本文介绍了一种分离斑马鱼卵巢卵泡中滤泡细胞与卵母细胞的简便方法，该方法将有助于开展斑马鱼卵巢发育的相关研究。
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本文内容
摘要
摘要
斑马鱼已成为研究脊椎动物卵巢发育的理想模型。卵泡是卵巢的基本单位，由卵母细胞及其周围的滤泡细胞组成。为了开展多种研究，例如滤泡细胞的原代培养、基因表达分析、卵母细胞成熟以及体外受精等，分离滤泡细胞和卵母细胞至关重要。传统方法使用镊子进行分离，操作繁琐、耗时较长，且容易对卵母细胞造成损伤。本文建立了一种利用拉制玻璃毛细管分离上述两种成分的简便方法。在体视显微镜下，通过使用拉制的细玻璃毛细管（其直径根据卵泡大小而定）反复吹打，即可轻松分离卵母细胞与滤泡细胞。与传统方法相比，该新方法在分离卵母细胞和滤泡细胞方面效率更高，且对卵母细胞的损伤更小。更重要的是，该方法适用于包括卵黄发生前期在内的早期卵泡阶段。因此，这一简便方法可用于斑马鱼滤泡细胞与卵母细胞的分离。
引言
斑马鱼是研究脊椎动物发育和生理学的重要模式生物。斑马鱼可作为研究卵巢发育分子机制的良好模型。1,2,3从鱼类到哺乳动物的卵巢发育过程中，许多特征在进化上高度保守1,2与其他脊椎动物相似，成年斑马鱼具有不同步的卵巢，其中包含处于所有发育阶段的卵泡。4卵泡是卵巢的基本生殖单位。卵泡由卵母细胞及其周围一层或多层体细胞（称为卵泡细胞）构成。卵泡的发育依赖于卵母细胞与卵泡细胞之间的双向通讯。5将卵泡细胞和卵母细胞从卵巢卵泡中分离出来对于多种研究目的至关重要，例如卵泡细胞的原代培养、基因表达分析、卵母细胞成熟等 体外 受精
传统的分离方法包括使用镊子进行机械分离以及酶消化法6,7,8,9,
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方案
所有鱼类实验操作均符合西北师范大学动物实验伦理委员会的规定。
1. 准备工作
- 动物
- 使用体长为 4-6 cm 的成年雌性斑马鱼。
注：我们使用的斑马鱼来自当地市场。 - 将斑马鱼饲养在循环水系统中，光照周期为 14 小时光照和 10 小时黑暗，温度约为 28 °C。
- 每天喂食两次新孵化的卤虫幼虫。
- 使用体长为 4-6 cm 的成年雌性斑马鱼。
- 拉制玻璃毛细管
- 取一根 15 cm 的玻璃毛细管，将其头部置于酒精灯火焰中加热。用手握住毛细管的一端，另一端用镊子夹住。
- 加热 5-10 秒后，玻璃在酒精灯火焰中变红并软化。用镊子拉伸毛细管头部，以获得所需直径的开口。
注：开口直径取决于卵泡的大小：初级卵泡（PV；直径约 0.30 mm）、早期卵黄发生期（EV；直径约 0.40 mm）、中期卵黄发生期（MV；直径约 0.50 mm）、晚期卵黄发生期（LV；直径约 0.60 mm）以及完全生长但未成熟期（FG；直径约 0.65 mm）。 - 将玻璃毛细管开口拉至适当直径，略小于分离卵泡的尺寸。若毛细管开口远大于卵巢卵泡，则无法有效分离；若开口过小，则在分离过程中会破坏卵泡。需多次练习拉制玻璃毛细管。
注：加热时间取决于玻璃毛细管的尺寸。切勿在酒精灯火焰上直接拉伸毛细管，否则会导致毛细管断裂....
