声悬浮系统中非球形气泡振荡诱导的微流现象

摘要

提出了一种快速且可靠的控制单个被捕获声学气泡形状振荡的技术，该技术基于两个气泡之间的聚并方法。这种稳态、对称性可控的气泡形状振荡可用于分析气泡界面附近产生的流体流动。

摘要

当位于生物屏障附近时，振荡的微泡可增加细胞膜的通透性，从而促进药物和基因的内化。实验观察表明，这些屏障的暂时性通透可能源于空化微射流在细胞组织上产生的剪切应力。空化微射流是指在超声微泡周围产生的涡旋流动。要产生此类液体流动，微泡的振荡必须偏离纯粹的球形振荡，而包含平移不稳定性或形态模态。由于难以以稳定且可控的方式捕捉微泡的形变过程，针对微泡诱导流动及其在邻近表面产生剪切应力的实验研究通常受到限制。本文描述了一种用于研究对称性可控的非球形振荡的声悬浮腔的设计。这种控制是通过在足够强的超声场中使两个接近的微泡发生融合来实现的。对非球形振荡的控制为自由表面振荡微泡产生可控的空化微射流开辟了途径。高帧率相机能够近乎同时地在声学时间尺度上研究非球形微泡的动力学行为，以及在较慢时间尺度上研究液体流动。结果表明，可以产生多种多样的流体模式，并且这些模式与微泡界面的模态成分相关。我们证明，即使高阶形态模态，只要界面动力学中包含多个模态，也能产生远距离的流体模式，这凸显了非球形振荡在靶向和局部药物递送中的潜在应用价值。

引言

在医学领域，药物进入生物体后必须克服多种障碍，才能到达预期的靶点。然而，大多数药物会迅速从血液中被清除，导致靶向效率低下，且难以穿过细胞膜，从而造成药物递送效果不佳。目前，已有研究提出将微泡与超声技术结合，作为一种创新的非侵入性、精确且靶向性强的药物和基因递送方法，用于将药物和基因递送至病变组织和细胞¹。在此方法中，微泡可作为药物载体，游离药物可与气体微泡悬浮液共注射，或负载于微泡表面。微泡还可作为局部载体，用于重新聚焦超声能量，从而与细胞发生相互作用。基本原理是，在超声作用下，微泡稳定地压缩和膨胀，这一过程称为稳定空化，可产生液体流动，从而对邻近物体施加剪切应力。微泡也可能发生非线性振荡并持续膨胀直至破裂，进入惯性空化状态，产生从破裂点径向传播的冲击波²。研究表明，无论是稳定空化还是惯性空化，均可增强细胞膜的通透性，从而促进药物进入细胞内部³。

在治疗应用中，理解气泡与细胞相互作用的机制非常重要，但在科学和技术层面均存在若干障碍，阻碍了相关知识的进展。首先，捕捉细胞对气泡诱导的机械刺激所产生的动态响应极为困难⁴。在声学时间尺度上，微泡的一阶振荡可激活细胞膜通道，促进分子穿过生物界面。这一过程通过细胞膜的直接振荡实现，也称为“细胞按摩”⁵。通过膜片钳技术已证实，在超声暴露期间及之后，直接机械应力可导致通道激活，并测量了细胞膜的电生理特性⁶。在声学时间尺度上测量气泡诱导的细胞动态（即细胞膜形变的完整场），还可揭示诱导细胞膜形成孔隙所需的膜面积扩张阈值 ΔA/A⁷。第二个障碍是控制气泡的坍塌模式，以避免微泡引起的细胞裂解。气泡坍塌及其诱导的微射流已被确认为导致细胞膜穿孔的机制^8,9。一旦发生通透化，细胞膜可通过脂质双分子层的钙依赖性自封闭以及细胞内囊泡的融合实现修复⁹。气泡坍塌的发生也可能对细胞造成致命损伤，并对周围细胞引发不必要的副作用。在诸如超声介导的血脑屏障开放等敏感应用中，通常认为应避免发生惯性气泡坍塌¹⁰。

