活细胞成像单细胞阵列（LISCA）——一种用于定量细胞动力学的多功能技术

摘要

我们介绍一种利用微图案阵列获取单细胞荧光报告信号时间序列的方法。本方案详细描述了单细胞阵列的制备、活细胞扫描式延时显微镜的设置与操作，以及一个开源图像分析工具，用于对每个黏附位点的细胞整合荧光时间序列进行自动预筛选、可视化质控和追踪分析。

摘要

单细胞阵列活细胞成像（Live-cell Imaging of Single-Cell Arrays, LISCA）是一种高通量获取单个细胞荧光信号时间序列的多功能方法。通常，从培养细胞中获取单细胞时间序列数据受到细胞运动性和细胞形态多样性的限制。黏附性微阵列可标准化单细胞的生长条件，并有助于图像分析。LISCA 将单细胞微阵列与扫描式延时显微镜技术及自动图像处理相结合。本文描述了以 LISCA 格式获取单细胞荧光时间序列的实验步骤。我们将编码增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein, eGFP）的 mRNA 转染至黏附于微图案化阵列上的细胞，并通过扫描式延时显微镜并行监测数百个细胞的 eGFP 表达动力学。图像数据堆由新开发的软件自动处理，该软件通过对选定的细胞轮廓区域积分荧光强度，生成单细胞的荧光时间序列。我们证明，转染 mRNA 后 eGFP 表达的时间过程可被一个简单的动力学翻译模型很好地描述，该模型能够揭示 mRNA 的表达速率和降解速率。本文还讨论了 LISCA 在信号传导与凋亡背景下对多个标记物事件时间相关性分析的进一步应用。

引言

近年来，单细胞实验的重要性日益凸显。单细胞数据可用于研究细胞间的异质性、解析细胞内参数的相关性，并检测在群体测量中难以发现的细胞动力学特征^1,2,3。为了并行研究成千上万个单细胞的细胞动力学，亟需开发新方法，以实现在标准化条件下对细胞进行数小时至数天的持续监测，并随后开展定量数据分析⁴。本文介绍了单细胞阵列活细胞成像技术（Live-cell Imaging of Single-Cell Arrays, LISCA），该技术结合了微结构化阵列、延时显微成像和自动化图像分析方法。

已有多种用于构建微结构化单细胞阵列的方法被建立并发表于文献中^5,6。本文简要介绍微尺度等离子体引发的蛋白质图案化技术（Microscale Plasma-Initiated Protein Patterning, µPIPP）。使用µPIPP制备单细胞阵列的详细实验方案可参见文献⁷。单细胞阵列的应用可使数千个细胞精确排列在标准化的黏附位点上，每个位点为细胞提供明确定义的微环境，从而减少实验变异性的一个来源（图1A）。单细胞阵列可用于监测旨在指示多种细胞过程的荧光标记物的时间动态变化。通过长时间扫描式延时显微成像，可对单细胞阵列的大面积区域进行监测，从而在数小时甚至数天的观察时间内实现高通量的单细胞数据采集。由此可获得阵列各个位置随时间变化的图像序列（图1B）。为了高效地减少海量图像数据，并提取所需的单细胞荧光时间轨迹，需要采用自动化的图像处理方法，充分利用细胞的空间定位信息（图1C）。

LISCA 的挑战在于调整实验方案和计算工具，以建立一种高通量检测方法，从而获得细胞动力学的定量且可重复的数据。本文逐步描述了各个方法及其在 LISCA 检测中的整合方式。作为示例，我们讨论了人工 mRNA 递送后增强型绿色荧光蛋白（eGFP）表达的时间过程。mRNA 递送后的 eGFP 表达可通过描述 mRNA 翻译和降解的反应速率方程进行建模。将 eGFP 浓度时间过程的模型函数拟合到 LISCA 对每个单个细胞随时间变化的荧光强度读数，可得到最佳的模型参数估计值，例如 mRNA 降解速率。作为代表性结果，我们讨论了两种不同脂质转染试剂的 mRNA 递送效率，以及它们的参数分布差异。

