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记录哺乳动物精子细胞质膜上的电流传导

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DOI：

10.3791/62049

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2021年2月14日

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1Department of Molecular and Cell Biology, University of California, Berkeley, 2Department of Neurobiology, Peking University, 3Institute for Biology II / Chemosensation Lab, RWTH Aachen University, 4Research Training Group 2416 MultiSenses-MultiScales, RWTH Aachen University, 5Howard Hughes Medical Institute, Janelia Research Campus, 6Department of Physiology, University of California, San Francisco

本文内容

摘要

本方案描述了如何在全细胞构型下对哺乳动物精子细胞进行电生理记录，旨在直接记录离子通道的活性。该方法在描述多种精子离子通道的电生理特性方面发挥了重要作用，并有助于揭示其分子身份及调控机制。

摘要

记录哺乳动物中最微小的细胞之一——精子细胞的电活动，数十年来一直是电生理学家面临的一项挑战。2006年，一种名为“精子细胞膜片钳技术”的方法被提出，该方法实现了在全细胞和细胞附着构型下直接记录离子通道的活性，对于阐明精子细胞的生理特性以及多种钙、钾、钠、氯和质子离子通道的分子身份起到了关键作用。然而，对单个精子细胞进行记录需要电生理学方面的高级技能和专门训练。本详细实验方案系统总结了操作的各个步骤，并强调了若干关键技术要点，旨在使任何希望探索精子细胞迷人生理特性的研究者都能掌握该技术。具体而言，本方案描述了人和小鼠精子细胞的记录方法，但原则上可适用于几乎所有哺乳动物物种的精子细胞。方案涵盖了该技术应用中的多个重要细节，包括精子细胞的分离、试剂与设备的选择、高度运动性细胞的固定、记录电极与精子细胞质膜之间形成高阻封接（吉欧姆封接）、转入全精子细胞模式（即破膜进入），以及来自六种哺乳动物物种的精子细胞钙离子通道CatSper的典型记录实例。文中还讨论了精子膜片钳技术的优势与局限性，并指出了最关键的实验步骤。

引言

与厄温·内尔（Erwin Neher）和贝尔特·萨克曼（Bert Sakmann）发明的传统膜片钳技术1类似，精子细胞膜片钳技术能够检测单个离子通道的活性，同时也能记录单个细胞内全部离子通道群体的活动2,3。该方法可在不同程度上脱离细胞内酶促过程的干扰，从而鉴定特定类型的离子通道。该技术对于基于离子通道的电生理学和药理学特征来确定其活性至关重要，因此提供了一种可靠的鉴定策略。该方法的局限性在于无法检测非生电性转运体。此外，具备基础的电生理学训练有助于理解该实验方案中的细微之处。为了掌握膜片钳技术并将其应用于哺乳动物精子，我们建议学习基础膜片钳文献4,5。本文提供了一个详细的逐步操作流程，并强调了一些独特的实践要点，使该技术更易于理解，便于所有希望开展精子细胞电生理学研究的人员使用。

离子稳态是精子细胞的一项重要生理功能，主要依赖离子通道和离子转运蛋白来维持生理上重要的离子梯度，调节细胞内钙离子浓度，并改变跨膜电位。离子通道和离子转运蛋白调控着精子细胞的多种基本功能，例如运动能力、在雌性生殖道中的定向迁移、精子成熟过程，以及在海洋生物中向卵子的趋化性6,7,8,9,10,11,12。精子运动能力是一个逐步获得的过程。在睾丸中成熟期间以及随后通过附睾的过程中，精子细胞主要处于静息状态。其运动能力受到酸性附睾环境的抑制，该环境导致精子细胞内酸化。由于轴丝在pH低于6.0时无法正常运作，因此其功能受到损害13,14。然而，当暴露于精液或更偏碱性的环境时，精子细胞内的离子浓度和胞质pH会发生显著变化，精子从而获得运动能力15,16,17。精子鞭毛的运动由ATP水解提供能量，以支持轴丝微管的滑动18，该过程对pH高度依赖14。此外，鞭毛运动还受到鞭毛内钙离子和cAMP浓度升高的调控13,19,20,21,22,23,24。这些因素，即精子细胞内钙离子浓度[Ca2+]i、pH、ATP和cAMP，是调控运动能力变化的主要机制，其浓度受到精子离子通道和转运蛋白的严格调控。