因此，目前人们正投入大量努力来设计超声发射序列，并结合被动空化监测与控制，以确保微泡的稳定振荡¹¹。在这一稳定状态下，已有研究假设，稳定振荡的微泡通过在细胞膜上产生空间靶向的剪切应力，在触发膜通透化过程中起着重要作用⁷。这种剪切应力源于振荡微泡附近液体流动所产生的力。这些液体流动称为空化微流（cavitation microstreaming），如上所述，它是导致细胞对外源分子摄取增强的多种可能机制之一。在处理含有气泡或细胞的悬浮体系时（例如体外生物转染实验¹²），通过微流实现的通透化可能比通过气泡破裂实现的通透化更为高效。这一点可通过简单的几何分析加以说明。在细胞悬浮液中，若大多数悬浮细胞受到足够强的机械作用（从而导致膜通透化），则声致穿孔将更为有效。已知气泡破裂的方向通常沿着各向同性对称性破缺的方向，例如气泡-壁面轴线¹³，或连接气泡-气泡以及气泡-细胞质心的连线方向¹⁴。因此，所产生的微射流是一种沿有限数量连接气泡与细胞中心连线方向上的空间局域现象。根据细胞和气泡的浓度以及气泡与细胞之间的距离，该效应可能并非对所有悬浮细胞实现通透化的最有效方式。相比之下，空化微流是一种发生在较慢时间尺度上的现象，其空间扩展范围远大于气泡半径。此外，液体流动围绕气泡均匀分布，因而可在很长的作用距离上影响更多的细胞。因此，理解振荡气泡周围所产生的空化微流，是控制和量化气泡诱导施加于细胞上的剪切应力的前提条件。

为此，一个初步步骤是控制超声驱动气泡的球形和非球形振荡，因为所产生的液体流动是由气泡界面的运动所引发的^15,16。特别是，必须激发并维持微气泡的形态振荡。此外，还需控制气泡形态振荡的方向，以便准确分析气泡界面动力学与所诱导的微流模式之间的相关性。综观现有文献可知，目前关于空化诱导微流的详细实验结果仅适用于附着在表面的气泡。在超快显微系统下，附壁微气泡常用于在微米尺度上精确评估界面动力学及细胞相互作用。当考虑位于细胞膜上的振动微气泡时，该构型在治疗上具有相关性^17,18,19。然而，对基底附着气泡的研究可能使气泡动力学分析更加复杂，部分原因在于接触线动力学本身的复杂性²⁰，以及非对称形态模式的激发²¹。在医学和生物学应用中，未附着于壁面的气泡通常存在于小血管等受限几何结构中。这会显著影响气泡动力学和形态不稳定性。特别是，邻近壁面的存在会根据形态模式阶数和气泡尺寸，将激发形态模式所需的压力阈值降低²²。壁面还会影响气泡诱导的微流，可能导致产生的流动强度更高²³。

在微泡可能经历的所有场景中（自由状态或附着状态、靠近壁面、发生崩溃或稳定振荡），我们拟研究远离任何边界的单个气泡的非球形动力学行为。实验装置基于一种声悬浮系统²⁴，利用驻立超声波捕获气泡。该场景与医学应用中的情况一致，例如在声转染腔室内悬浮的气泡与细胞共存的情形。只要气泡与细胞之间距离足够远，可认为细胞的存在不会影响气泡界面的动力学行为。当细胞跟随空化诱导的微流呈现环状轨迹运动时，会周期性地接近和远离气泡位置，此时可假设细胞的存在对微流模式及其平均流速均无显著影响。此外，远离边界的单个气泡的非球形动力学及其诱导的微流在理论上已有较为深入的研究。为了将气泡诱导的液体流动与气泡轮廓动力学关联起来，需要精确表征气泡界面的动力学特性。为此，在实验研究中宜根据治疗应用中的参数调整时空尺度，以便使用较大尺寸的气泡并在较低频率下激发，从而能够利用常见的高速相机（帧率低于100万帧/秒）实现有效观测。对于无包膜气泡，特定模态n的固有频率ω_n与气泡尺寸的关系为²⁵。当考虑带壳气泡时，该半径-固有频率关系略有修正²⁶，但固有频率ω_n的数量级基本保持不变。因此，在30 kHz超声场中研究平衡半径约为50 μm的气泡，相当于Dollet等人²⁷所提出的在1.7 MHz声场中研究半径约为3 μm的包膜气泡。预期将观察到相似的形态模态数，因而产生类似的微流模式。

