蚊虫触角电生理记录技术分步指南

摘要

本文详细介绍了一种在多种蚊子（包括雌性和雄性）中成功获得低噪声触角电位图的逐步实验方案。

摘要

雌性蚊子是地球上最致命的动物，每年因它们在吸血过程中传播的病原体而导致超过100万人死亡。为了寻找宿主进行吸血，蚊子依赖多种感官线索，包括视觉、机械、热感应和嗅觉。本研究介绍了一种电天线图（electroantennography, EAG）技术，该技术可使研究人员评估蚊子是否能够以浓度依赖的方式检测单一化学物质及其混合物。当与气相色谱联用（GC-EAG）时，该技术可将蚊子触角暴露于完整的顶空/复杂混合物中，从而确定蚊子能够感知样品中所含的哪些化学成分。该方法适用于宿主体味、植物花香以及其他生态相关气味（如产卵地点的气味分子）。本文描述了一种可维持较长时间制备活性的实验方案，适用于多个属的雌性和雄性蚊子，包括伊蚊（Aedes）、库蚊（Culex）、按蚊（Anopheles）和巨蚊（Toxorhynchites）。由于嗅觉在蚊子与宿主的相互作用及蚊子生物学中起着关键作用，EAG和GC-EAG技术有助于发现可用于开发新型病媒控制策略（例如诱饵）的活性化合物。结合行为学实验，可进一步确定每种化学物质的作用性质（如引诱剂、驱避剂）。

引言

蚊子是地球上最致命的生物，每年导致超过百万人死亡，并使全球一半以上的人口面临被其传播的病原体感染的风险，这些风险主要通过叮咬传播¹。这类昆虫依赖多种线索（如热信号、视觉、机械刺激、嗅觉和听觉）来寻找宿主以获取食物（包括植物和动物来源），进行交配和产卵，并在幼虫和成虫阶段躲避天敌^2,3。在这些感觉中，嗅觉在上述行为中起着关键作用，尤其是在中远距离对气味分子的检测方面^2,3。宿主或产卵地点释放的气味由蚊子触须、喙器、跗节以及触角上分布的各种特异性嗅觉受体（如GRs、ORs、IRs）所识别^2,3。

由于嗅觉是蚊虫寻找宿主（植物和动物）、交配和产卵行为中的关键组成部分，因此成为研究蚊虫防控新工具的理想靶点⁴。目前关于驱避剂（如DEET、IR3535、避蚊胺）和引诱剂（如BG哨兵人诱剂）的研究十分丰富⁵，但由于当前蚊虫防控面临诸多挑战（如杀虫剂抗性、入侵物种扩散），亟需基于蚊虫生物学特性开发新的高效防控方法。

已有多种技术（例如嗅觉仪、着陆实验、电生理学）被用于评估化合物或化合物混合物在蚊子中的生物活性。其中，触角电位图（或触角电位图记录，EAGs）可用于确定气味物质是否被蚊子触角所检测。该技术最初由Schneider⁶开发，此后已广泛应用于多种不同昆虫属，包括蛾类^7,8,9、熊蜂^10,11、蜜蜂^12,13,和果蝇^14,15等。触角电位图技术也已在蚊子中采用多种不同实验方案进行应用，包括使用单根或多根触角的记录方法^{16,17,18,19,20,21,22,23,24,25}。

蚊子是体型相对较小且较为脆弱的昆虫，其触角较细。由于蛾类或大黄蜂等较大昆虫体型较大、触角较粗，对其进行触角电位图（EAG）记录相对容易，而对蚊子进行EAG记录则具有较大挑战性。特别是，保持良好的信噪比和持久的响应性制备状态，是确保数据可重复性和可靠性的两个主要要求。

本文提出的低噪声EAG逐步操作指南直接解决了这些局限性，使该方案适用于多个属的蚊虫物种，包括伊蚊（Aedes）、按蚊（Anopheles）、库蚊（Culex）和特蚊（Toxorhynchites），并描述了雌雄两性个体的操作技术。触角电位图（Electroantennography）提供了一种快速而可靠的手段，用于筛选和确定生物活性化合物，随后可通过行为学实验确定其效价，并进一步用于诱饵开发。

