本文介绍了一种分离斑马鱼卵巢卵泡中滤泡细胞与卵母细胞的简便方法，该方法将有助于开展斑马鱼卵巢发育的相关研究。
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摘要
摘要
斑马鱼已成为研究脊椎动物卵巢发育的理想模型。卵泡是卵巢的基本单位，由卵母细胞及其周围的滤泡细胞组成。为了开展多种研究，例如滤泡细胞的原代培养、基因表达分析、卵母细胞成熟以及体外受精等，分离滤泡细胞和卵母细胞至关重要。传统方法使用镊子进行分离，操作繁琐、耗时较长，且容易对卵母细胞造成损伤。本文建立了一种利用拉制玻璃毛细管分离上述两种成分的简便方法。在体视显微镜下，通过使用拉制的细玻璃毛细管（其直径根据卵泡大小而定）反复吹打，即可轻松分离卵母细胞与滤泡细胞。与传统方法相比，该新方法在分离卵母细胞和滤泡细胞方面效率更高，且对卵母细胞的损伤更小。更重要的是，该方法适用于包括卵黄发生前期在内的早期卵泡阶段。因此，这一简便方法可用于斑马鱼滤泡细胞与卵母细胞的分离。
引言
斑马鱼是研究脊椎动物发育和生理学的重要模式生物。斑马鱼可作为研究卵巢发育分子机制的良好模型。1,2,3从鱼类到哺乳动物的卵巢发育过程中，许多特征在进化上高度保守1,2与其他脊椎动物相似，成年斑马鱼具有不同步的卵巢，其中包含处于所有发育阶段的卵泡。4卵泡是卵巢的基本生殖单位。卵泡由卵母细胞及其周围一层或多层体细胞（称为卵泡细胞）构成。卵泡的发育依赖于卵母细胞与卵泡细胞之间的双向通讯。5将卵泡细胞和卵母细胞从卵巢卵泡中分离出来对于多种研究目的至关重要，例如卵泡细胞的原代培养、基因表达分析、卵母细胞成熟等 体外 受精
传统的分离方法包括使用镊子进行机械分离以及酶消化法6,7,8,9,10。然而，镊子机械分离法耗时且费力，并且在分离过程中容易对卵母细胞造成较大损伤。尽管酶消化法操作简便、所需时间短，但需要优化处理时间和酶浓度，且所获得的分离卵母细胞完整性和存活率并不理想。因此，我们建立了一种利用拉制玻璃毛细管分离不同发育阶段两种组分的简便方法。
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方案
所有鱼类实验操作均符合西北师范大学动物实验伦理委员会的规定。
1. 准备工作
- 动物
- 使用体长为 4-6 cm 的成年雌性斑马鱼。
注：我们使用的斑马鱼来自当地市场。 - 将斑马鱼饲养在循环水系统中，光照周期为 14 小时光照和 10 小时黑暗，温度约为 28 °C。
- 每天喂食两次新孵化的卤虫幼虫。
- 使用体长为 4-6 cm 的成年雌性斑马鱼。
- 拉制玻璃毛细管
- 取一根 15 cm 的玻璃毛细管，将其头部置于酒精灯火焰中加热。用手握住毛细管的一端，另一端用镊子夹住。
- 加热 5-10 秒后，玻璃在酒精灯火焰中变红并软化。用镊子拉伸毛细管头部，以获得所需直径的开口。
注：开口直径取决于卵泡的大小：初级卵泡（PV；直径约 0.30 mm）、早期卵黄发生期（EV；直径约 0.40 mm）、中期卵黄发生期（MV；直径约 0.50 mm）、晚期卵黄发生期（LV；直径约 0.60 mm）以及完全生长但未成熟期（FG；直径约 0.65 mm）。 - 将玻璃毛细管开口拉至适当直径，略小于分离卵泡的尺寸。若毛细管开口远大于卵巢卵泡，则无法有效分离；若开口过小，则在分离过程中会破坏卵泡。需多次练习拉制玻璃毛细管。
注：加热时间取决于玻璃毛细管的尺寸。切勿在酒精灯火焰上直接拉伸毛细管，否则会导致毛细管断裂。 - 使用安瓿瓶切割器切割玻璃毛细管，并用镊子折断以获得平滑切口。
注：尖锐或破损的毛细管开口会损伤卵泡。 - 使用一段 30 cm 的塑料管，一端连接带有滤芯的 1 mL 移液枪头，另一端将拉制好的玻璃毛细管插入移液枪头末端，并在另一端连接 200 µL 移液枪头。
2. 分离不同发育阶段的斑马鱼卵母细胞和滤泡细胞
- 斑马鱼卵巢的解剖
- 将冰桶装至4/5满的冰浆，并加入足够的鱼水，使冰浆悬浮。等待2-5分钟，检测水温，确保温度在2-4 °C之间。
- 将成年雌鱼放入冰水中麻醉至少2-5分钟，直至鳃部运动停止。使用锋利的剪刀切断脊髓以去头，确保鱼类死亡。
- 用镊子将鱼体置于解剖板上。
- 使用解剖剪进行如下切割：沿腹部中线从泄殖腔向鳃部剪开；从泄殖腔后方剪开；从前端尖端剪向背部。轻轻移除身体一侧的皮肤和肌肉。暴露内脏器官，并用镊子取出整个卵巢。
- 立即将卵巢轻柔地放入含有60% Leibovitz's L-15（L-15）培养基的100 mm培养皿中。