为了激发气泡界面的非球形振荡，必须超过一个与半径相关的特定压力阈值，如图1所示。现有的实验技术依赖于增加声压以激发表面振荡模式（如图1中的路径(1)所示），可通过逐步增加压力²⁸，或采用调制振幅激励以周期性地启动和终止表面模式²⁹。这些技术的主要缺点包括：(i) 表面振荡的对称轴方向随机，无法控制其位于成像平面内；(ii) 气泡形状振荡的寿命较短，使得在较长时间尺度下难以分析其诱导的液体流动；(iii) 经常激发不稳定的形状模式。我们提出一种替代技术，即在半径-压力图中保持声压恒定的情况下跨越压力阈值，如图1中的路径(2)所示。为此，需要增大气泡尺寸，使其进入不稳定区域。这种尺寸增大通过气泡融合技术实现。该方法利用两个初始呈球形振荡的微气泡的融合，生成一个单一的变形气泡。若融合后气泡的声压和尺寸处于不稳定区域内，则可激发表面振荡模式。我们还证实，融合技术可在稳态条件下诱导稳定的形状振荡，并使对称轴方向由两个气泡直线趋近的运动方向所控制。由于稳定的形状振荡可持续数分钟，因此可通过在液体介质中加入荧光微粒，并用薄层激光照射，来分析气泡诱导的流体流动。记录固体微粒在气泡界面附近的运动，可识别出诱导流体流动的模式³⁰。气泡形状振荡的触发及其产生时间稳定的流体流动的整体原理如图2所示。

在以下实验方案中，我们概述了通过聚并技术产生稳定气泡形态振荡所需的操作步骤，并描述了流体流动的测量方法。内容包括声悬浮系统的设计、声学校准、气泡成核与聚并技术、气泡界面动力学及周围流体流动的测量，以及图像处理。

方案

1. 声悬浮腔的设计

1. 使用多物理场仿真软件的几何模块设计一个光学透明（类似PMMA）的立方水箱（边长8 cm，每个面厚度2.8 mm）（材料表）。
2. 在水箱底部中心插入一个圆柱面（Ø = 35 mm），用于模拟超声换能器。
3. 设置边界条件：水箱各壁面压力为零，在换能器表面施加振幅为1 µm的法向位移。
4. 使用频域模块，在频率范围[10 - 40] kHz内，对水箱在三个任意位置 loc1 = (0.01375, 0.01375, 0.04125)、loc2 = (0, 0, 0.0088) 和 loc3 = (0.021725, 0.023375, 0.00935) 处的频率响应函数（FRF）进行仿真。
5. 调整水箱尺寸，使腔体的一个声学模式对应于换能器的标称频率（此处为31.2 kHz）。因此，频率响应函数中将出现一个接近该频率的共振峰，如图3所示。
6. 绘制水箱内部的压力场分布，如图4所示。所选的共振模式必须在容器内部至少包含一个压力波腹，以便捕获声学气泡。
7. 设计水箱时，设计一个可在每条边缘带有导向槽的可移动顶面，以紧密闭合水箱各面。在顶面钻一个微小孔洞，用于注入液体介质。
8. 将水箱放置在一个自制支架上，支架内包含超声换能器（兰杰文型，标称频率31.2 kHz）。使用超声耦合凝胶将换能器与水箱底面耦合。
9. 将水箱与支架系统放置在一个配备微调螺钉的三维位移平台上。
10. 用水箱注入微滤、去矿物质但未脱气的水（体积约500 mL，溶解氧饱和度约为8 mg·L^-1）。
    ​注意：使用未脱气水而非脱气水可使气泡在实验期间保持稳定。即使存在一定程度的整流扩散（超声介导）补偿，使用脱气水仍会因气体扩散而加速气泡缩小。

