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方法文章

荧光泄漏实验用于研究穿膜肽对膜稳定性的破坏

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DOI：

10.3791/62028

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2020年12月19日

 ,  ,  ,  , 
1PHYMEDEXP, INSERM U1046 - CNRS UMR 9214 - University of Montpellier

本文内容

摘要

荧光泄漏实验是一种简单的方法，可用于研究肽与膜之间的相互作用，以了解其在多种生物过程中的作用，特别是细胞穿透肽在直接跨细胞转位过程中扰动磷脂双分子层的能力。

摘要

细胞穿膜肽（CPPs）是指能够穿过质膜并将货物分子转运入细胞的载体。实现这一功能所需的主要共同特征之一源于CPPs与质膜（脂质）以及更特异地与膜自身细胞外基质组分（硫酸乙酰肝素）之间的相互作用。事实上，无论通过直接转位还是内吞依赖性内化途径，脂质双分子层均参与了内化过程，这不仅发生在质膜水平，也涉及细胞内运输过程（如内体囊泡）。本文提供了一项详细实验方案，描述了大单层囊泡（LUVs）的制备、纯化、表征及其在荧光泄漏实验中的应用，以检测CPP与膜之间可能发生的去稳定作用或相互作用，并探讨其在内化机制中的作用。通过构建脂质组成模拟质膜的LUVs，包封荧光染料和淬灭剂。将肽段加入囊泡外环境后，肽与LUV膜的相互作用可能以剂量依赖的方式诱导荧光显著增强，从而反映内容物的泄漏。本文以近期开发的富含色氨酸（W）和精氨酸（R）的两亲性肽（WRAPs）为例进行说明，该类肽在多种细胞系中表现出快速且高效的siRNA递送能力。最后，本文讨论了这些相互作用的本质及其对脂质的亲和力，以期深入理解并优化膜转位及/或内体逃逸过程。

引言

20世纪90年代被发现后，细胞穿透肽（CPPs）被开发用于促进货物分子通过质膜实现高效的细胞内递送1,2。CPPs通常是短肽，一般由8至30个氨基酸组成，来源多样。它们最初被定义为"直接转位"载体，意指其能够独立于任何内吞途径、无需能量供应或受体参与，直接穿过质膜并将货物分子转运入细胞。然而，后续研究表明，这些早期观察结果主要源于实验伪影或使用甲醇固定所导致的荧光信号高估3。目前普遍认为，CPP的摄取机制既包括内吞作用，也包括非能量依赖性的转位过程4,5,6,7，具体途径取决于多种参数，如货物的性质、CPP与货物之间的连接方式、所研究的细胞系等。

CPP 可根据两种策略用作转染试剂：一种是 CPP 与其货物之间通过化学键（共价策略）连接，另一种是通过静电作用/疏水相互作用（非共价策略）8,9,10,11。尽管这两种策略在多种货物的细胞递送中均显示出有效性，但 CPP 内化机制的理解仍存在争议，内吞途径与直接穿透之间的平衡仍难以衡量12,13。虽然已有若干实验工具和策略可明确用于研究内吞过程的参与，但直接转位的表征似乎更为困难，因其涉及与质膜组分之间更细微的相互作用。生物膜通常由多种组分构成，从磷脂到膜蛋白不等，其组成可能随细胞类型和/或环境（如应激条件、细胞分裂等）而变化。这种组成的多样性，以及随之而来的缺乏通用的细胞膜模型，使得相关研究无法采用单一方法进行。然而，为克服这些局限性，研究人员逐步发展了使用人工膜或膜提取物的研究方法。从小型单层囊泡到单分子层模型，每种模型均能有效回答特定的科学问题14,15。其中，大型单层囊泡（LUVs）作为一种合适的膜模拟模型，可用于研究肽与膜之间的相互作用，而这正是内化过程中的关键环节。

在此背景下，以下方案描述了通过监测包封在脂质体中的阴离子荧光染料及其相应的多阳离子猝灭剂，来研究肽及肽-膜相互作用对大单层囊泡（LUVs）完整性的效应。该工具用于研究穿膜肽（CPP）与膜的相互作用，以明确其是否能够直接跨膜转运。尽管该方法通常用于比较不同膜相互作用肽，但此大单层囊泡荧光泄漏检测法也可用于研究穿膜肽-货物偶联物（共价策略）以及穿膜肽:货物复合物（非共价策略）。