图1：LISCA工作流程示意图，结合（A）微图案化单细胞阵列、（B）扫描式延时显微成像和（C）记录图像序列的自动化图像分析。 单细胞阵列由二维排列的细胞黏附性方格构成，其间为抗细胞黏附区域，从而引导细胞在微图案上有序排列，这一点在相位对比图像以及表达eGFP细胞的荧光图像中均可观察到（A）。整个微结构区域通过扫描式延时成像模式，按预设位置序列重复采集图像（B）。记录的图像序列经处理后，可提取每个细胞随时间变化的荧光强度信息（C）。比例尺：500 µm（A），200 µm（C）。 请点击此处查看该图的放大版本。

方案

图2：结合单细胞微阵列（A）与扫描延时显微镜（B）的数据采集流程。 延时实验的准备工作包括：制备具有二维微图形黏附方格的单细胞阵列（1），随后进行细胞接种并使细胞在微图形上排列对齐（2），以及将灌注系统连接至六通道载玻片，从而在延时成像过程中实现液体处理（3）。设置扫描延时实验（4），并在延时实验过程中通过显微镜下的灌注系统注入mRNA脂质复合物溶液，实现细胞转染（5）。比例尺：200 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

1. 微结构单细胞阵列的制备（图2A）

1. 准备用于制备 µPIPP 阵列的材料。
   1. 制备 pH 7.4 的无菌磷酸盐缓冲液（PBS）。
   2. 制备电阻率至少为 18 MΩ·cm（25 °C 时）的无菌超纯水。
   3. 在含有 150 mM NaCl 和 10 mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）的超纯水中，配制浓度为 2 mg/mL 的 PLL(20 kDa)-g[3.5] PEG(2 kDa)（PLL-PEG）工作液。
   4. 配制用于表面包被的细胞外基质蛋白溶液：含 1 mg/mL 纤连蛋白（FN）的 PBS 溶液。
   5. 准备一块通过光刻技术⁸制备微图案的硅片，作为可重复使用的母模。该微图案由边长为 30 µm、深度为 12 µm、间距为 60 µm 的正方形组成，排列成六条条带，每条条带宽 6 mm，高 18 mm。
2. 使用硅弹性体试剂盒将聚二甲基硅氧烷（PDMS）单体与 9% 交联剂（质量百分比）混合，并在真空干燥器中脱气约 30 分钟，直至无气泡。在硅片上浇铸一层约 3–5 mm 厚的 PDMS，再次脱气约 30 分钟，直至无气泡。
   1. 将带有 PDMS 的硅片放入烘箱中，在 50 °C 下固化至少 4 小时。
3. 切割 PDMS 印模。
   1. 使用手术刀从 PDMS 层中切出一个包含六条微图案条带的 PDMS 母模。
   2. 将 PDMS 母模放置在实验台上，使微图案面朝上。
   3. 使用剃刀片将 PDMS 母模上的每条微图案条带分别切割成独立的 PDMS 印模。切割时需切除部分图案区域，确保 PDMS 印模的边缘开放。
4. 将 PDMS 印模放置在六通道载玻片的盖玻片上（图 3-1）。
   1. 使用未包被的盖玻片，通过轻轻刮擦盖玻片上的保护膜来标记六通道载玻片的通道位置。然后将盖玻片放置在实验台上，保护膜面朝下。
   2. 使用镊子将 PDMS 印模以微图案面朝下的方向放置在盖玻片上已标记的通道位置。
   3. 在显微镜下检查 PDMS 印模的附着情况。若 PDMS 印模完全附着于盖玻片，则接触区域的正方形会比间隙区域颜色更深。PDMS 印模与盖玻片的附着对微图案质量至关重要。
5. 将带有六个 PDMS 印模的盖玻片放入等离子清洗仪中，用氧气等离子体处理（压力 0.2 mbar，功率约 40 W，时间 3 分钟），使 PDMS 印模与盖玻片之间的表面变为亲水性（图 3-2）。
6. 在生物安全柜中进行后续所有微图案制备步骤。取 15 µL PLL-PEG 溶液，用移液器在每个 PDMS 印模旁滴加一滴，使 PLL-PEG 溶液被 PDMS 印模的亲水图案吸收（图 3-3）。室温孵育 20 分钟。
7. 用 1 mL 超纯水冲洗带有 PDMS 印模的盖玻片，并用镊子移除 PDMS 印模（图 3-4）。再用 1 mL 超纯水冲洗盖玻片一次，然后使其自然干燥。
8. 待盖玻片完全干燥后，将六通道粘性垫片贴附到盖玻片上（图 3-4）。注意确保微图案区域与各通道底部对齐。
9. 用 FN 功能化黏附正方形区域。
   1. 向每个通道中加入 40 µL PBS。
   2. 在 PBS 中配制浓度为 100 µg/mL 的 FN 溶液。
   3. 向每个通道中加入 40 µL FN 溶液（图 3-5）。通过从一个储液池吸取 40 µL 溶液并注入同一通道的对侧储液池，重复三次，充分混匀 FN 溶液与通道内的 PBS，以形成均一溶液。室温孵育 45 分钟。
   4. 用 120 µL PBS 洗涤每个通道三次（图 3-6）。
10. 为检测图案质量，可在步骤 9.2 中使用荧光标记的 FN（图 4A）。
    ​注：建议在细胞接种前不超过一天内制备 µPIPP 阵列，因为 PLL-PEG 和 FN 并未共价结合于基底，图案质量可能随时间下降。制备好的 µPIPP 阵列应保存在冰箱中。