2. 气泡生成与声学校准

1. 准备用于激光诱导气泡成核、声学激励和高速记录的实验装置（图5a、b、c）。该实验装置包括：(A) 声悬浮系统，(B) 激光电源，(C) 激光头，(D) 一个球面凹透镜，(E) 一个平凹透镜和一个非球面透镜，(F) 高速相机，(G) 连续发光二极管。随后，在进行液体流动测量时（图5d），将增加：(H) 一个连续波激光源，(I) 一个圆柱形平凹透镜，后接另一个插入在第一透镜后方且沿正交轴取向的圆柱形平凹透镜。
2. 将超声换能器连接至函数发生器。设置激励信号为：正弦波形、连续波、频率31.2 kHz。振幅是唯一的可变参数。
3. 将透镜 (D) 放置在激光头 (C) 前方约6 cm处。
4. 将透镜 (E) 放置在透镜 (D) 前方约12 cm处。
5. 放置水箱 (A)，使激光的聚焦点位于水箱内部，从而在每次激光脉冲（5–10 mJ）时产生火花。激光火花应位于目标声压波腹下方约3 cm处。
   注意：在无超声（US）条件下，由激光成核的气泡会因浮力上升至顶部表面。
6. 开启超声换能器。逐渐增加施加电压，直至气泡不再垂直上升，而是向声压波腹偏转，并在足够高的压力下被俘获。
7. 设置背光照明（连续发光二极管）和高速相机，以观察被俘获的气泡。
   注意：当使用激光火花成核新气泡时，容易捕捉到气泡接近其俘获位置的运动轨迹。
8. 在水箱内移动激光火花的位置，使气泡轨迹保持在相机的焦平面内。
9. 俘获一个气泡，并以以下参数记录其径向振荡：帧尺寸128 × 128像素，采集速率180 kHz。图6展示了两个声学周期内大幅值径向振荡的示例。典型的气泡尺寸范围为30至80 µm。
10. 记录3至30毫秒内的气泡径向振荡，以捕捉数百至数千次气泡振荡。对换能器施加的电压逐步增加，重复此记录过程。典型的施加电压范围为0–8 V。
    注意：当改变施加电压时，被俘获气泡的平衡位置会轻微发生垂直移动。为在不移动背光照明和相机的情况下持续跟踪振荡，请将系统（换能器和水箱）置于具有微米级精度的三向可移动平台上。
11. 开启超声换能器，并拍摄一张背景图像用于后期分析。
12. 按照以下步骤对视频序列进行后处理：
    1. 运行可执行文件 VoltagePressure.exe，应打开如图7所示的界面。
       注意：该脚本作为补充材料提供。
    2. 在左侧列中设定物理和实验参数（图7A）。
    3. 在右下角表格中设定一系列记录所对应的施加电压值（图7B）。
    4. 在气泡半径分析面板中，点击加载参数（图7C），选择包含所有视频文件的文件夹，然后选择背景图像（必选）。
    5. 可选择点击自动一次性分析所有视频，或点击逐步逐个分析。
    6. 对于每个视频文件，绘制一个声学周期内气泡半径的变化曲线，并叠加数值拟合结果。红色曲线对应线性化的Rayleigh-Plesset模型。显示平衡气泡半径（图7D）。
    7. 根据数值拟合结果，在压力（电压）图面板中显示对应此电压的施加压力（图7E）。施加压力值也显示在右下角表格中（图7B）。对应0–8 V电压动态的典型施加压力范围为0–25 kPa。
    8. 处理完所有视频后，点击线性回归按钮，对压力/电压曲线进行线性拟合。数据（电压和压力值）将保存至当前目录下的一个.txt文件中，并给出拟合斜率。

