本文详细介绍了一种在多种蚊子（包括雌性和雄性）中成功获得低噪声触角电位图的逐步实验方案。
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本文内容
摘要
摘要
雌性蚊子是地球上最致命的动物，每年因它们在吸血过程中传播的病原体而导致超过100万人死亡。为了寻找宿主进行吸血，蚊子依赖多种感官线索，包括视觉、机械、热感应和嗅觉。本研究介绍了一种电天线图（electroantennography, EAG）技术，该技术可使研究人员评估蚊子是否能够以浓度依赖的方式检测单一化学物质及其混合物。当与气相色谱联用（GC-EAG）时，该技术可将蚊子触角暴露于完整的顶空/复杂混合物中，从而确定蚊子能够感知样品中所含的哪些化学成分。该方法适用于宿主体味、植物花香以及其他生态相关气味（如产卵地点的气味分子）。本文描述了一种可维持较长时间制备活性的实验方案，适用于多个属的雌性和雄性蚊子，包括伊蚊（Aedes）、库蚊（Culex）、按蚊（Anopheles）和巨蚊（Toxorhynchites）。由于嗅觉在蚊子与宿主的相互作用及蚊子生物学中起着关键作用，EAG和GC-EAG技术有助于发现可用于开发新型病媒控制策略（例如诱饵）的活性化合物。结合行为学实验，可进一步确定每种化学物质的作用性质（如引诱剂、驱避剂）。
引言
蚊子是地球上最致命的生物，每年导致超过百万人死亡，并使全球一半以上的人口面临被其传播的病原体感染的风险，这些风险主要通过叮咬传播1。这类昆虫依赖多种线索（如热信号、视觉、机械刺激、嗅觉和听觉）来寻找宿主以获取食物（包括植物和动物来源），进行交配和产卵，并在幼虫和成虫阶段躲避天敌2,3。在这些感觉中，嗅觉在上述行为中起着关键作用，尤其是在中远距离对气味分子的检测方面2,3。宿主或产卵地点释放的气味由蚊子触须、喙器、跗节以及触角上分布的各种特异性嗅觉受体（如GRs、ORs、IRs）所识别2,3。
由于嗅觉是蚊虫寻找宿主（植物和动物）、交配和产卵行为中的关键组成部分，因此成为研究蚊虫防控新工具的理想靶点4。目前关于驱避剂（如DEET、IR3535、避蚊胺）和引诱剂（如BG哨兵人诱剂）的研究十分丰富5，但由于当前蚊虫防控面临诸多挑战（如杀虫剂抗性、入侵物种扩散），亟需基于蚊虫生物学特性开发新的高....
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方案
1. 生理盐水溶液的配制
- 提前配制生理盐水并保存在冰箱中。
- 参照 Beyenbach 和 Masia26 的方法配制溶液。
注意：生理盐水配方（单位为 mM）：150.0 NaCl、25.0 HEPES、5.0 葡萄糖、3.4 KCl、1.8 NaHCO3、1.7 CaCl2 和 1.0 MgCl2。用 1 M NaOH 将 pH 值调节至 7.1。此时不要添加葡萄糖或蔗糖以延长保存期限。在进行 EAG 实验前立即向生理盐水中加入所需量的葡萄糖（每次实验约 50 mL）。
2. 气味物质的制备与保存
- 提前在1.5 mL棕色小瓶中配制好气味混合物或单一化合物的稀释液，并于-20 °C保存，以防止化合物降解。
注意：浓度取决于所进行的实验类型。通常使用0.1%或1%浓度来判断化合物是否可被检测。若需绘制剂量-反应曲线，应配制某一化学物质的系列稀释液，并按从最低到最高浓度的顺序进行测试。 - 根据待测化学物质的溶解度，使用水、乙醇、己烷、石蜡油或矿物油进行稀释配制。
- 实验中务必准备溶剂对照组（即仅含溶剂的小瓶）。
- 实验开始前30分钟将气味剂从冰箱中取出，使其充分解冻。使用前对每个小瓶进行涡旋振....
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结果
触角电位图是一种强大的工具，用于确定昆虫触角是否能够检测到某种化学物质或化学物质的混合物。它还可用于通过逐步增加浓度（即剂量-反应曲线，图4B）来确定特定化学物质的检测阈值。此外，该方法可用于测试驱避剂对昆虫响应寄主相关气味的影响29。
在EAG实验中应始终使用阳性和阴性对照。本实验中以苯甲醛作为阳性对照（图3B、3C、4A）。已有研究表明，该化合物可引起迄今所有被测试蚊种的触角反应24,25,29。阴性对照同样需要使用，可采用用于稀释化学物质的溶剂（如矿物油、石蜡油、己烷等），且不应引发任何反应（图3B、.......
