通过振动切片法分离与成像小鼠肾盂完整起搏区域的活体组织

摘要

本实验方案的目的是利用振动切片机对小鼠肾盂的完整起搏区域进行分离。这些切片随后可用于原位Ca²⁺成像，以阐明振动切片中起搏细胞及其他间质细胞的Ca²⁺瞬变特性。

摘要

肾盂（RP）是一种漏斗状的平滑肌结构，通过规律性的推进性收缩，促进尿液从肾脏向输尿管的正常输送。肾盂的规律性收缩依赖于起搏活动，该活动起源于肾盂与肾脏交界处（PKJ）最靠近肾实质的区域。由于获取并保存完整的PKJ组织样本存在困难，目前关于肾盂起搏功能的研究大多集中于单细胞电生理学和Ca²⁺成像实验。尽管这些研究已揭示了肾盂起搏机制的重要信息，但仍存在若干内在局限性，例如无法在细胞混合悬液中准确鉴定细胞类型，以及缺乏对肾盂起搏活动在原位状态下的成像手段。这些因素导致人们对正常节律性肾盂收缩所依赖的机制仍缺乏充分理解。本文介绍了一种利用振动切片机技术制备完整小鼠PKJ组织片段的实验方案。通过将该方法与表达细胞特异性报告基因及基因编码Ca²⁺指示剂的小鼠模型相结合，研究人员有望更准确地研究介导肾盂节律性蠕动收缩的特定细胞类型及其作用机制，而这种蠕动对于尿液的正常输送至关重要。

引言

肾盂（RP）是一种漏斗状的平滑肌结构，负责将尿液从肾脏输送至输尿管。肾盂通过产生规律的节律性收缩（蠕动）^1,2,3,4,5，推动尿液从肾脏向远端经输尿管输送至膀胱，并在膀胱中储存直至排尿发生^6,7。这种规律性活动的丧失将导致严重后果，包括肾积水和肾功能衰竭^1,3,8；因此，深入研究肾盂规律节律性收缩的潜在机制具有重要意义。蠕动收缩起源于肾盂最靠近近端的区域——肾盂-肾脏连接处（PKJ）^{9,10,11,12,13,14,15}（图1A-C），并向远端传播，将尿液从乳头推入肾盂（图1B）。在PKJ处可记录到电起搏活动，表现为自发性瞬时去极化^{10,11,12,13,15,16,17}，该活动被认为来源于特化的起搏细胞。这些起搏细胞曾被称为非典型平滑肌细胞（ASMCs），被认为能够产生或协调起搏活动，并驱动"典型"平滑肌细胞（SMCs）的收缩^{9,10,11,18,19,20,21,22,23}。

ASMCs 主要分布在近端 RP 的 PKJ 处（图 1A-C），此处是蠕动收缩和电起搏活动的起源部位^{5,7,8,9,12,13,14,16,17,18,19,20,21,22}。本研究团队近期发表的一项研究发现，血小板源性生长因子受体-α（PDGFRα）与平滑肌肌球蛋白重链（smMHC）联合可作为这些间质细胞（ICs）的独特生物标志物²⁴，该结果已被其他研究团队证实²⁵。根据其形态学特征和蛋白表达模式，这些细胞被称为 PDGFRα⁺ IC 1 型（PIC1）^24,26。PIC1 位于 PKJ 的肌层，表现出高频、短时程的 Ca²⁺ 瞬变，被认为与起搏电位的产生有关²⁴。然而，PKJ 中还存在其他类型的细胞，包括存在于外膜层的不表达 smMHC 的 PDGFRα⁺ ICs（PIC2s）。先前的研究提示，不表达 smMHC 的 ICs 可能参与起搏活动的调控¹⁹。然而，由于在 Ca²⁺ 成像研究中难以清晰区分这些细胞，对非 smMHC ICs 的进一步研究受到限制。通常情况下，RP 制备物中的多种细胞类型会无差别地加载 Ca²⁺ 敏感染料（例如 Fluo-4）。为克服这些挑战并研究 RP 中多种类型的细胞，可利用基因编码的 Ca²⁺ 指示剂（GECIs），在特定目标细胞类型中选择性表达 Ca²⁺ 敏感的荧光蛋白。

