利用Updegraff法测定植物生物质中的结晶纤维素含量

摘要

Updegraff 法是用于纤维素测定的最广泛使用的方法。本演示的主要目的是提供一种详细的 Updegraff 方案，用于测定植物生物量样品中的纤维素含量。

摘要

纤维素是地球上通过光合作用生成的最丰富的聚合物，也是细胞壁的主要承重成分。细胞壁通过提供强度、刚性、细胞生长的速率和方向、细胞形态的维持以及对生物和非生物胁迫的防护，在植物生长和发育中发挥着重要作用。细胞壁主要由纤维素、木质素、半纤维素和果胶组成。近年来，植物细胞壁已成为第二代生物燃料和生物能源生产的靶标。特别是植物细胞壁中的纤维素成分被用于生产纤维素乙醇。准确测定生物质中纤维素含量对于基础和应用的细胞壁研究至关重要。Updegraff法是一种简单、稳健且被广泛用于测定植物生物质中结晶纤维素含量的方法。将酒精不溶性粗细胞壁组分用Updegraff试剂处理后，可去除半纤维素和木质素组分。随后，将耐Updegraff试剂的纤维素组分用硫酸处理，使纤维素均聚物水解为单体葡萄糖单位。通过配制不同浓度的葡萄糖建立回归曲线，并用于估算实验样品中纤维素水解所释放的葡萄糖量。最后，通过比色蒽酮法根据葡萄糖单体的含量来估算纤维素含量。

引言

纤维素是细胞壁中的主要承重成分，存在于初生细胞壁和次生细胞壁中。细胞壁是包围植物细胞的胞外基质，主要由纤维素、木质素、半纤维素、果胶和基质蛋白组成。植物生物量中约三分之一为纤维素¹，其在植物生长发育过程中发挥重要作用，包括提供机械强度和刚性、调控细胞生长的速率与方向、维持细胞形态，以及抵御生物和非生物胁迫。棉纤维的纤维素含量高达95%²，而树木的纤维素含量则因植物种类和器官类型的不同，介于40%至50%之间³。纤维素由重复的纤维二糖单元构成，纤维二糖是一种通过β-1,4-糖苷键连接的葡萄糖二糖⁴。纤维素乙醇是通过植物细胞壁中纤维素来源的葡萄糖发酵生产的⁵。纤维素纤维由多个微纤丝组成，每个微纤丝作为基本结构单元，包含500至15000个葡萄糖单体^1,6。纤维素同多聚物由嵌入质膜的纤维素合酶复合体（CSC's）合成^1,7。单个纤维素合酶A（CESA）蛋白合成葡聚糖链，相邻的葡聚糖链通过氢键连接形成结晶态纤维素^1....

方案

1. 实验准备

1. 将干燥的植物材料研磨成细粉。
2. 蛋白溶解缓冲液（PSB）：配制1 M Tris（pH 8.8）和0.5 M乙二胺四乙酸（EDTA）（pH 8.0）的储备液，并进行高压灭菌。使用这些储备液新鲜配制PSB缓冲液，终浓度为50 mM Tris、0.5 mM EDTA和10%十二烷基硫酸钠（SDS），溶于无菌水中。
3. 配制100 mL 70%乙醇（v/v）：取70 mL 100%乙醇与30 mL无菌水混合。
4. 配制100 mL甲醇：氯仿（1:1，v/v）：取50 mL甲醇与50 mL氯仿混合。
5. 配制82.5 mL Updegraff试剂。将75 mL 80%乙酸加入7.5 mL硝酸中，使水：乙酸：硝酸的最终体积比为2:8:1。配制80%乙酸时，将80 mL冰乙酸与20 mL无菌水混合（v/v）。
6. 每批实验前新鲜配制1 mg/mL葡萄糖溶液。称取10 mg葡萄糖溶于10 mL水（w/v）中。
7. 配制100 mL 67%硫酸（v/v）：将67 mL浓硫酸缓慢加入33 mL水中。务必使用玻璃瓶，并将酸缓慢加入水中。该过程为放热反应（释放热量），因此应在冰上配制，并在使用前于冰箱中冷却至少2小时。
8. 每次实验批次均需新鲜配制0.2%蒽酮溶液（w/v）。称取0.2 g蒽酮，溶于100 mL预冷的浓硫酸中，使用铝箔包裹的玻璃瓶溶解。使用前在冰箱中静置1–2小时。
   ....