本实验方案将首先以近期开发的富含色氨酸（W）和精氨酸（R）的两亲性肽（WRAP）为例进行说明16。WRAP 能够形成基于肽的纳米颗粒，可在多种细胞系中快速高效地递送小干扰 RNA（siRNA）16。通过监测单独 WRAP 肽或负载 siRNA 的 WRAP 基纳米颗粒的荧光泄漏特性，对其细胞内化机制进行表征。我们发现，其内化机制主要涉及直接转位7。在第二个示例中，WRAP 肽被共价连接至蛋白-蛋白相互作用抑制肽 iCAL36（WRAP-iCAL36）17，并通过荧光泄漏实验将其膜破坏能力与另一种细胞穿透肽 Penetratin 偶联的 iCAL36（Penetratin-iCAL36）进行比较18。

最后，将从技术角度和生物学相关性两个方面讨论该方法的优势与局限性。

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方案

1. 大单层囊泡（LUVs）的制备

  1. 制备大单层囊泡（LUVs），用于作为细胞膜模拟物进行荧光泄漏实验。
  2. 使用 Hamilton 玻璃注射器，按 4:4:2 的摩尔比混合磷脂酰胆碱（DOPC，786.11 g/mol）、鞘磷脂（SM，760.22 g/mol）和胆固醇（Chol，386.65 g/mol）。脂质溶液由每种脂质在甲醇/氯仿（3/1，体积/体积）溶剂中的储备液配制而成，储备液浓度为 25 mg/mL，置于 25 mL 玻璃圆底烧瓶中。根据 4 µmol  DOPC、4 µmol  SM 和 2 µmol  Chol 的用量，分别取储备液 126 µL、117 µL 和 31 µL 混合得到所需脂质溶液。
    警告：甲醇为有毒且易燃的溶剂，氯仿具有毒性并可能致癌。两者均应在通风橱内佩戴适当防护装备操作。
  3. 在 60 °C 条件下，使用旋转蒸发仪在减压环境中蒸发甲醇/氯仿，持续 45–60 分钟，直至形成干燥的脂质薄膜。
  4. 配制两种 HEPES 缓冲液储备液。HEPES 缓冲液 1 的配制方法为：混合 20 mM HEPES（238.3 g/mol）和 75 mM NaCl（58.44 g/mol），调节 pH 至 7.4。HEPES 缓冲液 2 的配制方法为：混合 20 mM HEPES 和 145 mM NaCl，调节 pH 至 7.4。HEPES 缓冲液可在 4 °C 下保存 1 个月。
    注意：建议使用渗透压计检测缓冲液的渗透压。
  5. 通过将膜不可渗透的荧光染料-猝灭剂对——8-氨基萘-1,3,6-三磺酸二钠盐（ANTS，427.33 g/mol，12.5 mM）和对二甲苯双吡啶溴化物（DPX，422.16 g/mol，45 mM）——溶解于 HEPES 缓冲液中，配制脂质水合溶液。ANTS 与 DPX 混合后形成黄色溶液。为达到 12.5 mM ANTS 和 45 mM DPX 的浓度，分别将 21.4 mg 和 76 mg 溶解于 4 mL HEPES 缓冲液 1 中。
    注意：脂质水合溶液可在 4 °C 下避光保存 2 周（用铝箔包裹试管）。
  6. 通过向干燥脂质膜中加入 1 mL 脂质水合溶液并涡旋振荡，使脂质膜完全溶解，从而重构多层囊泡（MLV）。确保溶液完全溶解，因为残留的微小脂质聚集体将对后续步骤产生不利影响。同时检查玻璃圆底烧瓶内壁，确保无残留脂质膜。
    注意：溶解完成后，溶液呈乳光状且略带浅黄色。
  7. 对囊泡进行五次冻融循环以获得单层囊泡。每次循环操作为：将玻璃圆底烧瓶置于液氮中 30 秒以完成冷冻步骤，随后转移至水浴中 2 分钟以完成解冻步骤。
    注意：水浴温度应比脂质的相变温度高 5–10 °C。
  8. 通过在金属挤出器筒体内的每个聚四氟乙烯（PTFE）挤出器部件中插入已预先用 HEPES 缓冲液润湿的滤膜支撑架，组装脂质挤出器。
  9. 将一片经 HEPES 缓冲液润湿的聚碳酸酯膜（孔径 0.1 µm，直径 25 mm）放置在其中一个滤膜支撑架的上方。
  10. 将两个金属挤出器筒体组装并旋紧。
  11. 将组装好的挤出器置于支架中，并在每个聚四氟乙烯挤出器部件末端的适当孔位插入 1 mL 注射器。挤出过程即为液体样品通过聚碳酸酯膜从一个注射器推至另一个注射器的过程。
  12. 使用 1 mL HEPES 缓冲液注入其中一个 1 mL 注射器，测试挤出器是否密封良好，确保无泄漏或其他问题。
  13. 将 1 mL HEPES 缓冲液替换为 MLV 样品。
  14. 通过将 MLV 样品在两个注射器之间经聚碳酸酯膜反复挤出至少 21 次，以获得大小均一的 LUVs。
    ​注意：挤出操作应在高于脂质混合物相变温度的条件下进行。