精子细胞具有独特性，其表达多种在体内其他部位均不存在的蛋白质。典型的例子是精子离子通道，例如钾离子通道Slo3。25,26,27,28,29 以及 猫离子通道 精子m，CatSper2,30,31,32后者是哺乳动物精子的主要钙离子通道31，并受细胞内碱化调节2,30,31,32,33,34CatSper 还受到物种特异性信号的调控7,35 并沿精子鞭毛以四边形纵向纳米结构域的形式排列36,37,38在灵长类动物中，CatSper 通道由多种因素共同激活 鞭毛碱性，膜去极化 和孕酮3,39,40,41，而对于 小鼠 CatSper 激活 孕酮不是必需的2,39该通道的另一个特定特征是其多亚基结构：CatSper 是由至少 10 种不同亚基组成的复合物31,32,34,37,38,42,43,44,45,46,47如此复杂的结构及其调控机制的特异性，阻碍了CatSper在任何已知异源表达系统中的重组表达，因此对CatSper的生理学表征一直局限于其天然表达系统——精子细胞。尽管如此，CatSper蛋白的分子表征已于2000年由D. Ren等人在一篇具有里程碑意义的论文中实现。31，证明CatSper是其最终证据的 真正有效的 只有在2006年引入精子膜片钳技术后，离子通道的研究才成为可能2自那时起，该技术使得对精子细胞中多种离子传导通路的精确表征成为可能9,28,37,39,40,44,46,48-54.

研究离子通道特性的经典且最直接的方法——膜片钳技术——曾被认为不适用于精子细胞，原因在于其运动性及特殊的形态结构（图1A）。具体而言，精子细胞质体积极小，且精子质膜紧密附着于纤维鞘和 细胞核等刚性细胞内结构，这是主要的技术难点55。这两种结构特征使精子呈现细长的箭形，能够在不引起质膜显著变形或损伤的情况下，穿透卵子保护层等高黏性环境。

膜片钳技术的第一步是 在记录电极（玻璃微电极）与细胞质膜之间形成紧密密封。为了实现这一点，必须将足够量的质膜吸入记录电极内，使质膜与玻璃之间形成机械稳定的吉欧密封（gigaseal）。质膜必须具有足够的柔韧性而非刚性（图1B）。如上所述，精子质膜的整个表面通常紧密结合，仅有一个称为胞质滴（cytoplasmic droplet）的区域例外（图1A 和 图2）。因此，精子质膜的刚性曾被认为是形成紧密密封（即“吉欧密封”）的主要障碍，该密封名称的由来是因为良好的记录需要达到超过>109 欧姆的电阻。然而，2006年精子膜片钳技术的引入2克服了这一障碍，该方法已成功应用于多种哺乳动物的精子细胞2,41,51,56。这一突破的关键在于聚焦于胞质滴（CD）2,8——一种位于精子中段的小型结构（图1A 和 图2），实际上是拉长型精子细胞（spermatid）的残余部分，而精子细胞正是发育形成精子头部和尾部的前体细胞。从功能上看，胞质滴可能有助于精子在射精过程中适应细胞外渗透压的变化。其重要特征在于，胞质滴区域的质膜具有足够的柔韧性，可被吸入电极内以形成吉欧级密封。因此，精子胞质滴是精子表面最适宜实现成功吉欧密封并过渡到全细胞模式的部位，从而最终将精子细胞与膜片钳放大器实现电学连接2,8。值得注意的是，先前已有文献报道可在精子头部成功形成吉欧密封，从而实现细胞贴附式记录（cell-attached configuration）54,57,58,59。然而，截至目前，全细胞记录模式下的成功记录仅在胞质滴区域形成吉欧密封后实现。全细胞模式使得能够电学访问精子细胞的全部容积，因而可检测位于精子鞭毛以及精子头部的离子通道活性。自该技术建立以来短短数年间，精子膜片钳技术已极大推动了我们对精子离子通道的理解，至今仍是直接研究精子离子通道功能的最可靠技术之一9,28,37,39,40,44,46,48,49,50,51,52,53（图1）。