大多数阐明PIC1s/ASMCs中Ca²⁺瞬变特性的研究是通过对扁平片状的肾盂输尿管连接部（RP）组织制备物进行成像实现的^19,21,27。由于在肾盂输尿管连接部（PKJ）中只有PIC1s表达平滑肌肌球蛋白重链（smMHC），因此在smMHC⁺细胞中条件性表达基因编码的钙离子指示剂GCaMP，适用于在此体系中研究PIC1s。然而，由于PIC1s和PIC2s均表达PDGFRα，若在PDGFRα⁺细胞中条件性表达GCaMP变体，则无法在扁平片状组织制备物中区分这两种细胞类型。为克服这一问题，已采用振动切片机切片法，以区分PKJ组织壁不同层次的PIC1s和PIC2s²⁴。为了识别这些不同的细胞群体，对RP组织进行冠状切片，从而可根据已知的免疫组织化学标记和GECI表达模式，在外膜中识别PIC2s，在肌层壁中识别PIC1s。通过这种创新的PKJ成像方法，发现PIC1s和PIC2s表现出不同的Ca²⁺信号特性²⁴。此外，通过分离PKJ区域最靠近近端的部分（图2），得以以前所未有的方式保留了RP的起搏区域。本文描述了一种实验方案，介绍如何利用振动切片机从鼠肾中分离PKJ组织制备物，如何为Ca²⁺成像实验设置这些组织制备物，以及如何区分PKJ管壁中不同类型的细胞。

方案

本研究中使用的所有小鼠及实验方案均遵循美国国立卫生研究院（NIH）《实验动物护理和使用指南》以及内华达大学里诺分校机构动物使用与护理委员会的规定。实验操作和动物使用亦符合Grundy²⁸所述的原则与规范。

1. 构建 PDGFRα-GCaMP6f 和 SMCGCaMP3 小鼠模型

1. 交叉 GCaMP6f^lox/+ 小鼠（B6；129S-Gt(ROSA)26Sor）^{tm95.1(CAG-GCaMP6f)Hze}/J) 与 PDGFRα^Cre 小鼠（C57BL/6-Tg(Pdgfra-cre)1Clc/J）以生成PDGFRα-GCaMP6f小鼠。
2. 交叉 GCaMP3^lox/+ 小鼠（B6.129S-Gt(ROSA)26Sor^{tm38(CAG-GCaMP3)Hze}/J) 与雄性 smMHC^CreERT2 小鼠（B6.FVB-Tg(Myh11-cre/ER)^T2)1Soff/J) 以生成 SMC-GCaMP3 小鼠。
   注意：仅使用该杂交组合的雄性小鼠（GCaMP3^lox/+ 小鼠和smMHC^CreERT2 小鼠）可用作 Cre 表达由Y染色体驱动。smMHC^CreERT2 小鼠也可与 GCaMP6f 进行杂交^lox/+ 用于改善 Ca 的小鼠²⁺ 信噪比和更快的Ca²⁺ 信号的时间特性

2. 准备转基因小鼠并注射他莫昔芬以诱导GCaMP的条件性表达

1. 按照先前所述方法²⁹，激活可诱导的Cre重组酶，以在特定细胞类型中实现细胞特异性的GCaMP表达。

3. 配制溶液

1. 配制1 L含有120.35 mM NaCl、5.9 mM KCl、15.5 mM NaHCO₃、1.2 mM Na₂HPO₄、1.2 mM MgCl₂、11.5 mM葡萄糖和2.5 mM CaCl₂的Krebs-Ringer碳酸氢盐（KRB）溶液。使用当天将KRB溶液置于冰上保存。
   注意：KRB溶液可在4 °C下保存最多一周，使用前应使用97% O₂和3% CO₂混合气体预通气至少10分钟。

4. 准备硅酮弹性体包被的解剖和显微镜成像培养皿

1. 根据制造商说明混合硅胶弹性体组分。分别取适量液态硅胶弹性体，填充至35 mm × 10 mm培养皿的约四分之一处，用于成像实验；另填充60 mm × 15 mm培养皿至约四分之一处，用于解剖。使用前在37 °C下聚合1天。
   ​注意：为增强薄肾切片的成像对比度，可在向成像用培养皿中填充硅胶弹性体前，先在培养皿底部贴附一个小型黑色圆形纸片。

