINC-1（867 ng/mL）、MCP-1（5027 ng/mL）和IL-6（867 ng/mL）8，图5。
图1：设备准备：
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讨论
本文所述方案可建立一种高度可重复且易于掌握的脓毒症模型，并可根据具体研究问题进行调整。实验过程中可连续采集与器官功能相关的关键体内数据，如心率、血压和外周动脉血氧饱和度，同时可多次进行血液采样。此外，还可根据需要调整液体复苏方案和血管加压支持措施。由于动物血流动力学状态稳定，实验可持续数小时，如先前报道所述8。
必须指出，为了回答特定的研究问题，应选择合适的脓毒症模型10,11。所有脓毒症模型均有其优势，但也存在局限性。本文介绍了一种内毒素血症模型，可诱导强烈但无菌的炎症反应。该模型具备脓毒症的关键特征，例如强烈的炎症反应12、内皮功能障碍与损伤13以及多器官衰竭14。因此，本研究所采用的模型符合"脓毒症临床前研究国际专家共识"此前发布的动物脓毒症模型定义
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披露
作者们对本研究所述内容无任何利益冲突。Martin Schläpfer 已提交一项专利，旨在减轻患者因使用医用气体（特别是氧气（O2）和二氧化碳（CO2））而产生的手术和/或麻醉的负面影响。他曾获得来自瑞典 Sedana Medical 和瑞士 Roche 公司的非限制性研究资助，但这些资助与本研究无关。
致谢
作者谨此感谢 Beatrice Beck-Schimmer（医学博士）和 Erik Schadde（医学博士）对本文的审阅以及所做出的宝贵贡献。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 2-0 丝线缝合线 | Ethicon, Sommerville, NJ | K833 | 标准外科手术器械 |
| 26 号静脉导管 | Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ | 391349 | 标准麻醉设备 |
| 6-0 LOOK 黑色编织丝线 | Surgical Specialties Corporation, Wyomissing, PA | SP114 | 标准外科手术器械 |
| Alaris 注射泵 | Becton Dickinson | ||
| 聚维酮碘（Betadine） | Mundipharma, Basel, 瑞士 | 7.68034E+12 | GTIN 编号 |
| 带弧度精细尖头显微镊 | World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL | 504513 | 便于血管准备 |
| 精细尖头显微镊 | World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL | 501976 | 尖端需定期抛光 |
| Infinity Delta XL 麻醉监护仪 | Draeger, Lübeck, 德国 | ||
| 异氟烷，250 mL 瓶装 | Attane, Piramal, Mumbai, 印度 | LDNI 22098 | 标准兽医设备 |
| 氯胺酮（Ketalar） | Pfizer, 纽约, NY | ||
| 来自 Escherichia coli 血清型 055:B5 的脂多糖（LPS） | Sigma, Buchs, 瑞士 | ||
| 小号棉签 | Carl Roth GmbH, Karlsruhe, 德国 | EH11.1 | 标准外科手术器械 |
| 林格氏液（Ringerfundin） | B. Braun, Melsungen, 德国 | ||
| Tec-3 异氟烷蒸发器 | Ohmeda, GE-Healthcare, 芝加哥, IL | 已不再供应 | 标准兽医设备 |
| 赛拉嗪（Xylazin Streuli） | Streuli AG, Uznach, 瑞士 |
参考文献
- Hotchkiss, R. S., Karl, I. E. The pathophysiology and treatment of sepsis. New England Journal of Medicine. 348 (2), 138-150 (2003).
- Singer, M., et al. The Third International Consensus Definitions for Sepsis and Septic Shock (....
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