2. 大单层囊泡（LUVs）的纯化

  1. 准备柱层析纯化以去除未包封的 ANTS 和过量的 DPX。
  2. 将交联葡聚糖凝胶（G-50）用含 0.01% NaN3（65 g/mol）的水相介质重悬后，加入液相色谱柱中（Luer Lock，无夹套，1.0 cm × 20 cm，床体积 16 mL），填充至柱子无色部分顶端下方约 1 cm 处。
  3. 打开活塞，让液体流出，使交联葡聚糖凝胶沉降稳定。
  4. 用 20 mL HEPES 缓冲液 2 对柱子进行洗涤，并弃去流出液。
  5. 当柱床上方溶剂的死体积最小化（<100 µL）但仍足以避免交联葡聚糖凝胶干燥时，关闭活塞。
  6. 将新挤出的 LUVs（黄色）加至柱顶，使其进入交联葡聚糖凝胶中。
  7. 持续向柱中添加 HEPES 缓冲液 2，以完成 LUVs 的纯化。
  8. 继续洗脱约 2 mL 的 HEPES 缓冲液 2（注意定期补充柱顶液体，防止交联葡聚糖凝胶干燥）：游离的黄色 ANTS 和 DPX 溶液迁移速度比脂质体慢。
  9. 开始用离心管（1.5 mL）收集纯化的 LUVs。
  10. 观察柱子流出的液滴，当液滴呈现乳光时，表明含有脂质体。此时更换收集管以回收含 LUVs 的组分。
  11. 继续洗脱至液滴不再呈现乳光（约 1 mL）。随后再用另一管收集额外 0.5 mL 洗脱液，然后停止洗脱。
    注：目前已有多种不同分子量的标准品，可作为试剂盒或单个分子量标准品，用于校准 LUVs 的洗脱体积。
  12. 用铝箔包裹含有 LUVs 的收集管，避免荧光染料发生漂白。
  13. 用 20 mL HEPES 缓冲液 2 清洗柱子。
  14. LUVs 可在 4 °C 下保存一周。
    ​注：由于 LUV 的稳定性可能受 LUV 浓度、组成以及离子强度的影响，在每次实验前应使用动态光散射（DLS）仪器检测 LUVs 的粒径（参见第 4 节：LUVs 粒径与均一性的表征）。

3. 大单层囊泡浓度的定量

  1. 使用磷脂定量试剂盒估算LUV浓度，该试剂盒可检测胆碱浓度19。当含胆碱极性头的磷脂占比较大时（> LUVs的50%），可应用此方法。
  2. 将18 mg显色底物溶解于提供的3 mL缓冲液中，配制显色试剂。
  3. 取一个10 × 10 × 45 mm的聚苯乙烯比色皿，加入3 mL显色试剂。
  4. 以纯显色试剂作为空白对照（空白）。向测试样品中加入20 µL LUV 样品（测试），或向标准管中加入20 µL已知胆碱浓度的标准溶液（标准品）。
  5. 充分混匀后，将所有样品（空白、测试和标准品）在37 °C下孵育5分钟。
  6. 使用分光光度计，在600 nm波长下，以空白溶液为对照，测定测试样品和标准溶液的吸光度（光密度，OD）。
  7. 根据标准品的已知浓度，通过测定的OD值估算LUV的脂质浓度C[LUV]（以胆碱当量计）。
  8. 使用以下公式进行计算：
    C[LUV] (mol / l) = (OD 样品 / OD 标准品) × C[标准品] (mol / l)
    ​注：磷脂定量试剂盒提供的胆碱氯化物标准溶液浓度为139.6 mg/l（相当于54 mg/dL），其摩尔浓度为C[标准品] = 3.87 mmol/L。OD 样品和OD 标准品分别为LUV溶液和胆碱溶液在600 nm处测得的吸光度。