5. 肾脏解剖

1. 在通风橱中使用3-4%异氟烷吸入法对小鼠进行麻醉。通过脚趾和/或尾巴夹捏反射消失确认深度麻醉后，采用颈椎脱位法处死小鼠。
2. 用70%乙醇润湿胸部毛发。使用外部解剖剪，沿纵轴做切口打开腹腔，剪刀刀刃朝外倾斜，以避免损伤内脏器官。
3. 使用内部组织镊子和内部解剖剪，夹住肠道并将其从腹壁提起。在提起肠道的同时，于近端十二指肠和远端结肠处剪断肠道下方与体壁的连接，以暴露包含肾脏的腹膜后腔。
4. 暴露肾脏后，逐个取出。用组织镊子轻轻夹住输尿管远端（距肾脏约4 mm处）并提起。使用解剖剪从夹持处沿输尿管下方朝向肾脏方向剪开。继续在肾脏下方剪切，直至肾脏完全从周围结缔组织中游离出来。
   注：为了在振动切片过程中最大限度保持组织完整性和切片一致性，肾脏应尽可能保持完整。为此，避免使用镊子或解剖剪夹捏或切割肾脏本身。
5. 将带有输尿管的肾脏置于冰冻的KRB溶液中。对对侧肾脏重复步骤5.4和5.5。将肾脏保持在冰上的KRB溶液中。
   ​注：应立即进入方案的下一节，以维持肾小球旁器（PKJ）组织的活性。由于PKJ位于肾实质深部，难以与KRB溶液直接接触。

6. 准备肾脏以进行振动切片

1. 将肾脏转移至涂有硅胶弹性体的解剖皿（60 mm × 15 mm）中，并加入冰冷的KRB溶液，直至完全浸没肾脏。
2. 在解剖显微镜下，用微型图钉将输尿管近端以及肾前部薄弱的肾囊膜或周围脂肪组织固定于培养皿底部，以锚定肾脏。
   注意：切勿刺破肾实质组织。
3. 使用精细弹簧剪和内用镊子清除肾脏基部的脂肪组织，以暴露远端肾盂和近端输尿管。
4. 使用精细的弹簧剪从RP基部切除近端输尿管及部分远端RP。
   注意：避免切割周围肾实质。图中黑色虚线表示 图1A 指示此处切割的大致位置。此切割可为肾脏创建一个平坦的基底，以实现更均匀的组织切片。在解剖肾脏时，必须注意PKJ区域的解剖学位置。 图1B 显示完整的肾脏可沿矢状面切开，以暴露髓质、乳头（远端髓质，集合管汇合处）以及近端和远端肾乳头。若要完全暴露乳头，如 图1C, 可以观察到PKJ和近端RP（prox RP）。然而，使用振动切片机技术时不应进行此操作；此描述旨在帮助读者大致了解PKJ的位置，重点在于透射光成像下PKJ区域与中段RP区域所显示的解剖学差异。 图1D，E.
5. 用尖头镊子刺穿肾外层包膜，镊尖朝向远离肾实质的方向。双手各持镊子，夹住包膜松动的边缘，将其逐步撕开。继续剥离剩余的肾包膜，直至完全去除。
   ​注意：肾包膜是一层坚韧的纤维层，包裹着肾脏。为了获得最佳切片效果，必须在振动切片前将其去除。

7. 准备并校准振动切片机仪器

1. 将刀片插入振动切片机的刀片夹持器中，并将刀片的间隙角调整至约 18°。
   注意：为获得更高质量的切片，可选步骤是使用校准块（部分振动切片机附带）按照制造商说明对每把新刀片进行位置校准。这将确保刀片处于最佳位置，并最大限度减少垂直振动。
2. 将刀片进给速度调整为 0.2 mm/s，刀片的水平振动/剪切幅度调整为 2.00 mm，刀片的 Z 轴步进大小调整为约 100–150 µm。确保肾组织切片厚度不超过 150 µm，否则会对 Ca²⁺ 成像实验产生不利影响（因为若切片过厚，肾小管壁常会卷曲或折叠）。
   注意：用户应根据不同的肾组织样本和振动切片机设备微调这些切割参数。参数的优化应在切片过程中进行，用户可按照步骤 7.2 所述在显微镜下直观检查切片质量。
3. 在振动切片机上安装冰浴装置和缓冲液托盘。在冰浴中加入碎冰，并将内层工作区域用冰冻 Krebs-Ringer 缓冲液（KRB）填充至约一半高度。在振动切片过程中，需监测并及时补充已融化的碎冰。