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结果
该方法可用于分离斑马鱼卵巢卵泡不同发育阶段的卵泡细胞和卵母细胞。图1展示了使用毛细玻璃管从斑马鱼卵巢卵泡中分离卵母细胞和卵泡细胞的过程（图1）。为了检测卵泡细胞是否从完整卵泡中被成功分离，将从初级卵黄（PV）阶段到终末生长（FG）阶段的不同发育阶段的完整卵泡和分离后的卵母细胞用DAPI（50 µg/mL）在37 °C下染色30分钟。DAPI可对卵泡细胞的细胞核进行染色。在完整卵泡中可观察到DAPI的蓝色信号，而在去除了卵泡细胞的卵母细胞中则无此信号（图2）。这表明该方法能够有效地将卵母细胞与卵泡细胞完全分离。为进一步确认分离效果，将完整卵泡和分离后的卵母细胞制成组织切片。DAPI染色结果显示，在去除了卵泡细胞的卵母细胞中，卵泡细胞被明显清除（图3）。以上结果表明，该方法可用于分离斑马鱼不同发育阶段卵泡中的卵泡细胞与卵母细胞。
该方法可用于研究斑马.......
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讨论
本文介绍一种从斑马鱼卵巢滤泡中简单快速分离滤泡细胞和卵母细胞的新方法。该方法相较于传统方法具有多项优势。其中最主要的优势是分离操作极为简便，且效率和效果显著提高，仅需一次外部操作即可完成。这一点使得该方法更适用于不擅长显微解剖的研究人员。根据我们的经验，使用玻璃毛细管可在5-10秒内成功分离出完全成熟阶段滤泡的滤泡细胞和卵母细胞；而使用镊子分离则至少需要30-60秒。更重要的是，通常使用玻璃毛细管分离得到的去滤泡细胞卵母细胞中，至少有20%能够发生自发性卵母细胞成熟；相比之下，使用镊子分离的卵母细胞中，发生自发性成熟的不到1%。因此，采用玻璃毛细管的新方法在效率和有效性方面均优于既往建立的镊子分离法。其次，该方法还可用于分离早期发育阶段（如PV、EV和MV阶段）卵巢滤泡中的滤泡细胞与卵母细胞，而现有技术方法无法实现早期阶段滤泡的有效分离。
该方法也存在一些局限性。例如，玻璃毛细管开口的合适直径对于本方法中卵泡细胞与卵母细胞的分离至关重要。若开口远大于或小于卵巢卵泡的尺寸，均会导致分离失败。因此，应根据卵巢卵泡的大小调整玻璃毛细管的开口直径，这需要一定的操作经验。
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究工作得到国家自然科学基金［32060170、31601205 和 31560334］、中国国家留学基金委资助的访问学者项目以及淡水生态与生物技术国家重点实验室基金［2020FB05］的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 17α,20β-DHP | 凯恩公司 | 16146-5 (5 mg) | |
| 24孔板 | 康宁公司 | 3524 | |
| 安瓿瓶切割器 | AS ONE | 5-124-22 1袋（100个） | |
| 无水Na2HPO4 | 凯信化学 | 500 g | |
| 卤虫卵 | 宏杰公司 | 250 g | |
| CaCl2 | 北辰方正 | 500 g | |
| 培养皿 | 百奥锐 | BS-90-D (10个/包) | |
| DAPI | 索莱宝 | S2110 (25mL) | |
| 解剖显微镜 | 蔡司 | Stemi 305 | |
| 解剖镊 | VETUS | HRC30 | |
| 解剖剪 | 科辅 | 160 mm | |
| 荧光体视显微镜 | 徕卡 | M205C | |
| 玻璃毛细管 | 岩城 | IK-PAS-5P (200支/包) | |
| Hoechst 33342 | 索莱宝 | C0031 (1 mg) | |
| KCl | 北辰方正 | 500 g | |
| KH2PO4 | 凯信化学 | 500 g | |
| Leibovitz’s L-15 培养基 | 吉布科 | 41300-039 (10×1L) | |
| MgSO4•7H2O | 北辰方正 | 500 g | |
| 微量移液器吸头 | Axygen | MCT-150-C | |
| NaCl | 北辰方正 | 500 g | |
| NaHCO3 | 北辰方正 | 500 g | |
| 青霉素-链霉素溶液 | 吉布科 | #15140122 (100 mL) | |
| 体视显微镜 | 蔡司 | Discover.v20 |
参考文献
- Clelland, E., Peng, C. Endocrine/paracrine control of zebrafish development. Molecular and Cellular Endocrinology. 312, 42-52 (2009).
- Ge, W. Intrafollicular paracr....
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