图3：通过µPIPP技术制备单细胞微阵列。 （1）将表面具有三维微结构的PDMS印章排列在六通道载玻片的盖玻片上。（2）对带有PDMS印章的盖玻片进行氧气等离子体处理，使其表面具有亲水性。（3）加入PLL-PEG，其通过毛细作用被吸入微结构中，并使未被PDMS印章覆盖的区域具有抗细胞黏附性。（4）用去离子水冲洗盖玻片以去除残留的PLL-PEG，随后移除PDMS印章，并将一个六通道粘性载玻片贴合到盖玻片上。（5）加入细胞外基质蛋白纤连蛋白（fibronectin），使未被PLL-PEG覆盖的区域具有促进细胞黏附的特性。（6）用磷酸盐缓冲液（phosphate-buffered saline）清洗六通道载玻片。请点击此处查看该图的放大版本。

2. 细胞接种（图2A）

注意：在以下洗涤步骤中，向一个储液槽中加入相应的液体，然后从通道对侧的储液槽中移除等体积的液体。

1. 用 120 µL 37 °C 的完全添加补充物的细胞培养基洗涤每个通道。在加入细胞悬液前，确保只有通道内充满培养基，而储液池中没有。
2. 按照您常规的细胞传代操作流程，将 HuH7 细胞从细胞培养瓶中消化下来，并将细胞悬液浓度调整至 4 × 10⁵ 个细胞/mL。
3. 向通道中加入 40 µL 细胞悬液，通过从一个储液池中移出 40 µL 并加入同一通道的对侧储液池中，重复此操作 3 次，使细胞悬液与培养基充分混合，以实现均匀的细胞分布（图 4B）。
4. 从通道中移除 40 µL 悬液，使仅通道内充满细胞悬液。
5. 将载片放入培养箱中，在接种后 1 小时使用相差显微镜观察细胞贴壁情况。
6. 加入 120 µL 37 °C 的温热细胞培养基。
7. 将载片重新放回培养箱中继续孵育 3 小时，以促进细胞在微图案上的自组织（图 4C）。

图 4：细胞自组织及 µPIPP 芯片的质量控制。（A）微结构化表面由红色显示的方形纤连蛋白（FN）包被的黏附点组成，周围为抗细胞黏附的聚合物。（B）接种细胞后，HuH7 细胞随机分布，（C）在 4 小时内主要黏附于黏附点上。经许可转载⁷。比例尺：200 µm。请点击此处查看此图的高清版本。