精子膜片钳技术在某些细节上与经典膜片钳技术有所不同，如下所述。首先，精子质膜的大部分区域紧密附着于刚性的细胞内结构，因此精子几乎没有"多余"的质膜可被吸入移液管中。唯一具有弹性的区域是颈段（CD）的膜，其性质类似于多种体细胞的质膜，因此可较容易地被吸入移液管内。为了在CD区域形成吉欧姆密封，需在移液管顶端施加轻微负压，以将一小部分精子质膜吸入微移液管尖端（图1B）。这部分膜在移液管尖端内形成Ω形内陷，并与其内壁形成紧密密封。

其次，人和小鼠精子中的胞质滴直径在1至2 µm之间（图1 和 图2）。因此，对如此微小结构应用膜片钳技术需要高分辨率的光学系统。大多数精子膜片钳装置配备的是带有微分干涉差（DIC）或诺马尔斯基（Nomarski）光学组件的倒置显微镜（图2 和 图3）。建议优先使用配备DIC光学系统的显微镜进行精子膜片钳实验，而非更传统的相差显微镜，因为DIC提供的空间信息有助于更精确地将膜片钳电极定位到微小的胞质滴上。我们还建议使用60倍水浸物镜或类似镜头，数值孔径为1.2。该物镜具有较长的工作距离（0.28 mm），可实现对溶液中自由游动精子细胞的观察（图2）。该物镜还配有校正环，可调节以适应盖玻片的厚度（范围为0.13至0.21 mm）。这种长工作距离与校正环的组合，使得能够透过两层0.13 mm的盖玻片进行观察：其中一层盖玻片作为记录室的玻璃底，另一层5 mm的盖玻片则放置在上方，其表面附着有精子细胞。如下文所述，将精子细胞沉积在可方便更换的圆形5 mm盖玻片上，而不是直接沉积在记录室底部，是一种将新鲜精子细胞装入记录室的便捷方法。

第三，精子膜片钳装置必须配备低噪声膜片钳放大器和数据采集器，以记录微小（皮安级别）的电信号电流以及膜电位的细微变化。该设备必须确保放大器噪声处于最低水平。无振动环境是成功进行膜片钳记录的关键要素。精子膜片钳实验需要使用无漂移的精密显微操作器，并通过显微操作器平台将其固定在倒置显微镜上，以实现比独立显微操作器支架更佳的稳定性（图3A）。为测试装置稳定性，在防振台附近有人在地面上跳跃时，在60倍放大倍数下也不应观察到移液管尖端有任何移动。

方案

所有实验均遵循美国国立卫生研究院（NIH）动物研究指南，并经加州大学伯克利分校动物护理与使用委员会（AUP 2015-07-7742）批准，尽一切努力减少动物痛苦。所采用的全部方法均符合美国兽医医学协会安乐死专家组和IACUC委员会的建议。所有使用人源样本的实验程序均经加州大学伯克利分校人类研究委员会批准，IRB协议编号为2013-06-5395。

1. 制备用于全细胞精子膜片钳记录的玻璃微电极。

注意：由于细胞质滴体积微小，需使用尖端精细的玻璃微量移液管。

  1. 进行微电极拉制时，使用外径1.5 mm、内径0.86 mm并带有内丝的硼硅酸盐玻璃毛细管。在微电极拉制仪上拉制尖端（图3B）。
  2. 为塑形并抛光微电极尖端，将加热丝短暂靠近尖端附近。在微电极抛光仪上，于100倍放大倍数下进行火焰抛光操作（图3C，D）。
  3. 确保火焰抛光前微电极尖端内径约为2 µm，经适当抛光后减小至约0.5 µm。
    注意：建议仅使用当天新鲜拉制的微电极。这可避免微电极尖端积聚灰尘颗粒。