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讨论
嗅觉介导的行为受多种因素影响，包括生理因素（如年龄、一天中的时间）和环境因素（如温度、相对湿度）30。因此，在进行触角电位（EAG）实验时，必须使用处于相同生理状态的昆虫（即需监测其年龄、饥饿状态、交配状态）31，并保持制备样本周围温暖湿润的环境，以防止干燥。主气路的理想温度约为 25 °C，湿度应维持在 60% 至 80%。通过在主气路系统中安装一个气泡瓶即可轻松实现这一条件。
此外，必须考虑每种物种的生态特性，以获得与其生物学特性相关的实验结果。例如，若使用夜行性物种，可考虑颠倒其光周期，以检测其在主观夜间的行为反应。选择在一天中的特定时间（即昆虫活跃时段）进行触角电位（EAG）实验也非常重要。例如，若使用埃及伊蚊（Ae. aegypti），应考虑在该物种活动高峰期（即清晨和傍晚）开展实验。同样，可通过使用带有可编程定时器的气候箱或光照箱，设置反向光照程序，方便地调整光周期32。Eilerts 等人
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
感谢 Clément Vinauger 博士和 Jeffrey Riffell 博士提供的有益讨论。以下试剂通过 BEI 资源中心、NIAID、NIH 获得：Anopheles stephensi，STE2 品系，MRA-128，由 Mark Q. Benedict 提供；Aedes aegypti，ROCK 品系，MRA-734，由 David W. Severson 提供；Culex quinquefasciatus，JHB 品系，卵，编号 NR-43025。作者感谢 Jake Tu 博士、Nisha Duggal 博士、James Weger 博士以及 Jeffrey Marano 提供 Culex quinquefasciatus 和 Anopheles stephensi（品系：Liston）蚊卵。Aedes albopictus 和 Toxorhynchites rutilus septentrionalis 来源于作者在美国弗吉尼亚州新河谷地区采集的野外蚊虫。本研究得到生物化学系和弗拉林生命科学研究所的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 气浮台洁净工作台 | TMC | https://www.techmfg.com/products/labtables/cleanbench63series/accessoriess | 降噪装置 |
| 模数转换板 | 国家仪器公司 | BNC-2090A | |
| 台式Flowbuddy Complete | Genesee Scientific | 59-122BC | 用于麻醉蚊虫 |
| 硼硅酸盐玻璃毛细管 | Sutter Instrument | B100-78-10 | 用于制作记录电极和参考电极毛细管 |
| 化学试剂 | Sigma Aldrich | 苯甲醛：418099-100 mL；丁酸：B103500-100mL；1-己醇：471402-100mL；矿物油：M8410-1L | 本实验所用化学试剂 |
| 二氧化碳 | Airgas 或 Praxair | N/A | 用于麻醉蚊虫 |
| 冷光源 | Volpi | NCL-150 | |
| 一次性注射器 | BD | 1 mL (309628) / 3 mL (309657) | |
| 电极电缆 | World Precision Instruments | 5371 | |
| 无盐电极凝胶 | Parkerlabs | 12-08-Spectra-360 | |
| 法拉第笼 | TMC | https://www.techmfg.com/products/electric-and-magnetic-field-cancellation/faradaycages | 降噪装置 |
| 流量计 | Bel-art | 65 mm (H40406-0010) / 150 mm (H40407-0075) | 每种各一个 |
| 气相色谱-质谱联用仪样品瓶及瓶盖 | 赛默飞世尔科技 | 2-SVWKA8-CPK | 用于配制气味稀释液 |
| 玻璃注射器（Fortuna） | Sigma Aldrich | Z314307 | 用于向EAG样本递送气味 |
| Humbug | Quest Scientific | http://www.quest-sci.com/ | 降噪装置 |
| 2 mm 窄型90度带导线插孔支架 | A-M Systems | 675748 | 电极固定装置 |
| 磁力底座 | Kanetec | MB-FX | × 2 |
| MATLAB + 工具箱 | Mathworks | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | 用于产生脉冲信号 |
| 医用空气 | Airgas 或 Praxair | N/A | 用于主气路供气 |
| 显微镜 | Nikkon | SMZ-800N | |
| 三轴粗/精调紧凑型显微操作器 | Narishige | MHW-3 | × 2 |
| 带前置放大器的微电极放大器 | A-M Systems | Model 1800 | |
| 蚊虫饲养用品 | Bioquip | https://www.bioquip.com/Search/WebCatalog.asp | |
| 针头 | BD | 25G (305127) / 21G (305165) | |
| 巴斯德移液管 | 费希尔科学公司 | 13-678-6A | 用于向EAG样本递送气味 |
| 不同直径的聚四氟乙烯（PTFE）管 | Mc Master Carr | N/A | 用于连接电磁阀、流量计、气路等 |
| 30V/5A 直流电源 | Dr. Meter | PS-305DM | |
| R 软件版本 3.5.1 | R 项目 | https://www.r-project.org/ | 用于数据分析 |
| 电磁阀继电器 | N/A | 定制 | |
| 直径0.01”银丝 | A-M Systems | 782500 | |
| 三位电磁阀 | The Lee Company | LHDA0533115H | |
| WinEDR 软件 | 斯特拉斯克莱德电生理学软件 | WinEDR V3.9.1 | 用于EAG记录 |
| 沃特曼滤纸 | Cole Parmer | UX-06648-03 | 用于将化学物质装入玻璃注射器或巴斯德移液管 |
参考文献
- World Health Organization. World health statistics 2019: monitoring health for the SDGs, sustainable development goals. World Health Organization. , Geneva. (2019).
- Takken, W. The role of olfaction in host-seeking of mosquitoes....
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