- 卵巢卵泡的分离
注意：我们采用的分期系统基于Selman等人的原始定义4。- 使用精细镊子手动分离不同发育阶段的卵泡，方法如前所述8。
- 将卵巢卵泡分为以下阶段：PV、EV、MV、LV和FG阶段。
- 从卵巢卵泡中分离滤泡细胞与卵母细胞
- 将处于不同发育阶段的卵巢卵泡放入含有60% L-15培养基的洁净培养皿中。
- 使用步骤1.2中拉制的玻璃毛细管，将卵泡吸入毛细管内2-3 cm，然后吹出。
注意：当玻璃毛细管的开口直径适当时，通过一次吸入即可将卵泡与卵母细胞分离。- 若滤泡细胞层与卵母细胞结合紧密，可重复吸入-吹出2-3次以完成完全分离。避免多次强行将卵泡通过过小的毛细管，以免损伤卵泡。
注意：在吸入和吹出过程中，滤泡层脱落并从卵母细胞上分离，最终实现滤泡细胞与去滤泡细胞的卵母细胞的分离（图1）。
- 若滤泡细胞层与卵母细胞结合紧密，可重复吸入-吹出2-3次以完成完全分离。避免多次强行将卵泡通过过小的毛细管，以免损伤卵泡。
- 收集去滤泡细胞但结构完整的卵母细胞，并获取存活的去滤泡细胞卵母细胞用于后续实验。
- 为验证滤泡细胞是否已从完整卵泡中分离，使用4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）对完整卵泡和分离的卵母细胞进行染色。
- 在室温（RT）下用4%缓冲型多聚甲醛固定样本1小时，随后用PBS多次洗涤。
- 在室温下用DAPI染色30分钟，再用PBS多次洗涤。使用荧光显微镜（例如Leica DFC7000 T）观察并拍照。
- 为确认分离完全，将完整卵泡和分离的卵母细胞在4 °C条件下用4%缓冲型多聚甲醛固定过夜，并在-25 °C下包埋于组织冷冻介质（例如Leica）中。
- 使用切片机对固定组织进行切片，并将切片贴附于载玻片上。
- 用PBS洗涤切片，并用DAPI显示细胞核。在荧光显微镜下观察并拍照。
3. 体外成熟（IVM）与体外受精（IVF）
注意：体外受精的卵母细胞体外成熟（IVM）操作步骤参照先前描述的方法并稍作修改11,12,13。
- 在解剖成年雌性斑马鱼卵巢之前，制备新鲜的成熟培养基（+DHP 培养基）。制备新鲜成熟培养基时，向 15 mL 圆锥形离心管中加入 9 mL Leibovitz's L-15 培养基（pH 9.0），加入 10 µL 17α-20β-二羟基-4-孕烯-3-酮（DHP）（5 mg/mL），再加入 490 µL dH₂O。2O，以及500 µL的10%牛血清白蛋白（BSA）。
- 提前配制 Hank's 溶液和 E3 溶液。Hanks' 溶液的配制方法参照 Baars 等人的描述。14. 配制 E3 培养基：5 mM NaCl、0.17 mM KCl、0.33 mM CaCl₂、0.33 mM MgSO₄。2，0.33 mM MgSO₄4，以及1-5%亚甲蓝。
- 按照第2步中的方法进行斑马鱼卵巢的解剖及卵泡的分离。
- 收集完全成熟的卵泡并用作未成熟卵母细胞。每条成年雌性斑马鱼可分离出至少150–200个完全成熟的卵泡。选择完整且健康的卵泡用于体外成熟（IVM）。
- 将完全成熟的卵泡置于含+DHP的培养基中，放入12孔板内孵育，定期观察以确保卵母细胞保持完整。若发现破裂的卵母细胞，用巴斯德吸管及时移除。
注意：在卵母细胞成熟过程中，卵母细胞会逐渐变得透明。经DHP处理2小时后，大部分卵母细胞变为透明，可在解剖显微镜下利用透射光光学系统观察到这一现象。 - 按照第2.3步所述，去除每个成熟卵母细胞最外层的卵泡细胞。
- 将去核卵母细胞转移至含有数滴培养液的培养皿中，随后进行受精。
- 使用至少三只雄性个体的睾丸在500 µL Hanks'溶液中制备新鲜精子溶液。将精子溶液置于冰上，其受精能力可保持2-3小时。
- 加入100 µL精子溶液至去核卵母细胞 & 成熟卵母细胞置于培养皿中。将精子溶液轻轻加入卵子中，用移液器吸头轻柔吹打混匀精子与卵子。
- 立即加入1 mL E3培养基溶液以激活卵子，并再次使用移液器吸头轻轻吹打混合卵子和精子。
- 受精后约1分钟，用E3培养基溶液淹没培养皿。在受精后10至15分钟内可观察到卵膜完全扩张。
- 在35-45 mpf期间，挑选正在进行对称卵裂并进入2细胞期的胚胎，这些胚胎已受精。移除未发生细胞卵裂的胚胎。
- 将胚胎置于培养皿中，在28 °C下发育，每10 cm培养皿中胚胎数量不超过80个。观察并拍摄胚胎发育过程。
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结果