8. 肾脏的振动切片

1. 使用平头镊子轻轻夹住并从冰冷的KRB溶液中取出已准备好的肾脏。立即将肾脏放置在吸水纸上约2–4秒，以去除表面多余的水分。轻轻滚动肾脏，使实质组织的各个面均干燥，以确保肾脏与振动切片机载物台之间具有最佳黏附性。
   注意：由于集合管（RP）位于肾脏内部，受到外层实质组织的保护，因此短暂的干燥过程不会对组织完整性造成损害。
2. 立即在振动切片机样品板底部涂上一层薄薄的氰基丙烯酸酯胶水（约1 cm²），然后使用平头镊子将肾脏（输尿管朝下）放置在涂有胶水的区域。用镊子的平边轻轻向下按压肾脏顶部约10–20秒，使胶水干燥。
   注意：为在该过程中稳定肾脏，可使用另一把镊子固定肾脏，防止其倾倒。确保肾脏以直立位置牢固黏附于样品板上，以保证切片笔直。为确认肾脏是否已成功黏附，可轻推肾脏侧面；若黏附成功，肾脏底部应牢固固定在板上。
3. 将样品板牢固固定在缓冲液槽底部。调节KRB溶液液面高度，使肾脏顶部完全浸没于溶液中。在切片过程中，随着振动切片机刀片逐渐深入缓冲液槽，应逐步移除部分KRB溶液，防止刀片夹持装置浸入液体中。
   注意：若在胶水未完全干燥前进行此步骤，胶水可能从底部上移至肾脏实质组织表面，导致切片不均。若发生此情况，应将肾脏从板上取下，并更换新的肾脏样本重新开始。
4. 进行自动振动切片时，设定振动切片机刀片切割循环的起始与终止位置。确认这些位置距离肾脏边缘约0.5–1 cm，以确保每次刀片前进时均可完整切过整个肾脏平面。
5. 准备一个多孔板（24孔或48孔），在各孔中加入KRB溶液，并将板置于冰上。
   注意：生成的各个切片应分别放入不同的孔中，以便追踪切片的深度位置。
6. 启动自动切割程序。在刀片首次通过时，确保刀片与肾脏最顶端接触。若未接触，应调整刀片的起始Z轴位置。
7. 使用镊子收集从肾脏上分离的切片，并立即将其转移至不同的孔中，同时记录切片的Z轴深度，以估算肾小管连接部（PKJ）在肾脏切片中的大致位置。
   注意：根据切割参数的不同，部分切片可能未能完全从组织块上分离。若发生此情况，可小心使用精细弹簧剪刀将切片从肾脏组织块上剪下。建议用户在切片漂浮于各孔中时，主动在光学显微镜下观察，以确保切割参数和组织定位的最优化。含有PKJ的切片通常位于肾脏顶部下方约1000–1500 µm处。
8. 继续切片操作，直至PKJ区域变得更为明显。切片过程中可参考“代表性结果”部分对PKJ区域的描述。
9. 此时应优化切片参数，确保切片能均匀且完整地从肾脏组织块上分离。此外，需确保PKJ区域连续且无断裂，因为破裂的PKJ壁会因塌陷而无法对壁内细胞进行充分成像。若发现壁结构破裂，应降低切片速度并增加切片厚度，并持续在光学显微镜下观察切片，以精细调整切割参数。
10. 将切片保存在4°C的KRB溶液中，直至开始实验。

