我们介绍一种利用微图案阵列获取单细胞荧光报告信号时间序列的方法。本方案详细描述了单细胞阵列的制备、活细胞扫描式延时显微镜的设置与操作，以及一个开源图像分析工具，用于对每个黏附位点的细胞整合荧光时间序列进行自动预筛选、可视化质控和追踪分析。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
单细胞阵列活细胞成像（Live-cell Imaging of Single-Cell Arrays, LISCA）是一种高通量获取单个细胞荧光信号时间序列的多功能方法。通常，从培养细胞中获取单细胞时间序列数据受到细胞运动性和细胞形态多样性的限制。黏附性微阵列可标准化单细胞的生长条件，并有助于图像分析。LISCA 将单细胞微阵列与扫描式延时显微镜技术及自动图像处理相结合。本文描述了以 LISCA 格式获取单细胞荧光时间序列的实验步骤。我们将编码增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein, eGFP）的 mRNA 转染至黏附于微图案化阵列上的细胞，并通过扫描式延时显微镜并行监测数百个细胞的 eGFP 表达动力学。图像数据堆由新开发的软件自动处理，该软件通过对选定的细胞轮廓区域积分荧光强度，生成单细胞的荧光时间序列。我们证明，转染 mRNA 后 eGFP 表达的时间过程可被一个简单的动力学翻译模型很好地描述，该模型能够揭示 mRNA 的表达速率和降解速率。本文还讨论了 LISCA 在信号传导与凋亡背景下对多个标记物事件时间相关性分析的进一步应用。
引言
近年来，单细胞实验的重要性日益凸显。单细胞数据可用于研究细胞间的异质性、解析细胞内参数的相关性，并检测在群体测量中难以察觉的细胞动力学特征1,2,3。为了并行研究成千上万个单细胞的细胞动力学，亟需开发新方法，以实现在标准化条件下对细胞进行数小时至数天的持续监测，并随后进行定量数据分析4。本文介绍了单细胞阵列活细胞成像技术（Live-cell Imaging of Single-Cell Arrays, LISCA），该技术结合了微结构化阵列、延时显微成像和自动图像分析方法。
已有多种用于构建微结构化单细胞阵列的方法被建立并发表于文献中5,6。本文简要介绍微尺度等离子体引发的蛋白质图案化技术（Microscale Plasma-Initiated Protein Patterning, µPIPP）。使用µPIPP制备单细胞阵列的详细实验方案可参见文献7。单细胞阵列的应用可使数千个细胞精确排列在标准化的黏附位点上，每个位点为细胞提供明确定义的微环境，从而减少实验变异性的一个来源（
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
图2：结合单细胞微阵列（A）与扫描延时显微镜（B）的数据采集。 延时实验的准备工作包括：制备具有二维黏附方格微图案的单细胞阵列（1），随后进行细胞接种，并使细胞在微图案上排列对齐（2），以及将灌流系统连接至六通道载玻片，从而在延时成像过程中实现液体操控（3）。设置扫描延时实验（4），并在延时实验过程中，通过灌流系统向显微镜下的细胞注入mRNA脂质复合物溶液以完成转染（5）。比例尺：200 µm。请点击此处查看该图的放大版本。
1. 微结构单细胞阵列的制备（图2A）
- 准备用于制备 µPIPP 阵列的材料。
- 制备 pH 7.4....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
LISCA 方法能够高效地采集单个细胞的荧光时间序列。作为代表性示例，我们概述了如何应用 LISCA 方法测量转染后单细胞中 eGFP 的表达。LISCA 实验的数据可用于评估 mRNA 递送动力学，这对于高效 mRNA 药物的开发具有重要意义。
特别是，我们展示了两种基于脂质的mRNA递送系统在翻译起始时间点以及单细胞水平上的表达速率方面的不同影响。我们将培养的细胞分为两个群体：一个亚群按照方案部分所述使用脂质复合物（lipoplexes）进行转染；另一个亚群则使用相同mRNA、相同的终浓度mRNA，但以脂质纳米颗粒（LNP）作为递送系统进行转染，该脂质纳米颗粒通过微流控混合法制备。12由于脂质复合物和脂质纳米颗粒（LNP）的脂质组成不同，且其mRNA递送系统的制备方式不同，我们预期这将影响翻译动力学，因为摄取动力学会受到影响。利用LISCA方法，我们对时间点进行定量分析 t0 转染后翻译起始的时间以及细胞表达eGFP的强度，取决于转染的mRNA分子数量的乘积 m0.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
本文介绍了LISCA作为一种多功能技术，可用于在单细胞水平上追踪细胞内荧光标记物的细胞动力学。为了成功实施LISCA实验，必须首先分别建立方案部分所述的每一个步骤，然后将所有步骤整合起来。LISCA的三个主要方面各自包含关键步骤。
单细胞微阵列的制备