2. 设置实验装置

  1. 记录室的组装
    1. 使用低体积、菱形设计的灌流室，确保层流和相对较快的溶液交换速率（图4）。通过一个分流装置将灌流室连接至重力驱动的灌流系统（图5）。
    2. 为向记录室灌流溶液，组装一个简易的自制重力驱动灌流系统，使用聚四氟乙烯（PTFE）分流装置，将灌流室连接至八条独立的灌流管路。
      注意：灌流管不应向溶液中渗出增塑剂，因为此类化学物质可能显著影响精子细胞的正常功能60，并改变离子通道活性61,62。强烈推荐使用小直径聚四氟乙烯管作为主要灌流管。
    3. 由于聚四氟乙烯管较硬，可在其外部套接高纯度硅胶管以实现柔性连接。此外，应使用无润滑剂的注射器（例如鲁尔锁型注射器），因为矿物油或其他润滑添加剂可能干扰离子通道记录（图5）。
  2. 制备琼脂桥
    1. 为避免记录过程中液接电位变化，使用琼脂桥以保持参比电极周围环境稳定（图4）。
    2. 制备琼脂桥时，使用小型本生灯火焰将玻璃毛细管弯成L形，并使其冷却。
    3. 配制含1%琼脂糖的1 M KCl溶液，放入微波炉加热至琼脂糖完全溶解、溶液透明。小心地将上述溶液注入L形玻璃毛细管中，避免产生气泡，并静置于室温下冷却。琼脂桥可在1 M KCl溶液中于+4 °C保存约2个月。
    4. 使用琼脂桥时，先用1 M KCl填充Ag/AgCl颗粒参比电极，再小心插入琼脂桥，避免凝固的琼脂糖从玻璃毛细管中弹出。
    5. 随后，将放大器头级导线的金针（2 mm）插入参比电极的2 mm（金）插槽，并将L形琼脂桥的末端插入灌流室，如图4所示。
  3. 溶液与配方
    ​注意：所有试剂和化学品必须为最高纯度。所有配制好的溶液均需通过无菌0.22 µm PES滤膜过滤，并在4 °C下保存，最长不超过一个月。需注意，准确调节渗透压是成功进行膜片钳记录的前提条件。
    1. 按表1所述配制人输卵管液（HTF）溶液，用NaOH调节pH至7.4。渗透压应为280 ± 5 mOsm，使用蒸气压渗透压计测定。
    2. 按表2配制高盐（HS）"浴液"或"细胞外液"溶液，用NaOH调节pH至7.4。渗透压应为320 ± 5 mOsm。
    3. 按表3配制甲磺酸铯（cesium methanesulfonate）"浴液"或"细胞外液"溶液，用CsOH调节pH至7.4，渗透压调节至320 ± 5 mOsm。
    4. 按表4配制甲磺酸铯（CsMeSO3）细胞内"移液管"溶液，用CsOH调节pH至7.4。其渗透压应比HS溶液高最多10 mOsm。