9. 肾脏切片 Ca²⁺ 成像采集

1. 将单个肾组织切片转移至涂有硅胶弹性体的成像培养皿（35 mm × 10 mm）中，并立即加入新鲜的冰冻KRB溶液。
2. 在肾组织切片周围插入微型图钉，以固定切片使其紧贴成像培养皿底部。
   注意：此步骤至关重要，可防止在成像过程中灌注生理溶液时切片发生移动。
3. 将成像培养皿置于直立式转盘共聚焦显微镜载物台上，并立即开始灌注KRB溶液。
   注意：本实验方案中使用的直立显微镜配备高速Nipkow转盘共聚焦扫描装置。
4. 维持灌注速率为3 mL/min，KRB溶液温度为36 ± 1 °C。成像前，让切片平衡1小时。
5. 选择合适的二向色成像立方体和激光器。使用电子倍增电荷耦合器件（EMCCD）或科学级互补金属氧化物半导体相机采集图像。
   注意：本实验方案中的共聚焦系统配备488 nm激光器，用于激发GCaMP6f或GCaMP3。图像采集使用512像素 × 512像素的EMCCD相机。
6. 使用低倍水浸物镜（4×或10×）定位肾组织切片。将成像视野中心对准切片中存在肾小球旁器（PKJ）的区域。参考图2D所示的解剖标志（即实质组织之间悬挂的半圆形肌性组织结构）来识别PKJ位置。
7. 确定PKJ位置后，使用更高倍数的水浸物镜（20×、40×或60×）放大目标区域。
   注意：本实验方案中，20×物镜的数值孔径（NA）为1.0，40×物镜的NA为0.8，60×物镜的NA为1.0。
8. 利用分别在PDGFRα⁺细胞或SMC中表达GCaMP6f或GCaMP3的转基因小鼠，区分PKJ壁中不同类型的靶细胞。在PDGFRα⁺ GCaMP6f⁺肾切片中观察PKJ壁PDGFRα⁺细胞内不同类型的Ca²⁺瞬变持续时间（参见图3C及代表性结果部分描述），并在SMC GCaMP3⁺肾切片中观察GCaMP3⁺ SMC中的相应现象（参见图3D及代表性结果部分描述）。
9. 确定PKJ壁中的目标细胞后，调节激光强度以获得良好的信噪比。使用适当的采集软件，以16 Hz至32 Hz的时间采样频率记录图像。
   注意：根据成像过程中使用的激光强度，建议限制记录次数，以减少Ca²⁺荧光探针的光漂白效应。用户应根据具体实验目的选择合适的记录时长。

10. Ca²⁺成像分析

1. 通过时空作图法对PKJ起搏区域中不同细胞类型的Ca²⁺成像进行分析，该方法此前已用于胃肠道中其他完整起搏组织的分析^29,30。

结果

原位 Ca²⁺ PKJ成像可揭示视网膜色素上皮（RP）起搏细胞的重要细胞活动。通过使用表达基因编码Ca²⁺ 指示剂（如 GCaMP），在细胞特异性启动子驱动下，可获得关于 RP 起搏活动的准确且详细的信息，这是仅通过 Ca 无法实现的²⁺ 从扁平状RP标本获取的成像实验。PKJ的起始端以肾实质组织间悬浮的肌肉半环的突然出现为特征。图2C；近端PKJ被虚线框标出）。在后续的切片过程中，内髓质与周围皮质组织的区别逐渐明显。在光学显微镜下，内髓质在某些区域呈现条纹状，颜色较皮质组织浅，且沿其长轴与肾脏其余部分不连续。图2B，D）。此时，将有更多PKJ区域开始出现。示例如下所示 图 2D （虚线矩形，H 和 G）其中三个半圆形的肌肉组织由实质组织悬吊。这些肌带将紧贴乳头内部，并通常邻近一支肾小动脉。图 2D虚线矩形； 图2F-H，黑色箭头所示）。随着更远端切片的获取，这些肌层条带将融合形成更为完整、统一的结构，表明PKJ区域的结束（图 2E).
图3A，B 显示在 PDGFRα 细胞中表达 GCaMP 的小鼠的 PKJ 切片在低倍（4-10x）下的图像⁺ 细胞（通过可诱导的 Cre 重组酶驱动表达 GCaMP6f） Pdgfra）。利用肾小动脉等解剖标志（图3A；星号），实验人员应能够轻松识别出悬浮在实质组织之间的薄层PKJ壁（图3B；星号）。GCaMP6f 在该特定转基因组织中的表达遍布整个 PKJ 的宽度，涵盖肌肉层和外膜层。图3C).

在PDGFRα⁺ GCaMP6f⁺肾组织切片中，通常跨越肾小叶间动脉壁宽度的一群细胞会呈现荧光（图3C），并表现出持续时间与频率各异的振荡性Ca²⁺瞬变信号。肾小叶间动脉壁中的PDGFRα⁺细胞表现出两种不同类型的Ca²⁺瞬变持续时间。位于外膜层（朝向皮质侧）的PDGFRα⁺细胞呈网状分布，其细胞突起清晰可辨。外膜层PDGFRα⁺细胞表现出低频（4 ± 2.7 Hz）且长时程（1 ± 0.67 s）的Ca²⁺瞬变。第二层PDGFRα⁺细胞位于肌层（朝向髓质侧），其Ca²⁺瞬变的频率和持续时间与SMC GCaMP3⁺细胞（如下所述）相似，因为它们属于同一类细胞。