微阵列的质量至关重要，因为细胞在微阵列上的排列不仅影响后续所有实验步骤，还直接影响数据质量。因此，图案的几何形状和制备方法必须根据所使用的细胞类型进行优化。本文讨论的代表性结果是使用肝癌细胞系HuH7在(30 µm)2的方形图案上排列获得的。该图案几何结构也适用于其他细胞系，如A549或HEK293。对于体积较大的细胞，例如BEAS-2B，可采用边长为35 µm、方格间距为80 µm的较大方形图案。所述接种程序已针对HuH7细胞优化，但也可适用于多种其他贴壁细胞17。例如，某些细胞系需要不同尺寸的黏附点，或需要更大的黏附点间距，以避免因细胞伸长而导致的细胞间接触。
微图案应调整至黏.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
本工作得到了德国科学基金会（DFG）对协同研究中心（SFB）1032的资助。同时感谢德国联邦教育、研究与技术部（BMBF）在合作项目05K2018-2017-06716 Medisoft以及巴伐利亚州研究基金会资助项目中的支持。安妮塔·赖泽尔（Anita Reiser）得到了德国科学基金会通过慕尼黑定量生物科学研究生院（QBM）提供的博士后奖学金资助。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Adtech Polymer Engineering PTFE 微管 | Fisher Scientific | 10178071 | |
| 烘箱 | Binder | 9010-0190 | |
| CFI Plan Fluor DL 10x | Nikon | MRH20100 | |
| 干燥器 | Roth | NX07.1 | |
| Eclipse Ti-E | Nikon | ||
| eGFP mRNA | Trilink | L-7601 | |
| 雌性鲁尔接头转管连接器 | MEDNET | FTL210-6005 | |
| 胎牛血清 | Thermo Fisher | 10270106 | |
| 纤连蛋白 | Yo Proteins | 663 | |
| eGFP滤光片组 | AHF | F46-002 | |
| Fisherbrand 透明铂金固化硅胶管 | Fisher Scientific | 11768088 | |
| HEPES (1 M) | Thermo Fisher | 15630080 | |
| 培养箱 | Okolab | OKO-H201 | |
| 培养箱 | Binder | 9040-0012 | |
| 不含酚红的L-15培养基 | Thermo Fisher | 21083027 | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher | 11668027 | |
| 雄性鲁尔接头 | 实验室自制，由聚四氟乙烯制成 | ||
| 雄性鲁尔接头转管连接器 | MEDNET | MTLS210-6005 | 替代实验室自制的雄性鲁尔接头 |
| NaCl (5 M) | Thermo Fisher | AM9760G | |
| 无针阀转雄性鲁尔接头 | MEDNET | NVFMLLPC | |
| NIS Elements | Nikon | 成像软件版本 5.02.00 | |
| NOA81 | Thorlabs | NOA81 | 用于管路系统组装的快速固化光学胶 |
| Opti-MEM | Thermo Fisher | 31985062 | |
| PCO edge 4.2 M-USB-HQ-PCO | pco | ||
| 磷酸盐缓冲液 (PBS) | 实验室自制 | ||
| 等离子清洗机 | Diener Femto | Pico-BRS | |
| PLL(20 kDa)-g[3.5]-PEG(2 kDa) | SuSoS AG | ||
| 带微结构的硅晶圆 | 实验室自制 | ||
| Sola 光源引擎 | Lumencor | ||
| sticky slide VI 0.4 | ibidi | 80608 | |
| Sylgard 184 硅橡胶弹性体套件 | Dow Corning | 1673921 | |
| Tango 2 | Märzhäuser | 00-24-626-0000 | |
| 超纯水 | 实验室自制 | ||
| 未包被的盖玻片 | ibidi | 10813 | |
| Injekt-F Solo, 1 mL | Omilab | 9166017V | 带替换活塞 |
参考文献
- Altschuler, S. J., Wu, L. F. Cellular heterogeneity: do differences make a difference. Cell. 141 (4), 559-563 (2010).
- Locke, J. C., Elowitz, M. B. Using movies to analyse gene circuit dynamics in single cells. Nature Reviews Microbiology. 7 (5), 383-392 (2009).....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