方案

1. 生理盐水溶液的配制

1. 提前配制生理盐水并保存在冰箱中。
2. 参照 Beyenbach 和 Masia²⁶ 的方法配制溶液。
   ​注意：生理盐水配方（单位为 mM）：150.0 NaCl、25.0 HEPES、5.0 葡萄糖、3.4 KCl、1.8 NaHCO₃、1.7 CaCl₂ 和 1.0 MgCl₂。用 1 M NaOH 将 pH 值调节至 7.1。此时不要添加葡萄糖或蔗糖以延长保存期限。在进行 EAG 实验前立即向生理盐水中加入所需量的葡萄糖（每次实验约 50 mL）。

2. 气味物质的制备与保存

1. 提前在1.5 mL棕色小瓶中配制好气味混合物或单一化合物的稀释液，并于-20 °C保存，以防止化合物降解。
   注意：浓度取决于所进行的实验类型。通常使用0.1%或1%浓度来判断化合物是否可被检测。若需绘制剂量-反应曲线，应配制某一化学物质的系列稀释液，并按从最低到最高浓度的顺序进行测试。
2. 根据待测化学物质的溶解度，使用水、乙醇、己烷、石蜡油或矿物油进行稀释配制。
3. 实验中务必准备溶剂对照组（即仅含溶剂的小瓶）。
4. 实验开始前30分钟将气味剂从冰箱中取出，使其充分解冻。使用前对每个小瓶进行涡旋振荡，确保化学物质与溶剂充分混匀。
5. 用移液器吸取10 µL溶液，滴加到已装入带标签玻璃注射器或巴斯德吸管内的滤纸条（0.5 cm × 2 cm）上。
6. 每种化合物或混合物应使用专用的巴斯德吸管或注射器，以避免交叉污染。
   注意：应在实验开始前10分钟完成加样，以便气味在注射器内充分扩散，但不宜放置过久以防化合物降解。加样后应立即将巴斯德吸管或注射器盖紧，以利于化学物质在实验开始前充分扩散。
7. 每次EAG记录结束后，应丢弃使用过的滤纸条并更换新的滤纸，以防止滤纸过度饱和而导致针头堵塞。针头应定期更换（每10次运行后更换一次）。

3. 蚊虫分离

1. 在实验当天分离蚊虫。
2. 实验当天应使用至少6日龄的蚊虫，以提高雌蚊已交配的可能性，从而增强其对宿主相关气味物质的反应能力。
   注意：根据具体研究项目调整实验时蚊虫的年龄。检查并统一蚊虫的生理状态（如是否吸血、是否饥饿、是否从未进食等）。
3. 在实验前将蚊虫饥饿处理最多12小时（即不提供糖源），以增强其取食动机和嗅觉敏感性。
4. 将蚊虫容器置于冰箱（4 °C）中，直至蚊虫停止飞行，以便用镊子轻柔地将个体转移至单独的杯子中。
   注意：对低温耐受性较强的蚊虫种类可使用CO₂麻醉垫进行麻醉。需确保蚊虫在麻醉垫上停留时间不宜过长，以防脱水，否则会影响蚊虫EAG（触角电位）记录的响应性。
5. 在进行EAG记录前，将装有单只蚊虫的杯子置于室温下保存，并丢弃当天无法使用的蚊虫。