在SMC GCaMP3⁺肾脏切片中，肌层中存在一层GCaMP3⁺细胞（图3D）。外膜层中无荧光信号（图3D；星号）。肌层中的GCaMP3⁺平滑肌细胞通常表现出高频（10 ± 4 Hz）和短时程（632 ± 74 s）的Ca²⁺瞬变。位于PKJ外膜的PDGFRα⁺细胞则引发长时程、低频的Ca²⁺瞬变（图3E，视频1）。然而，由Myh11启动子驱动GCaMP3表达的组织中，Ca²⁺成像实验仅限于PKJ的肌层部分（图3D）。与外膜中的PDGFRα⁺细胞相比，平滑肌细胞更频繁地产生持续时间更短的Ca²⁺瞬变（图3F，视频2）。

除了研究PKJ PDGFRα⁺ 间质细胞中的信号特性外，本文还展示了该技术在研究振动切片肾脏中其他细胞类型方面的应用。在仔细观察表达GCaMP6f的PDGFRα⁺细胞小鼠的肾髓质时，发现集合管内及其周围存在一系列荧光Ca²⁺信号（视频3）。髓质中的PDGFRα⁺细胞可自发产生频率和持续时间各异的Ca²⁺瞬变信号。这种对肾脏振动切片进行的Ca²⁺成像研究还可拓展至研究常与PKJ肌段相邻的肾小动脉（直径约50–80 mm）（图2F，G；白色箭头）。对表达GCaMP的平滑肌细胞组织来源的肾小动脉进行Ca²⁺成像，可观察到平滑肌细胞（SMCs）中出现振荡性Ca²⁺瞬变（视频4）。

图1：肾脏基本解剖结构及PKJ起搏区域的位置。（A）完整肾脏的示意图，显示肾盂（RP）和输尿管的方位。肾动脉和肾静脉分别以红色和蓝色表示。（B）沿矢状面切开完整肾脏，可暴露肾脏内部结构，包括髓质、乳头（集合管汇聚的远端髓质）、近端和远端肾盂（RP）。（C）切除髓质和乳头后，可完全暴露盆肾连接部（PKJ）和近端肾盂（prox RP）。（D 和 E）分别为PKJ起搏区域和远端肾盂的透射光图像。沿肾盂远端连续切片时，PKJ区域的肌肉呈半环状（Di），逐渐融合成一个更厚的完整肌环（Ei），包裹整个乳头。Di 和 Ei 中的黑色虚线矩形表示在冠状面肾脏切片中获取透射光图像的大致区域。图像 D 和 E 的方向相对于其对应插图（Di 和 Ei）逆时针旋转90°。图 D 和 E 中的比例尺 = 20 µm。缩写：RP = 肾盂；prox RP = 近端肾盂；PKJ = 盆肾连接部；PICs = 血小板源性生长因子受体α阳性间质细胞；SMC = 平滑肌细胞。请点击此处查看该图的放大版本。

图2：使用振动切片机对完整肾脏进行切片以制备薄切片。 (A肾脏以输尿管侧朝下固定于振动切片仪底座上，使用安装在振动切片仪头部的标准刀片，从肾脏近端向远端连续切片。B) 从整个肾脏切取的薄切片示意图，标注了解剖标志。PKJ肌节段（黑色虚线矩形）常悬浮于实质组织之间。C光学显微镜下观察近端肾脏切片。实质组织间悬浮的肌层条带的出现，提示近端PKJ突起的起始部位（白色虚线矩形内所示）。D光学显微镜图像，显示可找到多个（2-3个）PKJ节段的最佳区域（白色虚线矩形内区域）。细长的PKJ肌条悬浮于肾实质之间，紧邻肾小动脉和髓质。E远端肾组织切片的光镜图像。单个肌节已融合形成一条环绕肾乳头内层（本图中未显示）的连续肌层（白色虚线框）。比例尺 C-E = 500 µm F-H D 面板中的放大区域（20倍）显示了肾小球旁器（PKJ，黑色箭头）、肾小动脉（白色箭头）以及分离 PKJ 的切割位点（白色虚线）。比例尺 F-H = 100 µm。缩写：PKJ = 盆腔-肾脏连接处。 请点击此处查看此图的放大版本。