3. 哺乳动物精子的分离与纯化

注意：通过吸入 CO2 随后进行颈椎脱位的方法处死 3 至 6 月龄的 C57BL/6 雄性小鼠。颈椎脱位后，立即从小鼠采集组织（尾部或体部附睾）。

  1. 小鼠附睾精子的分离
    注意：通过吸入 CO2 随后进行颈椎脱位的方法处死 3-6 个月大的 C57BL/6 雄性小鼠。颈椎脱位后，立即从小鼠体内采集组织（尾部或体部附睾）。
    1. 用剪刀打开小鼠下腹部区域，并取出两侧附睾。
    2. 将附睾置于盛有 HS 溶液（高盐溶液，见表 2）的 35 mm 细胞培养皿中。确保在接触精子细胞前，HS 溶液已预热至室温。
    3. 将附睾转移至另一含有 HS 溶液的新细胞培养皿中，并彻底去除所有残留脂肪。
    4. 使用 #15 手术刀片将附睾分离为头、体和尾三部分（图 6）。
    5. 将每侧附睾的体部（或根据需要取尾部）转移至另一含有 HS 溶液的新细胞培养皿中。使用尖头 #11 手术刀片在分离出的附睾部分上做多个切口。
    6. 将已做多个切口的附睾部分转移至含有 1.5 mL HS 溶液的 1.5 mL 微离心管中。
    7. 使用超细 Dumont 5a 型镊子轻轻振荡，使精子从附睾中释放到溶液中。弃去附睾组织，将离心管在室温下静置 10 分钟。
    8. 等待固体物质（非精子细胞）沉降至管底后，将上清液转移至另一 1.5 mL 微离心管中。
    9. 将精子混合物在室温下暴露于空气中保存，最多可保存 2 小时，在此期间可进行实验。分离后 3 小时，精子活力会显著下降。
  2. 小鼠精子的获能
    ​注意：所有附睾来源的精子均适用于膜片钳实验，但只有来自附睾尾部的精子足够成熟，具备受精能力。由于尾部精子能够发生获能，因此建议使用尾部精子细胞进行实验，尤其是精子获能相关实验。
    1. 对附睾尾部或射出的精子进行采集（参见步骤 3.1.1–3.1.4）。
    2. 取如步骤 3.1.4 所述分离得到的附睾尾部，按步骤 3.1.5 所述方法做多个切口，然后将其转移至含有 2 mL 获能溶液的 10 mm 细胞培养皿中。
    3. 将附睾尾部组织在 37 °C 和 5% CO2 条件下初始孵育 10 分钟，随后弃去组织，将释放出的精子细胞继续孵育 50–80 分钟。
      注意：小鼠附睾尾部精子的体外获能通常通过 60–90 分钟的孵育实现。获能精子可通过鞭毛出现过度不对称弯曲（即超激活）的现象在显微镜下识别。这种运动方式使精子能够以非线性轨迹游动。
  3. 人精子的采集与纯化
    注意：本研究中，共采集了 21 名年龄在 21–38 岁之间的健康志愿者提供的新鲜精液样本，并采用室温上游法对精子进行纯化，具体方法详见文献48,63。简要步骤如下：
    1. 将人类精液样本在室温下静置 60 分钟以完成液化，之后再进行纯化（时间过长可能对精子质量产生不利影响）。
    2. 在 50 mL 离心管中将约 7 mL HTF 溶液预热至 37 °C。目测评估精液体积——若体积超过 1 mL，应准备多个 HTF 溶液管。
    3. 小心地将 1 mL 液化后的精液沿管壁缓慢加入每个离心管底部，避免将精液条带带至缓冲液表面。精液与 HTF 溶液之间的界面应尽可能清晰，避免产生气泡。
    4. 将离心管置于 37 °C 培养箱中，以 45° 角倾斜放置 1 小时，以最大化接触表面积。若使用 CO2 培养箱，需拧紧管盖以防止缓冲液酸化（本操作无需 CO2）。孵育期间，活动精子将逐渐向上游动至 HTF 缓冲液表面。
    5. 1 小时后，从所有样本中收集最上层 1 mL 液体至 15 mL 离心管中，从而汇集高质量、高活动力的精子用于膜片钳记录。不要试图移除全部上清液——应保留数毫升 HTF 溶液在精浆上方，以避免污染。纯化后的细胞悬液可在室温下保存数小时。
      注意：正常精液每毫升应至少含有 15 × 106 个精子细胞64，但不同样本间精子数量差异较大。若细胞数量较低，可在膜片钳实验前将纯化后的精子悬液在室温下静置 30–60 分钟。在此条件下，细胞将逐渐沉降至离心管底部，形成可见的细胞云团，可从中吸取细胞加入记录室（见下文）。
  4. 人精子的获能
    注意：人精子的体外获能可通过在获能溶液中孵育 4 小时实现：获能溶液成分为 HTF 或 HS 缓冲液中含 20% 胎牛血清和 25 mM NaHCO348,51。获能精子可通过其剧烈运动及鞭毛出现过度不对称弯曲来识别，这种运动方式使精子能够以非线性轨迹游动。
    1. 配制 2 倍浓度的获能溶液，并与精子悬液按 1:1 比例混合。
    2. 在 37 °C 和 5% CO2 条件下孵育至少 4 小时。为确保较高比例的精子完成获能，孵育时间不应少于 4 小时。