3. 灌注系统（图2A）

注意：仅当需要在延时成像过程中添加试剂或荧光标记物时，才需要使用灌流系统。根据具体需求，可将每个通道连接至独立的灌流系统，或将多个通道串联连接至同一灌流系统。灌流系统的数量应与独立实验条件的数量相对应。在生物安全柜内以无菌条件连接管路，并避免在灌流系统中产生气泡。若不使用灌流系统，则应在延时成像开始前于生物安全柜内加入试剂或标记物。本研究所用灌流系统为自制装置，所用材料列于材料表中。灌流系统的组装方法已有文献报道⁹。

1. 使用1 mL注射器（带替换的sporn）并吸入1 mL 37 °C的细胞培养基。
2. 通过阀门将注射器连接到进液管，并用培养基填充该管路。
3. 将进液管连接至某一通道的储液端，确保无气泡残留。
4. 若需将另一通道以串联方式接入该灌流系统，请将串联连接器连接至当前通道进液管对侧的储液端。接着进入下一个通道，并将串联连接器的自由端连接至该通道的其中一个储液端。
5. 重复上述步骤，直至完成所需数量的通道串联连接。
6. 将出液管直接连接至当前通道的自由储液端。用培养基填充已连接的管路，以检查灌流系统是否泄漏。
7. 重复前述步骤，直至载片上的全部六个通道均连接至灌流系统。
8. 将连接好灌流系统的载片放回培养箱备用，或直接置于已预热至37 °C的显微镜加热腔内，进行活细胞延时成像。

4. 时间序列显微镜（图2B）

注意：进行长期测量时，应维持 37 °C 的稳定温度和稳定的 CO₂ 水平。作为无需 CO₂ 依赖的细胞培养基的替代方案，可使用 L15 培养基，该培养基不需要气体培养系统。

注意：进行定量成像时，在延时成像测量期间应使用不含酚红的细胞培养基以减少背景荧光，并且技术重复实验应采用相同的延时成像程序设置以及相同的显微镜。

1. 使用10倍物镜和适当的荧光滤光片，设置延时摄影方案，以记录相差图像和荧光图像，荧光曝光时间为750 ms（根据相机型号而定），连续扫描位置列表的时间间隔为10分钟，总观察时间为30小时。
2. 将带有细胞单细胞阵列的六通道载玻片放入37 °C恒温加热腔的样品架中。若六通道载玻片连接灌流系统，请用胶带将管路固定在载物台上，以确保液体交换过程中六通道载玻片不会移动。将出口管的自由端穿过一个15 mL离心管的孔洞，以收集废液。
3. 设置扫描延时成像的位置列表。确保在设定的连续循环时间间隔内能够完成所有位置的扫描。使用10倍物镜时，根据相机芯片尺寸，每个通道可设置10至30个位置，以覆盖整个微图案区域。
4. 启动延时成像测量。为获得长期测量更佳的图像质量，建议使用自动对焦校正系统。

5. 荧光标记——mRNA 转染（图 2B）

注意：对于通过管路系统连接的两个通道的转染，需要总共 600 µL 转染混合液（每个通道 300 µL）。所指示的体积适用于两个相连通道的转染。

1. 将1 µL转染试剂溶于200 µL低血清培养基中，配制转染试剂溶液，并在室温下孵育5分钟。
2. 将编码eGFP的300 ng mRNA溶于150 µL低血清培养基中，配制mRNA溶液。
3. 将150 µL转染试剂溶液加入mRNA溶液中，混匀，配制转染混合液。室温孵育20分钟。
4. 在转染混合液孵育期间，使用注射器以1 mL 37 °C预热的PBS冲洗管路系统。冲洗时确保显微镜载物台不发生移动。必要时暂停延时成像测量。
5. 加入300 µL低血清培养基，将转染混合液稀释至最终mRNA浓度为0.5 ng/µL。
6. 使用注射器将转染混合液注入管路系统，使mRNA脂复合物孵育1小时（必要时暂停延时成像测量）。
7. 终止转染孵育，使用注射器以1 mL 37 °C预热的完全添加补剂的细胞生长培养基冲洗，去除未结合的mRNA脂复合物（必要时暂停延时成像测量）。