图 3：振动切片的 Ca²⁺ 成像。（A）振动切片的代表性低倍图像（4×），显示肾小动脉的位置（星号）。比例尺 = 200 µm。（B）肾盂-肾脏连接部（PKJ，已标注）的代表性放大图像（20×），悬浮于肾实质组织之间，显示 PKJ 肌肉（白色箭头）、肾小动脉（星号）的位置。比例尺 = 50 µm。（C）在 PDGFRα⁺ 细胞中表达 GCaMP 的 PKJ 高倍图像（40×）。比例尺 = 20 µm。（D）在平滑肌细胞中表达 GCaMP 的 PKJ 高倍图像（20×）。比例尺 = 20 µm。（E）来自图 C 中所示 GCaMP⁺ PDGFRα⁺ 细胞的 Ca²⁺ 瞬变时空图。颜色查找表编码为 F/F₀。（F）来自图 D 中所示 GCaMP⁺ PDGFRα⁺ 细胞的 Ca²⁺ 瞬变时空图。颜色查找表编码为 F/F₀。（G）GCaMP⁺ PDGFRα⁺ 细胞与 GCaMP⁺ smMHC 细胞的 Ca²⁺ 瞬变频率（Hz）代表性数据。（H）GCaMP⁺ PDGFRα⁺ 细胞与 GCaMP⁺ smMHC 细胞的 Ca²⁺ 瞬变持续时间（s）代表性数据。缩写：PKJ = 肾盂-肾脏连接部；PDGFRα⁺ = 血小板源性生长因子受体-α阳性；smMHC = 平滑肌肌球蛋白重链。请点击此处查看该图的放大版本。

视频 1： PKJ 振动切片中 GCaMP⁺ PDGFRα⁺ 细胞的自发性 Ca²⁺ 瞬变。缩写：PKJ = 盆腔-肾脏连接部；PDGFRα⁺ = 血小板源性生长因子受体-α阳性。 请点击此处观看视频。（右键单击可下载。）

视频 2： 盆肾连接部振动切片中 GCaMP⁺ 平滑肌细胞的自发性 Ca²⁺ 瞬变。 请点击此处观看该视频。（右键单击可下载。）

视频 3： 肾髓质振动切片中 GCaMP⁺ PDGFRα⁺ 细胞的自发性 Ca²⁺ 瞬变。缩写：PDGFRα⁺ = 血小板源性生长因子受体-α阳性。 请点击此处观看该视频。（右键单击可下载。）

视频 4： 肾小动脉振动切片中低幅度 Ca²⁺ 瞬时活动。请点击此处观看视频。（右键单击可下载。）

讨论

肾小动脉（RP）由具有不同细胞密度的异质性细胞群体组成，在RP的不同区域可观察到细胞密度的差异。其中，PIC1细胞（先前称为ASMCs）在肾小动脉起搏区域（PKJ）中最为丰富，而起搏活动即起源于此²⁴。本文所述的实验方案使研究人员能够从小鼠肾脏的其余部分中分离出起搏区域。通过使用振动切片机对PKJ进行切片，可保持RP起搏区域（鉴定为附着于实质组织的肌性条带）的完整性，从而在结合细胞特异性荧光报告系统时，实现对RP起搏细胞的原位成像，以进行精确研究。

尽管该方法可为研究RP起搏活动提供新的见解，但实验人员应了解一些注意事项，以提高成像效果和切片效率。对于未经训练的操作者而言，这种PKJ分离与成像方法比传统的扁平状RP组织的锐性解剖更容易掌握。从完整肾脏中通过锐性解剖分离RP组织需要持续数周的练习，才能成功获得可用于生理学实验的活性组织。由于该振动切片机切片方案对锐性解剖技术要求较低，因此即使缺乏解剖其他平滑肌结构经验的操作者也可顺利开展该方法。

然而，本方案有一些关键要点需要注意。将肾脏成功粘附到振动切片机的样品板上需要熟练的操作技巧和耐心。如果肾脏方向放置不正确而偏向一侧，则会切出倾斜而非平直的切片。由于起搏区肾间质细胞（PKJ）结构精细，倾斜角度常常会破坏起搏区域的肌带结构。此外，倾斜切片的成像效果较差，因为细胞网络通常不在同一焦平面上，导致图像采集质量不佳。该操作还较为耗时，单个肾脏的切片过程往往需要长达一小时才能完成，在此期间需要持续监控设备运行状态。