4. 准备包被溶液（仅人类精子膜片钳实验需要）

注意：在破膜之前，必须将附着的精子从盖玻片上提起。此步骤仅对人类精子细胞是必需的，且需要对玻璃盖玻片进行包被，以形成黏附性较低的玻璃表面。盖玻片包被可降低精子细胞黏附于盖玻片的可能性，并在成功形成吉欧封接（gigaseal）后使人类精子能够从玻璃盖玻片上被提起。

  1. 在15 mL离心管中，将200 µL精液用5 mL HS溶液稀释。
  2. 以300 × g 离心5分钟，弃上清液。
  3. 将沉淀物重悬于1 mL HS溶液中，并转移至微量离心管。
  4. 使用盛有水的超声水浴，在25 °C条件下超声处理10分钟。
  5. 以10,000 × g 离心5分钟。
  6. 将上清液转移至新的微量离心管中，用于包被（见下文操作说明）。

5. 记录完整精子质膜的离子电导。

  1. 将精子附着于盖玻片上。
    注意：在进行膜片钳记录之前，需将精子接种于直径为5 mm的圆形盖玻片上。
    1. 若使用人类细胞，用尖头镊子将盖玻片短暂浸入已配制好的包被溶液中。
    2. 将四片盖玻片放入4孔板的一个孔中，并加入300 µL HS溶液覆盖。用移液器的塑料吸头将盖玻片压向4孔板底部，并用胶带固定，以防止盖玻片漂浮。
    3. 轻轻将储存管中浓缩的人精子悬液（步骤 3.3.5）或小鼠精子悬液（步骤 3.1.9）（20–50 µL 浓缩精子）重悬于盖玻片上方 300 µL HS 溶液中。
    4. 确保精子聚集在孔底部，其头部附着于盖玻片，而尾部在盖玻片上方的溶液中剧烈摆动。在开始记录前，需在室温下静置约10分钟，使精子充分沉降到盖玻片上。
      注意：如果人精子附着效果不佳，需返回步骤 5.1.1，用 HS 溶液将制备好的包被液稀释（1:20 至最多 1:2）。由于人精子样本的活力存在个体差异，此步骤必须根据来自不同供体的精子样本进行相应调整。
  2. 放置盖玻片
    1. 从孔板中取出一个带有少量贴壁细胞的盖玻片，放入记录室的菱形孔中，该孔内已含有HS溶液（图4).
    2. 打开灌注系统（图5用HS溶液充满腔室，以冲洗腔室并清除其中的碎屑和过量游离的精子。这将提高记录电极到达细胞时保持清洁的概率。当处理倾向于更牢固黏附于盖玻片的未获能精子时，此步骤尤为有益。
      注意：若记录已获能的精子，当新的盖玻片放入记录腔室后，必须避免立即开启灌流。已获能的精子具有强烈的运动活性，且与盖玻片的贴附较为松散。因此，为确保尽可能多的已获能精子可用于记录，应在开启灌流前等待约10分钟，使已获能的精子充分贴附于盖玻片上。一旦选定合适的已获能细胞并形成吉欧封接（gigaseal），即可重新开启灌流。
  3. 用于膜片钳记录的精子细胞筛选。
    1. 使用600倍放大倍数（见下文）寻找带有胞质滴的合适精子细胞。该操作采用方法部分所述的60倍水浸物镜与10倍目镜组合实现。从附睾体分离的精子细胞中，胞质滴通常位于中段中央附近；而在尾部精子细胞中，胞质滴通常靠近连接段环状结构（annulus）图2C）。对于人类精子，胞质滴位于颈部区域（图2A，B).
      注意：此外，还可使用显微镜的拉出式1.6倍放大功能来仔细观察精子形态（总放大倍数为960倍）。
    2. 确保胞质滴呈椭圆形且略微拉长（图 2G），呈纺锤形。那些看起来非常圆且增大的CDs通常较为脆弱，不适合进行膜片钳实验（图 2D，F).
    3. 选择一个具有活动能力的精子，其头部附着在盖玻片上，使精子细胞部分固定，但中央附肢（CD）及鞭毛其余部分仍能随着鞭毛摆动而运动。确保精子头部与盖玻片松散附着，以便在鞭毛左右摆动时，头部可随之轻微旋转。
      注意：松散贴附非常重要，因为在形成吉欧姆封接后、转换至全细胞模式前，必须将精子从盖玻片抬起并移入溶液中。