6. 图像分析与荧光检测

1. 首次运行图像分析时，根据引用位置¹⁰提供的说明，安装开源软件“Python自动显微结构分析”（PyAMA）的 0.1.6 版本。
2. 确保图像通道（相差与荧光）以多图像 16 位 TIFF 文件格式提供。如有必要，相应地进行格式转换。
3. 启动 PyAMA，点击 打开堆栈… 以打开用于分析的图像。
4. 对于每个要打开的多图像 TIFF 文件，点击 打开 并选择文件，使其显示在对话框左侧已加载文件列表中（图 5-1）。
5. 标记要包含在分析中的通道。对每个通道执行以下步骤：
   1. 在已加载文件列表中选择包含该通道的 TIFF 文件。
   2. 在 添加新通道 区域中，选择该通道在 TIFF 文件中的索引。索引从零开始；第一个通道索引为 0，第二个通道索引为 1，依此类推。
   3. 选择通道类型。对于相应的图像通道，选择 相差 或 荧光；对于指示细胞轮廓的二值通道，选择 分割。
   4. 可选：输入通道标签以区分不同的荧光通道，例如：eGFP 和 DAPI。
   5. 配置完通道后，点击 添加。
6. 当所有已添加的通道均显示在对话框右侧的通道列表中后，点击 确定 以加载图像堆栈。
7. 若要使用 PyAMA 内置的基于相差图像的细胞识别分割算法进行分割（图 5-2），请转至 工具 | 二值化…，并输入用于保存二值化通道的 NumPy 文件的文件名。
   注意：在当前版本中，加载二值化通道需要重新加载所有通道。
8. 若要对荧光通道进行背景校正¹¹（图 5-3），请确保已加载荧光通道和一个分割通道。若未加载分割通道，请确保已加载相差通道以进行自动分割。转至“工具 > 背景校正…”，并为校正后的荧光通道指定输出 TIFF 文件的文件名。
   注意：在当前版本中，加载背景校正后的通道需要重新加载所有通道。
9. 通过滚动时间帧、查看左侧通道菜单中列出的通道，并点击细胞以高亮其荧光时间轨迹（图 1C），检查预选的细胞（图 5-4）及其积分荧光信号（图 5-5）。利用细胞选择功能，排除非活性、未局限于黏附位点或与其他细胞粘连的细胞，使其不参与后续分析。按住 Shift 键并点击细胞，或选中细胞后按 Enter 键，可切换其是否纳入读数。
10. 点击 文件 | 保存，选择保存目录，以保存单细胞的细胞面积和积分荧光时间轨迹数据（图 5-6）。

图 5：使用 PyAMA 对延时图像序列进行自动图像处理。 （1）导入每个成像位置的相差图像和荧光图像序列。（2）通过对相差图像堆栈进行分割确定细胞轮廓。（3）对荧光图像进行背景校正。（4）随时间追踪细胞轮廓，并预选用于导出。（5）基于追踪得到的细胞轮廓对荧光强度进行积分。（6）分析单个细胞的面积和积分荧光强度，并导出每个细胞的时间过程数据。比例尺：100 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

1. 为分析 mRNA 转染后的翻译动力学，根据 Reiser 等人先前描述的基于生物化学速率方程的翻译模型，对每个单细胞时间序列进行拟合¹²。该研究所用的数据和代码已公开提供¹³。
2. 针对每个单细胞时间序列，提取翻译模型拟合所得的参数估计值，这些参数代表 mRNA 降解速率以及翻译起始的时间点。代表性结果部分将讨论一个示例数据集。
3. 对不同实验条件下参数最佳估计值的分布进行进一步分析，以研究细胞群体内细胞间的变异性。

结果

LISCA 方法能够高效地采集单个细胞的荧光时间序列。作为代表性示例，我们概述了如何应用 LISCA 方法测量转染后单细胞中 eGFP 的表达。LISCA 实验的数据可用于评估 mRNA 递送动力学，这对于高效 mRNA 药物的开发具有重要意义。