3. 融合技术

1. 开启超声换能器。根据不稳定性区域的数值压力/半径图（如图8所示），将施加的电压设置得足够高，以使相应的声压能够触发表面不稳定性。
2. 产生一个气泡，该气泡随后将迁移至其捕获位置。如果被捕获的气泡仅表现出球形振荡，则进入下一步。如果出现非球形振荡：
   1. 关闭超声功率，使气泡上升至顶部表面。
   2. 调节激光能量（通过精细调节几毫焦耳）或降低换能器电压。
   3. 重新开启超声功率。
   4. 产生一个新的气泡。
   5. 重复此过程，直至气泡尺寸导致完全为球形振荡。
3. 当被捕获的气泡仅表现出球形振荡时，产生一个新的激光火花。当新气泡到达捕获位置时，发生融合。
4. 如果融合后的气泡仅表现出球形振荡，则继续生成新的气泡。可能需要多次融合才能达到出现非球形形变时的气泡半径。气泡融合导致非球形振荡的一个示例如图9所示。
5. 一旦融合后的气泡表现出非球形振荡，记录气泡振荡过程，持续时间约为3至30毫秒。
6. 通过参考图10，确定形状振荡的模态数。

4. 流体流动测量

1. 在进行空化微流测量时，必须在气泡成核之前将荧光示踪粒子加入水中。本研究中使用0.71 µm的粒子（材料表）。这些粒子足够小，可实现声学透明（不受声辐射力影响），并能准确跟随流体流动；同时又足够大，能够有效散射激光。对于水箱体积，使用三滴，相当于约2.10⁴ 粒子/mm³。
2. 在开始测量前，设置以下参数，以同时捕获（快速时间尺度）气泡动力学和（慢时间尺度）流体流动：
   1. 对相机记录磁盘进行分区。
   2. 或者定义如下记录参数：
      1. 帧率180 kHz，帧尺寸128 × 128像素，曝光时间1 µs，用于记录气泡界面动力学的一次拍摄
      2. 帧率600 Hz，帧尺寸1024 × 768像素，曝光时间1 ms，用于记录染料示踪剂运动的一次拍摄。
3. 使用连续激光器。
4. 通过使激光束依次穿过柱面平凹透镜和正交轴向布置的柱面平凸透镜，生成薄片状激光光面。可获得约160 µm的光束宽度。
5. 设置激光片层与成像平面一致：
   1. 将激光器安装在可移动装置上，以便激光片层可平行于成像平面移动。
   2. 调节位置，使相机能够观察到被照亮的粒子。
   3. 成核并捕获一个气泡。
   4. 进一步调节激光片层的位置，使气泡后方出现可见阴影。此时气泡已位于激光片层内部，如图11所示。
6. 诱导气泡聚并，直至出现稳定振荡的形态模式。
7. 交替进行多次气泡动力学与微流记录。
   ​注意：在不需要时关闭连续激光器。加热可能引发不必要的对流流动。此外，在进行流场测量时应关闭发光二极管。

5. 图像处理以可视化空化微流模式

1. 安装基于 Java 的图像处理与分析可视化软件 ImageJ。同时安装 CINE 文件读取插件，以便打开高速相机文件。
2. 点击 文件 | 导入 | Cine文件，并选择包含粒子运动记录的视频文件 *.cine。
3. 在新窗口中选择 使用虚拟堆栈，视频现在已加载。
4. 为了在不显示流动模式的情况下观察粒子运动，点击 图像 | 调整 | 亮度/对比度 | 自动。此时暗背景将被自动优化后的图像替代。
5. 为了显示最终的流动模式，点击 图像 | 堆栈 | Z 投影，并为图像投影选择“最大强度”选项。系统将显示一幅输出图像，其中每个像素取自堆栈中所有图像对应位置的最大值。如有需要，可按照步骤 5.4 所述调整图像对比度。
   注意：可获得如 图 12b 和 图 12d 所示的流动模式。