该方法可用于分离斑马鱼卵巢卵泡不同发育阶段的卵泡细胞和卵母细胞。图1展示了使用毛细玻璃管从斑马鱼卵巢卵泡中分离卵母细胞和卵泡细胞的过程（图1）。为了检测卵泡细胞是否从完整卵泡中被成功分离，将从初级卵黄（PV）阶段到终末生长（FG）阶段的不同发育阶段的完整卵泡和分离后的卵母细胞用DAPI（50 µg/mL）在37 °C下染色30分钟。DAPI可对卵泡细胞的细胞核进行染色。在完整卵泡中可观察到DAPI的蓝色信号，而在去除了卵泡细胞的卵母细胞中则无此信号（图2）。这表明该方法能够有效地将卵母细胞与卵泡细胞完全分离。为进一步确认分离效果，将完整卵泡和分离后的卵母细胞制成组织切片。DAPI染色结果显示，在去除了卵泡细胞的卵母细胞中，卵泡细胞被明显清除（图3）。以上结果表明，该方法可用于分离斑马鱼不同发育阶段卵泡中的卵泡细胞与卵母细胞。
该方法可用于研究斑马...
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讨论
本文介绍一种从斑马鱼卵巢滤泡中简单快速分离滤泡细胞和卵母细胞的新方法。该方法相较于传统方法具有多项优势。其中最主要的优势是分离操作极为简便，且效率和效果显著提高，仅需一次外部操作即可完成。这一点使得该方法更适用于不擅长显微解剖的研究人员。根据我们的经验，使用玻璃毛细管可在5-10秒内成功分离出完全成熟阶段滤泡的滤泡细胞和卵母细胞；而使用镊子分离则至少需要30-60秒。更重要的是，通常使用玻璃毛细管分离得到的去滤泡细胞卵母细胞中，至少有20%能够发生自发性卵母细胞成熟；相比之下，使用镊子分离的卵母细胞中，发生自发性成熟的不到1%。因此，采用玻璃毛细管的新方法在效率和有效性方面均优于既往建立的镊子分离法。其次，该方法还可用于分离早期发育阶段（如PV、EV和MV阶段）卵巢滤泡中的滤泡细胞与卵母细胞，而现有技术方法无法实现早期阶段滤泡的有效分离。
该方法也存在一些局限性。例如，玻璃毛细管开口的合适直径对于本方法中卵泡细胞与卵母细胞的分离至关重要。若开口远大于或小于卵巢卵泡的尺寸，均会导致分离失败。因此，应根据卵巢卵泡的大小调整玻璃毛细管的开口直径，这需要一定的操作经验。
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究工作得到国家自然科学基金［32060170、31601205 和 31560334］、中国国家留学基金委资助的访问学者项目以及淡水生态与生物技术国家重点实验室基金［2020FB05］的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 17α,20β-DHP | 凯恩公司 | 16146-5 (5 mg) | |
| 24孔板 | 康宁公司 | 3524 | |
| 安瓿瓶切割器 | AS ONE | 5-124-22 1袋（100个） | |
| 无水Na2HPO4 | 凯信化学 | 500 g | |
| 卤虫卵 | 宏杰公司 | 250 g | |
| CaCl2 | 北辰方正 | 500 g | |
| 培养皿 | 百奥锐 | BS-90-D (10个/包) | |
| DAPI | 索莱宝 | S2110 (25mL) | |
| 解剖显微镜 | 蔡司 | Stemi 305 | |
| 解剖镊 | VETUS | HRC30 | |
| 解剖剪 | 科辅 | 160 mm | |
| 荧光体视显微镜 | 徕卡 | M205C | |
| 玻璃毛细管 | 岩城 | IK-PAS-5P (200支/包) | |
| Hoechst 33342 | 索莱宝 | C0031 (1 mg) | |
| KCl | 北辰方正 | 500 g | |
| KH2PO4 | 凯信化学 | 500 g | |
| Leibovitz’s L-15 培养基 | 吉布科 | 41300-039 (10×1L) | |
| MgSO4•7H2O | 北辰方正 | 500 g | |
| 微量移液器吸头 | Axygen | MCT-150-C | |
| NaCl | 北辰方正 | 500 g | |
| NaHCO3 | 北辰方正 | 500 g | |
| 青霉素-链霉素溶液 | 吉布科 | #15140122 (100 mL) | |
| 体视显微镜 | 蔡司 | Discover.v20 |
参考文献
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