4. 电极夹持器和毛细管的制备

1. 毛细管拉制、准备与储存
   1. 使用带丝的硼硅酸盐毛细管（内径：0.78 mm，外径：1 mm）。根据所用设备进行拉制²⁷。
      注意：将拉制好的毛细管存放在培养皿中。将培养皿放置在两块石蜡或无味油泥上，以防止毛细管移动和断裂。
   2. 在进行EAG实验前，在显微镜下用镊子轻轻折断两根毛细管的尖端。
      注意：确保其中一根略大于另一根，以便分别适配蚊子头部颈部（较大毛细管）或触角末端（较小毛细管）。确保切口平整，毛细管壁无裂纹。此步骤需要耐心和练习。
   3. 若毛细管仍完好，实验结束后用去离子水（DI水）冲洗并重复使用。用擦拭纸轻轻接触尖端以去除多余水分，然后放回储存用培养皿中。若尖端弯曲，请丢弃该毛细管。
2. 电极架与毛细管安装
   1. 使用不同颜色的实验室胶带将两个电极架分别标记为 "记录" 和 "参考"，以帮助指导蚊子头部和电极的安装。
   2. 确保电极架内部清洁，无硼硅酸盐碎屑残留。
   3. 氯化处理：将电极架的银丝浸入纯漂白剂中约5分钟，银丝颜色会从光亮的浅灰色变为哑光的深灰色。
   4. 松开橡胶塞，使用20号针头将10%生理盐水溶液注入毛细管内部。
   5. 用注射器将生理盐水溶液注入硼硅酸盐毛细管中。确保电极架和拉制毛细管内均无气泡。
      ​注意：为减少毛细管中产生气泡的可能性，可在缓慢抽出针头的同时持续推动盐水，并使用带丝的毛细管。也可使用由1:3电极凝胶与生理盐水混合的溶液填充毛细管。这有助于防止盐水蒸发，在学习和练习EAG实验时尤为有用，因为实验者需要更多时间完成各个步骤。
   6. 浸泡后，用去离子水冲洗银丝，并将其插入两个毛细管中。确保银丝尖端距离毛细管尖端小于1 mm。确保毛细管穿过电极架内部的橡胶环时未发生破裂。轻轻拧紧橡胶塞。确认无气泡存在。
   7. 将开口较宽的毛细管用于参考电极架（颈部），开口较小的毛细管用于记录电极架（触角）。
   8. 将安装好的两个电极架放置在湿润的擦拭纸上，防止尖端干燥，直至准备安装头部。

5. EAG 记录装置准备（图 1）

1. 确保气桌已开启，气路无堵塞。确保医用空气罐仍充满气体，以避免在实验中途更换。检查加湿器中是否有气泡产生。
2. 空气与脉冲输送系统
   1. 打开医用空气气罐。
   2. 检查两个流量计的读数。
      ​注意：控制整个实验过程中对样品持续供气的主气流流量计应设定为 140 mL/min，而用于气味脉冲的另一流量计应设定为 15 mL/min。
3. 若进行GC-EAD实验，需开启仪器、气体气罐，并创建或加载相应文件/方法。
4. 开启计算机、软件程序、阀门电源，并确认网络连接正常，以确保软件程序正常运行。
   1. 软件程序：可编写简短脚本以实现脉冲输送。
   2. EAG软件：可使用任意电生理学软件。
   3. 在软件中设置相关参数（例如放大器参数、记录时长、脉冲持续时间等）。
5. 输送一个对照脉冲，以确认脉冲输送阀门功能正常。
6. 将电源电压设定为 5.2 V，并核对放大器参数。
   注意：本实验所用数据的参数设置如下：高通滤波器为 0.1 Hz，低通滤波器为 500 Hz，增益为 ×100。

6. 蚊子头部制备与固定（图2）

1. 将铝板放在冰上，并在其上覆盖一块湿润的清洁湿巾。
2. 在角落处挤一小滴电极胶。
3. 将蚊子放入冰上的蚊子杯中，冷却数分钟，或直至其停止飞行。
   注意：某些蚊种具有耐寒性，可能需要在 CO₂ 通气垫上短暂麻醉才能使其静止。蚊子在冰或麻醉垫上停留的时间越短越好。
4. 将蚊子背朝上放置，用显微剪刀剪去每根触角的尖端（仅剪去末段的一小部分）。
5. 用镊子将蚊子拖至电极胶滴旁，轻轻将每根触角的尖端浸入胶中。避免将超过最末节的部分浸入电极胶。
6. 用镊子将蚊子的触角拉出，同时保持它们彼此靠近，使其一同从胶中伸出。确保触角不接触清洁湿巾表面，以免发生分离。
7. 将蚊子侧放，使用显微剪刀或剃刀片切断头部。
   注意：一旦切断头部，应迅速进行后续步骤并转移至EAG装置以开始记录。制备样本的反应性通常可维持约30分钟。
8. 取参考电极，轻轻将其尖端插入胶中，保持与颈部组织接触，并让头部附着在电极上。
9. 将电极支架移至EAG显微镜下，通过显微镜观察，将头部（即参考）电极固定在显微操作器上。确保触角位于中心位置。
10. 抓取记录电极，将其置于触角尖端前方。使用显微操作器将其尽可能靠近触角尖端进行移动和对齐。通过显微镜，将记录电极的尖端移向触角。
11. 在插入电极尖端前，先将两个电极支架连接至放大器，以防止插入后发生移动。
12. 将触角尖端插入记录电极中。确保它们仅与生理盐水和电极胶接触，并能通过毛细管透明观察到。触角通过"负压效应"进入电极。
13. 如有需要，可在显微镜下使用镊子调整头部和触角尖端的位置。
14. 将通气管靠近蚊子头部制备物（距离：1 cm）。
    注意：若头部脱落，请返回解剖台重新安装头部；若头部丢失或自切断起已超过5分钟，则需重新制备。毛细管与颈部/触角之间良好的连接对于低噪声和可靠的记录至关重要。理想情况下，插入后触角尖端应距离记录电极的金属丝不足1 mm。
15. 关闭光源（如使用了光源）。
16. 将真空管路置于蚊子头部制备物附近（距离：20 cm），并与主通气管对齐。
    ​注意：真空有助于在刺激后清除围绕头部制备物的化学物质，防止在脉冲施加后出现EAG反应。