4. 大单层囊泡大小和均一性的表征

  1. 使用动态光散射（DLS）仪器进行测量，以确定大单层脂质体（LUV）的尺寸（单位：nm）和多分散系数（PdI）。
  2. 设定适当的程序 "标准操作程序" （标准操作程序）需注明溶剂/缓冲液的黏度及所用比色皿。
  3. 将500 µL LUV溶液置于聚苯乙烯半微量比色皿中。
  4. 将聚苯乙烯半微量比色皿插入DLS仪器中。
  5. 在室温下，测量颗粒分布的粒径分布（以平均粒径（Z-平均值）表示）及均一性（多分散性指数，PdI）。
  6. 所有结果均来自两次独立测量，每次测量重复进行三个循环。
    ​注意：LUVs 的标准值为平均粒径 137 ± 7 nm，PdI 为 0.149 ± 0.041。

5. 准备肽溶液

  1. 制备用于渗漏实验分析的肽段储备溶液。
  2. 将肽段粉末（>95% 纯度）溶解于纯水中（例如，将 1 mg 肽段溶于 500 µL 纯水中）。
    注意：建议将肽段溶解于纯水中，避免使用二甲基亚砜（DMSO）溶解，因为后者可能引起假象（例如，导致膜通透性增加20）。
  3. 将肽段溶液涡旋振荡 5 秒。
  4. 将肽段溶液置于水浴超声仪中进行超声处理 5 分钟，随后在 12,225 × g 条件下离心 5 分钟。收集上清液用于浓度测定。
  5. 测定三种独立稀释肽段溶液在 280 nm 处的吸光度，然后根据其摩尔消光系数 ε（取决于肽段序列中色氨酸和酪氨酸的含量）以及比尔-朗伯定律计算肽段浓度。
    注意：若肽段含有色氨酸和酪氨酸，则摩尔消光系数 ε 可根据色氨酸 ε = 5,690 M-1cm-1 和酪氨酸 ε = 1,280 M-1cm-1 进行计算。若肽段序列中不含色氨酸或酪氨酸，可采用其他比色法测定浓度（如 BCA 法或 Bradford 法）。
  6. 用纯水将肽段溶液稀释至终浓度为 100 µM，并在 4 °C 下保存。
    ​注意：在纯水中，肽段在 4 °C 保存期间不会发生降解。然而，应每两周测定一次肽段浓度，以确保未发生水分蒸发。

6. 荧光泄漏实验

  1. 在室温下使用荧光分光光度计测量荧光泄漏实验。激发波长和发射波长分别固定为 Ex = 360 nm ± 3 nm 和 Em = 530 nm ± 5 nm。
  2. 将大单层囊泡（LUVs）用1 mL HEPES缓冲液2稀释至终浓度为100 µM，置于石英荧光比色皿中。实验过程中加入磁力搅拌子以确保溶液均匀混合。
  3. 在 t = 0 s 至 t = 99 s 的前100秒内单独测量LUVs，以获取背景荧光强度。
    注意：也可在整个实验过程（15分钟）中持续测量单独的LUVs，以评估背景荧光及潜在的泄漏情况。
  4. 随后，在接下来的900秒（15分钟）内，通过逐次加入不同体积的肽溶液，测量荧光强度的增加，从而测定泄漏程度。本方案针对每种测试的肽浓度（从0.1 µM到2.5 µM）分别进行。
  5. 最后，在 t = 1,000 s 至 t = 1,100 s 期间，加入1 µL的Triton X-100（0.1%，v/v）使LUVs完全溶解，从而实现探针的完全去猝灭，获得100%荧光信号。

7. 渗漏量的定量分析

  1. 抑制 t = 1,090 s 之后获得的数值，以确保每种测试条件下数据点数量相同。
  2. 通过计算 t = 0 s 至 t = 49 s 之间 50 个数据点的平均值，确定最小荧光值 Fmin（仅 LUVs）。
  3. 通过计算 t = 1,041 s 至 t = 1,090 s 之间 50 个数据点的平均值，确定最大荧光值 Fmax（含 Triton X-100 的 LUVs）。
  4. 根据以下公式计算每个时间点（t = x）的泄漏百分比（%Leak）：
    %Leak(t=x) = (F(t=x) - Fmin) / (Fmax - Fmin) × 100
  5. 对相同条件下不同 LUV 制备所获得的数值（n ≥ 2）计算平均值和标准偏差。
  6. 绘制泄漏百分比 %Leak(t=x) 随时间（s）变化的曲线图。