  4. 形成吉欧密封
    ​注意：为了在全细胞模式下记录单价CatSper电流，需使用含甲磺酸铯（也称为移液管液或细胞内液）的电极填充液（表4）——这将得到 11–17 MΩ 的移液管电阻（图7A），由放大器在施加从 0 mV 到 10 mV 的电压阶跃时自动计算得出。根据具体应用，移液管也可填充其他溶液。建议使用含有可移动阴离子（如甲磺酸根、Cl⁻）的溶液- ，天冬氨酸根或类似离子以降低移液管电阻。移液管溶液的渗透压应比灌流液高最多10 mOsm。移液管溶液的渗透压略高有助于在膜片钳记录期间尽可能保持精子细胞的接入电阻最低。
    1. 在显微镜下挑选出形态正常的精子细胞后（图2G），用移液管溶液填充微量移液管（表4）并将其固定在移液器架上。
    2. 为了防止移液管尖端被碎屑污染，使用U形管组件对移液管施加正压，确保移液管溶液在尖端浸入细胞外液后流出。细胞外液在下文中也称为 "浴液" 溶液（参见 表2).
      注意：如果条件允许，建议在持续灌流条件下形成封接，因为此条件可确保最洁净的移液管尖端。
    3. 将移液管下移，使其尖端浸入浴液中（表 2）。此时可测量移液管电阻（图7A).
    4. 为清晰观察细胞，将移液器吸头尖端置于光盘（CD）上方，使吸头开口朝向光盘呈对角线方向（约45°）。
    5. 迅速将移液器尖端移向光盘（CD），使其处于同一焦平面，并距离光盘几微米（µm）范围内。
    6. 一旦移液器尖端接触CD，立即使用移液器施加负压 "吹嘴" 将液滴的一部分移入尖端并形成吉欧姆封接——在电生理学中也称为 "吸液事件"通常，在移液管尖端与细胞初次接触后，可维持移液管内的负压长达一分钟，以逐步形成千兆欧姆封接。
    7. 在成功形成吉欧姆密封后（> 4-20 GΩ），将精子从盖玻片上提起（图7B).
      注意：由于啮齿类动物精子细胞较长，此步骤并非必需；但部分脱离精子鞭毛有助于减轻移液过程中的潜在漂移。人类精子的脱离则是必要步骤，因为其连接段（CD）很小（1~3 µm）；若细胞仍附着在盖玻片上，实验过程中移液管即使发生轻微漂移，也可能破坏连接段。精子被提起后，其鞭毛通常会继续摆动，而细胞仅与微移液管保持连接。
  5. 破膜并转换至全细胞记录模式。
    1. 使用放大器的补偿模式在转换到全细胞模式之前补偿杂散电容瞬变图7B）。为初步观察电容瞬变，将膜电位钳制在 0 mV，使用 "膜片钳测试" 工具（图7B).
    2. 通过施加短暂（1毫秒）且逐步增加（430–650毫伏，约每步50毫伏）的电压脉冲，同时结合极轻微的负压吸引，实现细胞膜击穿并过渡至全细胞记录模式图7C).
      注意：应用 突破 脉冲：使用膜片钳软件中预先设定的破膜程序。通过放大器背面的高压指令输入端（后置开关）向精子施加破膜电压脉冲。
    3. 每次施加破膜电压脉冲后，启动 膜片钳测试 用于检测是否出现较大电容瞬变的工具。
      注意：大电容瞬变的存在（图7C) 表示破膜已经发生，此时正在测量细胞的总电容（人精子约为 1 pF，小鼠精子约为 2.5 pF 或更高）。
    4. 使用大电容瞬变拟合 膜片钳测试 用于测定全细胞电容及其接入电阻的工具。
      注意：为了通过微移液管溶液高效灌注精子细胞内部，并实现对精子质膜的可靠电压钳制，通路电阻应尽可能低。通常情况下，通路电阻在使用Cs时为25–30 MΩ，使用K时为50–70 MΩ。+ /+ - 分别为基于NMDG的细胞内溶液。
    5. 成功形成全细胞模式后，继续进行预定的全细胞膜片钳实验，例如施加不同的灌流溶液（图8) 使用不同化合物或通过电压步阶测量通道活性图8, 图9）或电压斜升方案。如果破膜不成功，则返回步骤6.4.1，更换新的微吸管并选择另一个合适的精子细胞。