7. 记录

1. 将触角尖端插入后，打开放大器和降噪器。观察基线信号，确保其无噪声。
   注意：检查电信号是否存在大幅振荡。根据需要调整头部和触角尖端的位置，直至信号清晰。使用鳄鱼夹将可能对法拉第笼或气浮台引入噪声的物体接地。基线信号振幅低于 0.01 mV 时，最适合检测和区分微小的EAG反应。
2. 当噪声水平达到满意后，将第一支待测气味物质的注射器插入气路孔中。
3. 关闭法拉第笼。请勿停留在记录装置前方，以减少噪声干扰。
4. 在EAG软件中点击“记录”。
5. 通过软件程序施加刺激脉冲。
   注意：脉冲的数量和持续时间根据实验而异。本实验中，每种气味物质使用单次1秒脉冲。不同气味物质之间间隔45秒。
6. 在实验记录本中记录蚊虫触角的反应。
   注意：若蚊虫触角检测到气味物质，则可在信号中观察到明显的偏转（见图3A）。
7. 继续测试下一个气味物质或浓度。除非进行剂量-反应曲线实验，否则务必随机化气味物质的呈现顺序。
   注意：实验中应使用阴性对照和阳性对照，以确保所观察到的反应确为嗅觉反应，而非机械或电噪声所致。
8. 记录结束后，施加阳性对照以验证触角仍具有反应性。
   注意：可使用0.1%或1%苯甲醛作为阳性对照，因为迄今为止测试的所有蚊虫种类均对此化合物有反应。
9. 继续进行下一个蚊虫样本的准备。

8. 清洁

1. 关闭放大器、降噪器、气管和计算机。
2. 将气味物质放回冷冻机。
3. 从玻璃注射器中取出滤纸，若管壁可见残留物，则用100%乙醇清洗。在清洁布上室温晾干过夜。
4. 用去离子水清洗电极架，以去除任何可能的盐迹。用清洁擦拭纸轻轻擦拭使其干燥。
5. 将蚊虫残体放入冰箱冷冻，并于24小时后处理。
   ​注意：若操作感染性蚊虫，须遵守所在机构的安全规定 机构

9. 数据分析

1. 手动或自动测量EAG反应。
   注意：此处测量的是EAG振幅（-mV）。若每种化合物施加了多个脉冲，则取平均值。根据所使用的软件不同，EAG信号可被自动检测和测量。然而，必须逐一检查每个反应，以确认反应波形，并评估可能存在的残留效应、延迟反应等情况。理想的EAG反应应与刺激脉冲同步，显示出清晰的偏转，并在不同蚊虫样本之间具有可重复性（图3）。
2. 展示原始数据，以体现变异度小、噪声低以及反应清晰（图3B）。
   注意：数据也可进行标准化处理（例如Z-score标准化）。可从反应值中减去阴性对照（如矿物油）的值（即基线值），若未减去，则应在图中单独呈现。同时应展示阳性对照结果。
3. 使用任意统计学软件进行统计分析²⁸。

结果

触角电位图是一种强大的工具，用于确定某种化学物质或化学物质混合物是否能被昆虫触角所检测。它还可通过逐步增加浓度（即剂量-反应曲线，图4B）来测定昆虫对特定化学物质的检测阈值。此外，该方法也适用于检测驱避剂对寄主相关气味反应的影响²⁹。

在EAG实验中应始终使用阳性和阴性对照。本实验中，苯甲醛被用作阳性对照（图3B、3C、4A）。迄今为止，该化合物已被发现可引发所有测试蚊种的触角反应^24,25,29。同时应使用阴性对照，可采用用于稀释化学物质的溶剂（如矿物油、石蜡油、正己烷等），且不应引发任何反应（图3B、<...