结果

本研究选取在温室中种植的棉花植株。为比较纤维素含量，选用了两种不同的棉花实验品系。对于每个实验品系，分别采集三个生物学重复的根组织。总共取500 mg组织进行匀浆处理，并从中取20 mg用于粗细胞壁的提取。随后，取5 mg粗细胞壁提取物，用Updegraff试剂处理，以去除半纤维素和木质素，保留纤维素。纯化后的纤维素通过硫酸处理进行水解，将纤维素分解为葡萄糖单元。在620 nm处测得的吸光度读数结果（补充表1）用于通过蒽酮法测定葡萄糖浓度并估算纤维素含量。三个技术重复的平均吸光度值通过减去0 µg葡萄糖浓度的空白吸光度值进行校正。葡萄糖标准曲线采用散点柱状图生成（图4）。

利用该标准曲线所得的回归直线 y = mx + c，结合归一化吸光度读数，用于计算提取测试样品中未知的葡萄糖浓度。为计算 x（未知葡萄糖浓度，单位为 µg/µL），采用公式（x = (归一化吸光度 - c)/m）。其中，c 和 m 的数值来源于标准葡萄糖曲线的回归直线（R² = 0.99），用于测定.......

讨论

棉纤维是由棉籽产生的天然纤维。棉纤维为单细胞结构，纤维素含量约为95%²，具有较高的结晶纤维素含量，在纺织工业中具有广泛应用³¹。由于棉纤维含有约95%的纤维素，我们采用棉花根组织作为示例，用于展示结晶纤维素含量的测定方法。棉花根组织的结晶纤维素含量适中，代表了一种常见的植物生物量材料。测定结晶纤维素含量所需的总细胞壁材料仅为5 mg，因此该方法可用于不同发育阶段或组织特异性纤维素含量的测定。硫酸的浓度（67%）在将纤维素分解为葡萄糖单体并完全溶解纤维素的过程中起着关键作用²³，且无需超声处理。在Updegraff处理后，样品损失较为常见，因为在测定过程的不同步骤中，结晶纤维素沉淀物并未牢固地沉积在管底。可通过在Updegraff处理后的每一步水洗和丙酮洗涤中移除少量上清液来尽量减少损失。此外，在加入蒽酮后立即对样品和标准品进行涡旋振荡，对显色反应及提高标准品的准确性具有重要作用，从而获得高达99.5%的决定系数（R²） 值（

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
丙酮	Fisher Chemical	A18-500	用于本方案
蒽酮	Sigma Aldrich	90-44-8	用于比色测定
离心机	Eppendorf	5424	用于离心
氯仿	Mallinckrodt	67-66-3	用于本方案
乙二胺四乙酸（EDTA）	Sigma Aldrich	6381-92-6	用于本方案
乙醇	Millipore Sigma	EM-EX0276-4S	用于本方案
滤纸	Whatman	1004-090	阳性对照
冰乙酸	Sigma	SKU A6283	用于本方案
加热金属浴/ThermoMixer F1.5	Eppendorf	13527550	用于控制温度
培养箱	Fisherbrand	150152633	用于干燥植物样品
电子天平	Mettler Toledo	30243386	用于精确称量
100% 甲醇	Fisher Chemical	A412-500	用于本方案
微孔板（96 孔）	Evergreen Scientific	222-8030-01F	用于蒽酮测定
硝酸	Sigma Aldrich	695041	用于本方案
聚丙烯微量管（2 mL）/螺口管	BioSpec Products	10831	用于高温处理
多功能酶标仪（分光光度计）	Beckmancoulter DTX880	1000814	用于测定吸光度
Spex SamplePrep 6870 冷冻研磨仪	Spex Sample Prep	68-701-15	用于将植物组织研磨成细粉
硫酸	J.T.Baker	02-004-382	用于本方案
十二烷基硫酸钠（SDS）	Sigma Aldrich	151-21-3	用于 PSB 缓冲液
离心管（2 mL）	Fisher Scientific	05-408-138	用于本方案
Tris 盐酸盐	Sigma Aldrich	1185-53-1	用于 PSB 缓冲液
超纯去离子水	Invitrogen	10977	用于本方案
真空干燥仪（Vacufuge plus）	Eppendorf	22820001	用于样品干燥
涡旋振荡器	Fisherbrand	14-955-151	用于混匀
水浴锅	Thermoscientific	TSGP02PM05	用于特定步骤的温度控制
称量纸	Fisher Scientific	09-898-12A	用于本方案