我们特别展示了两种基于脂质的mRNA递送系统在翻译起始时间点和单细胞水平表达速率方面的不同影响。我们将细胞进行培养，并将细胞群体分为两部分：其中一部分使用脂质复合物（lipoplexes）进行转染，具体操作如方案部分所述；另一部分则使用相同mRNA、相同终浓度的mRNA，但以脂质纳米颗粒（LNP）作为递送系统进行转染，该LNP通过微流控混合技术制备¹²。由于脂质复合物与LNP在脂质组成及制备方法上的差异，我们预期其翻译动力学会受到影响，因为细胞摄取动力学可能因此改变。利用LISCA方法，我们量化了转染后翻译起始的时间点t₀，以及细胞表达eGFP的强度，后者取决于转染进入细胞的mRNA分子数m₀与翻译速率k...

讨论

本文介绍了LISCA作为一种多功能技术，可用于在单细胞水平上追踪细胞内荧光标记物的细胞动力学。为了成功实施LISCA实验，必须首先分别建立方案部分所述的每一个步骤，然后将所有步骤整合起来。LISCA的三个主要方面各自包含关键步骤。

单细胞微阵列的制备
微阵列的质量至关重要，因为细胞在微阵列上的排列不仅影响后续所有实验步骤，还直接影响数据质量。因此，图案的几何形状和制备方法必须根据所使用的细胞类型进行优化。本文讨论的代表性结果是使用肝癌细胞系HuH7在(30 µm)²的方形图案上排列获得的。该图案几何结构也适用于其他细胞系，如A549或HEK293。对于体积较大的细胞，例如BEAS-2B，可采用边长为35 µm、方格间距为80 µm的较大方形图案。所述接种程序已针对HuH7细胞优化，但也可适用于多种其他贴壁细胞¹⁷。例如，某些细胞系需要不同尺寸的黏附点，或需要更大的黏附点间距，以避免因细胞伸长而导致的细胞间接触。

微图案应调整至黏...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Adtech Polymer Engineering PTFE 微管	Fisher Scientific	10178071
烘箱	Binder	9010-0190
CFI Plan Fluor DL 10x	Nikon	MRH20100
干燥器	Roth	NX07.1
Eclipse Ti-E	Nikon
eGFP mRNA	Trilink	L-7601
雌性鲁尔接头转管连接器	MEDNET	FTL210-6005
胎牛血清	Thermo Fisher	10270106
纤连蛋白	Yo Proteins	663
eGFP滤光片组	AHF	F46-002
Fisherbrand 透明铂金固化硅胶管	Fisher Scientific	11768088
HEPES (1 M)	Thermo Fisher	15630080
培养箱	Okolab	OKO-H201
培养箱	Binder	9040-0012
不含酚红的L-15培养基	Thermo Fisher	21083027
Lipofectamine 2000	Thermo Fisher	11668027
雄性鲁尔接头			实验室自制，由聚四氟乙烯制成
雄性鲁尔接头转管连接器	MEDNET	MTLS210-6005	替代实验室自制的雄性鲁尔接头
NaCl (5 M)	Thermo Fisher	AM9760G
无针阀转雄性鲁尔接头	MEDNET	NVFMLLPC
NIS Elements	Nikon		成像软件版本 5.02.00
NOA81	Thorlabs	NOA81	用于管路系统组装的快速固化光学胶
Opti-MEM	Thermo Fisher	31985062
PCO edge 4.2 M-USB-HQ-PCO	pco
磷酸盐缓冲液 (PBS)			实验室自制
等离子清洗机	Diener Femto	Pico-BRS
PLL(20 kDa)-g[3.5]-PEG(2 kDa)	SuSoS AG
带微结构的硅晶圆			实验室自制
Sola 光源引擎	Lumencor
sticky slide VI 0.4	ibidi	80608
Sylgard 184 硅橡胶弹性体套件	Dow Corning	1673921
Tango 2	Märzhäuser	00-24-626-0000
超纯水			实验室自制
未包被的盖玻片	ibidi	10813
Injekt-F Solo, 1 mL	Omilab	9166017V	带替换活塞