尽管可以加快振动切片机的移动速度，但如果速度过快（超过方案推荐速度的>20%），刀片将撕裂而非整齐地切割肾脏组织，导致精细的肾小管连接段（PKJ）结构丢失。同样，切割速度过低也会导致切片边缘不平整。因此，优化切割速度和刀片振幅至关重要。在处理振动切片机所得切片时也必须格外小心。由于PKJ肌肉组织较为脆弱，在操作过程中容易受到破坏甚至撕裂。经过良好训练的操作者通常每4个肾脏切片可成功获取约1-2个适用于Ca²⁺成像实验的PKJ区域。通常，不符合Ca²⁺成像要求的PKJ切片具有以下特征：1）GCaMP表达水平过低；2）PKJ管壁扭曲变形；或3）PKJ管壁破裂。在数据分析时，每个视野（FOV）可采集约3-4个细胞进行分析。

尽管在PDGFRα-GCaMP6f和SMC-GCaMP3 PKJ切片的视野中存在许多细胞，但微小的组织移动常常导致部分细胞无法纳入分析。这一问题通常可通过应用图像稳定化处理方案予以解决。在组织样本保持不动的条件下，可从PDGFRα-GCaMP6f切片中采集至少3-5个细胞，从SMC-GCaMP3切片中采集5-6个细胞。通常情况下，从小鼠处死（小鼠最佳年龄为8-16周）到完成Ca²⁺成像实验所需时间为2-3小时；若在操作过程中需要时始终将组织置于冰浴溶液中孵育，则足以保证组织完整性。综上所述，本文介绍了一种振动切片机切割方案，用于从小鼠肾脏中制备完整的肾髓质细升支（RP PKJ）区域样本。该技术可保留肾髓质起搏区域，适用于在原位进行Ca²⁺成像研究，以探索肾髓质起搏机制。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
24孔培养板	ThermoFisher Scientific	142485	用于存放肾组织切片
35 mm × 10 mm 培养皿	Sigma Aldrich	CLS430165	肾组织切片钙成像用培养皿
48孔培养板	ThermoFisher Scientific	152640	用于存放肾组织切片
60 mm × 15 mm 培养皿	Sigma Aldrich	P5481	肾组织精细解剖用培养皿
吸水纸	Fisher Scientific	06-666A	在粘贴胶水前用于擦干肾脏表面
B6;129S-Gt(ROSA)26Sor/J	The Jackson Laboratory	13148	GCaMP3 小鼠
B6;129S-Gt(ROSA)26Sor/J	The Jackson Laboratory	24105	GCaMP6f 小鼠
B6.FVB-Tg(Myh11-cre/ERT2)1Soff/J	The Jackson Laboratory	19079	smMHC-CRE 小鼠
C57BL/6-Tg(Pdgfra-cre)1Clc/J	The Jackson Laboratory	13148	PDGFRa-CRE 小鼠
氰基丙烯酸酯胶水	Amazon	B001PILFVY	用于将肾脏固定在样品板上
乙醇	Phamco-Aaper	SDA 2B-6	用于解剖过程
超细波恩剪刀	Fine Science Tools	14083-08	用作内部解剖剪刀
精细剪刀	Fine Science Tools	14060-09	用作外部解剖剪刀
细尖镊子	Fine Science Tools	11254-20	用于肾脏的精细解剖
Gillette Silver Blue 双刃刀片	Amazon	B009XHQGYO	用于插入振动切片机的刀片夹持器
ImageJ	NIH		用于钙成像数据分析
异氟烷	Baxter	NDC 1001936060	用于麻醉
微型固定针（Minutien pins）	Fisher Scientific	NC9677548	将针剪成一半以缩短其长度
硅橡胶弹性体	Fisher Scientific	NC9285739	Sylgard 184
学生型 Adson 镊子	Fine Science Tools	91106-12	用于轻柔夹持和移动肾脏
学生型 Dumont 镊子	Fine Science Tools	91150-20	用作内部解剖镊子
Vannas 弹簧剪刀	Fine Science Tools	15000-03	用于分离后肾脏的精细解剖和修整
Vibrocheck	Leica	14048142075	可选组件，用于在切割过程中校准刀片运动
VT1200 S 振动切片机	Leica	14912000001	本实验方案使用配置1