结果

气泡聚并全过程导致的时间稳定、对称性可控的非球形振荡序列如图9所示。两个球形振荡气泡的接近阶段在两者之间的液膜破裂时结束。值得注意的是，在聚并前的最后阶段，气泡界面已偏离球形。两个气泡均沿直线接近路径方向拉伸，呈椭球形。聚并发生后，形成单个气泡，并在数个声学周期内表现出具有复杂形状的非球形振荡。这对应于任何动力系统受激发后所经历的瞬态振荡阶段。经过十几个至一百个声学周期后，形状振荡进入稳态，呈现稳定的振荡模式，此处所示为模式4，可通过图10的解读得出。该振荡模式可持续数千个声学周期，持续时间为数毫秒至数分钟。这使得对气泡诱导液体流动的准同时测量成为可能。

当气泡被捕获并表现出稳定的形状振荡时，可捕捉到其附近荧光示踪粒子的运动，如图11所示。首先，对于仅表现出球形振荡的气泡，其...

讨论

本方案通过气泡聚并来激发稳态、对称性可控的气泡形状振荡，从而研究这些振荡所诱导的长期流体流动。该技术的主要挑战在于，如何控制被俘获气泡（远离任何边界）的非球形振荡。

文献中提出的大多数现有技术集中于基底附着气泡^7,16，因为气泡中心无运动，使其在声学时间尺度（高达数百kHz）下更容易捕捉其界面。尽管在此情况下超过触发形变模式所需的压力阈值相对容易，但由于基底引起的对称性破坏，形变振荡的控制变得复杂。壁面附着气泡以特定的接触角与基底接触，导致非对称表面模式被激发²¹。除了仅通过单个相机视角解释三维非对称模式的复杂性外，系统还会突然过渡到混沌的表面振荡状态³³。因此，主要挑战在于捕捉远离任何边界的单个被捕获气泡的形变振荡，以实现轴对称的非球形振荡。此类条件使得实验结果能够与文献中大量可用的理论研究进行比较。主要的实验难点在于微气泡的位置稳定性。为克服这一问题，已有研究采用光镊...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
非球面透镜	Thorlabs	AL4050	焦距 40 mm 的透镜
连续波激光源	CNI	MLL6FN	波长 532 nm、能量 400 mW 的 DPSS 激光器
柱面平凹透镜	Thorlabs	LJ1277L1-A	焦距 -25.4 mm 的透镜
柱面平凹透镜	Thorlabs	LK1900L1	焦距 250 mm 的透镜
荧光微粒	Duke Scientific	R700	红色聚合物荧光微球
函数发生器	Agilent	HP33120	为超声换能器提供信号的函数发生器
高速相机	Vision Research	Phantom v12.0	最高录制速度达 1 Mfps 的高速记录设备
液体介质	Carlo Erba	Water for analysis	去矿物质化、未脱气的水
多物理场仿真软件	Comsol	None	用于模拟声悬浮腔声场的软件
Nd:Yag 脉冲激光器	New Wave Research	Solo III-15	脉冲持续时间 5 ns，λ=532 nm，光束直径 3.5 mm，能量最高达 50 mJ
平凹透镜	Thorlabs	N-BK7	焦距 125 mm 的透镜
球面凹透镜	Thorlabs	N-SF11	双凹透镜，焦距 -25 mm
超声换能器	SinapTec	Custom-made	标称频率 31 kHz，有效面积直径 35 mm
可视化软件	NIH	ImageJ	基于 Java 的图像处理与分析软件
XY 轴线性位移台	Newport	M-406	带微米级螺杆的位移平台
Z 轴线性位移台	Edmund Optics	62-299	带微米级螺杆的垂直位移平台