讨论

嗅觉介导的行为受多种因素影响，包括生理因素（如年龄、一天中的时间）和环境因素（如温度、相对湿度）³⁰。因此，在进行触角电位（EAG）实验时，必须使用处于相同生理状态的昆虫（即需监测其年龄、饥饿状态、交配状态）³¹，并保持制备样本周围温暖湿润的环境，以防止干燥。主气路的理想温度约为 25 °C，湿度应维持在 60% 至 80%。通过在主气路系统中安装一个气泡瓶即可轻松实现这一条件。

此外，必须考虑每种物种的生态特性，以获得与其生物学特性相关的实验结果。例如，若使用夜行性物种，可考虑颠倒其光周期，以检测其在主观夜间的行为反应。选择在一天中的特定时间（即昆虫活跃时段）进行触角电位（EAG）实验也非常重要。例如，若使用埃及伊蚊（Ae. aegypti），应考虑在该物种活动高峰期（即清晨和傍晚）开展实验。同样，可通过使用带有可编程定时器的气候箱或光照箱，设置反向光照程序，方便地调整光周期³²。Eilerts 等人

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
气浮台洁净工作台	TMC	https://www.techmfg.com/products/labtables/cleanbench63series/accessoriess	降噪装置
模数转换板	国家仪器公司	BNC-2090A
台式Flowbuddy Complete	Genesee Scientific	59-122BC	用于麻醉蚊虫
硼硅酸盐玻璃毛细管	Sutter Instrument	B100-78-10	用于制作记录电极和参考电极毛细管
化学试剂	Sigma Aldrich	苯甲醛：418099-100 mL；丁酸：B103500-100mL；1-己醇：471402-100mL；矿物油：M8410-1L	本实验所用化学试剂
二氧化碳	Airgas 或 Praxair	N/A	用于麻醉蚊虫
冷光源	Volpi	NCL-150
一次性注射器	BD	1 mL (309628)  / 3 mL (309657)
电极电缆	World Precision Instruments	5371
无盐电极凝胶	Parkerlabs	12-08-Spectra-360
法拉第笼	TMC	https://www.techmfg.com/products/electric-and-magnetic-field-cancellation/faradaycages	降噪装置
流量计	Bel-art	65 mm (H40406-0010) / 150 mm (H40407-0075)	每种各一个
气相色谱-质谱联用仪样品瓶及瓶盖	赛默飞世尔科技	2-SVWKA8-CPK	用于配制气味稀释液
玻璃注射器（Fortuna）	Sigma Aldrich	Z314307	用于向EAG样本递送气味
Humbug	Quest Scientific	http://www.quest-sci.com/	降噪装置
2 mm 窄型90度带导线插孔支架	A-M Systems	675748	电极固定装置
磁力底座	Kanetec	MB-FX	× 2
MATLAB + 工具箱	Mathworks	https://www.mathworks.com/products/matlab.html	用于产生脉冲信号
医用空气	Airgas 或 Praxair	N/A	用于主气路供气
显微镜	Nikkon	SMZ-800N
三轴粗/精调紧凑型显微操作器	Narishige	MHW-3	× 2
带前置放大器的微电极放大器	A-M Systems	Model 1800
蚊虫饲养用品	Bioquip	https://www.bioquip.com/Search/WebCatalog.asp
针头	BD	25G (305127) / 21G (305165)
巴斯德移液管	费希尔科学公司	13-678-6A	用于向EAG样本递送气味
不同直径的聚四氟乙烯（PTFE）管	Mc Master Carr	N/A	用于连接电磁阀、流量计、气路等
30V/5A 直流电源	Dr. Meter	PS-305DM
R 软件版本 3.5.1	R 项目	https://www.r-project.org/	用于数据分析
电磁阀继电器	N/A	定制
直径0.01”银丝	A-M Systems	782500
三位电磁阀	The Lee Company	LHDA0533115H
WinEDR 软件	斯特拉斯克莱德电生理学软件	WinEDR V3.9.1	用于EAG记录
沃特曼滤纸	Cole Parmer	UX-06648-03	用于将化学物质装入玻璃注射器或巴斯德移液管