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结果

荧光泄漏实验的原理如图1所示。具体而言，将包裹有荧光染料和淬灭剂（无荧光信号）的大单层囊泡（LUVs）与目标生物分子共同孵育。由于肽与脂质膜相互作用，可能导致膜通透性增加、结构重排甚至破裂，荧光染料和淬灭剂因而从LUVs中释放出来。在缓冲液中进一步稀释后，荧光信号增强。

尽管本方案展示了使用游离肽进行的测试，但该系统的优势在于还能够检测可能破坏脂质膜的肽偶联物、基于肽的纳米颗粒或其他生物大分子。尽管在测试分子方面需要对实验方案进行初步优化，但这种荧光泄漏检测法可扩展应用于大量与膜相互作用的组分。在本实验方案中，我们展示了细胞穿透肽（CPPs）及其复合形式（非共价策略）或偶联形式（共价策略）的一些实验结果。以下示例包括单独使用的WRAP、负载siRNA的WRAP基纳米颗粒，以及两种不同的肽偶联物（WRAP-iCAL3617 和 Penetratin...

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讨论

本文介绍的荧光泄漏实验是一种简单且快速的方法，用于评估穿膜肽对膜稳定性的破坏作用。该方法操作简便，还可实现不同膜相互作用肽或其他膜相互作用分子之间的间接比较。关于实验方案中的关键步骤，由于该实验通过比较基础值（仅LUVs）与最大荧光释放量（Triton处理条件）来提供相对数值，我们通常使用磷脂定量试剂盒测定LUVs浓度，但该方法仅能估算LUVs中胆碱成分的贡献。然而，也可通过酸消化法测定总磷含量（如Rouser及其同事27或Bartlett28所述），或采用硫酸铁铵硫氰酸盐比色法与磷脂形成络合物进行更精确的LUV 浓度测定29。据我们经验，这些方法对泄漏的相对定量以及膜相互作用肽之间的比较结果并无显著影响。

关于LUV的使用，还应注意控制LUV自身基线状态的重要性，以检查其是否可用，以及是否已出现泄漏（表现为荧光持续增加）。同样，在每次肽孵育后测量最大荧光释放量也至关重要，以确保未因非预期的淬灭过程（例如肽/染料淬灭）而记录到假阴...

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致谢

作者感谢Emilie Josse对稿件的审阅。本研究得到了"La Ligue contre le Cancer"基金会、"Fondation ARC pour la Recherche sur le Cancer"以及"Centre National de la Recherche Scientifique"（CNRS）的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
25 mL 玻璃圆底烧瓶Pyrex
8-氨基萘-1,3,6-三磺酸二钠盐（ANTS）InvitrogenA350避光保存 
氯仿 Sigma-Aldrich288306
胆固醇Sigma-AldrichC8667
DOPC（二油酰基磷脂酰胆碱）Avanti Polar850375P避免接触空气
挤出器Avanti Polar610000
荧光分光光度计PTI Serlabo
50 µL 玻璃注射器Hamilton705N
HEPESSigma-AldrichH3375
LabAssay 磷脂检测试剂盒 WAKO 296-63801
液相色谱柱Sigma-Aldrich
甲醇Carlo Erba414902
Nuclepore 聚碳酸酯膜（孔径 0.1 µm，直径 25 mm）Whatman800309
聚苯乙烯比色皿，10 × 10 × 45 mmGrener Bio-One614101
聚苯乙烯半微量比色皿，用于动态光散射（DLS）Fisher ScientificFB55924
对二甲苯双吡啶溴化物（DPX）InvitrogenX1525避光保存 
石英荧光比色皿Hellma109.004F-QS
旋转蒸发系统 HeidolphZ334898
Sephadex G-50 树脂Amersham17-0042-01
叠氮化钠（NaN3）Sigma-AldrichS2002
氯化钠（NaCl）Sigma-AldrichS5886
超声波清洗仪 USC300TVWR142-6001
鞘磷脂Avanti Polar860062P避免接触空气
吐温 X-100 Eromedex2000-B
Zetasizer NanoZS MalvernZEN3500

参考文献

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荧光泄漏实验用于研究穿膜肽对膜稳定性的破坏
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