结果

精子膜片钳技术可实现对CatSper通道的直接记录。
如上所述，CatSper记录是通过在膜片钳电极与哺乳动物精子的胞质滴部位之间形成高阻封接（吉欧姆级）来完成的。当破膜并转入全细胞模式后，即可实现对整个精子细胞及其内部（包括精子头部和鞭毛）的完全电学通路2,8,39,51。这一条件最终允许记录定位于精子质膜上的任何活性离子通道。记录单价CatSper电流时，优选使用名义上无二价阳离子（DVF）的灌流液，其中以铯离子或钠离子作为主要的通透性离子2,8,39,51。尽管CatSper通道可通透Ca2+和Ba2+等二价离子，但其通过CatSper孔道的速率要慢得多，导致电导信号极弱，仅约为几个皮安（~10–20 pA）2,8,39,51。因此，通过CatSper通道测量单价离子产生的较大电流，是评估该通道电流更为便捷的方法（图8）。需要注意的是，CatSper对钾离子也具有通透性；因此，在仅研究精子细胞钾通道的情况下，必须阻断CatSper通道，或使用缺乏CatSper的精子细胞2,3,8,28,65。通过调整电极内液和灌流液的离子成分，可选择性地排除某些离子通道的干扰，从而创造仅针对特定类型离子通道的选择性记录条件。例如，在电极内液中加入Cs+可阻断精子钾通道的离子通透性。

在不同哺乳动物物种中，CatSper通道的调控方式各不相同。
不同物种的精子细胞在形态和内部调控通路方面存在差异66。因此，它们的离子通道也以独特的方式受到调控，以适应雄性和雌性生殖道中特化的微环境，这并不令人意外。精子膜片钳技术已成功应用于六种哺乳动物：小鼠2、大鼠56、人类39,51、牛、猪和猕猴41，如图9所示。在这些实验中，成年雄性恒河猴[Macaca mulatta]的精子细胞来自加州国家灵长类研究中心，所有操作均依照加州大学戴维斯分校批准的动物实验方案进行，并符合国际实验动物评估和认证协会（AAALAC）的标准，具体方法见文献41；所有研究均遵循美国国立卫生研究院（NIH）关于实验动物护理和使用的指南。公牛和公猪的精液作为副产品获得，来自加州大学戴维斯分校动物科学系设施，无需专门的IACUC批准，所有动物均饲养在经AAALAC认证的设施中。公牛和公猪的精液也可从商业来源获取。

灵长类（Rhesus macaque）和人类的精子表现出相似的CatSper通道特性及其调控机制。有趣的是，孕酮对CatSper通道的激活作用似乎为灵长类精子所特有（图9 和 41），因为猪、牛和啮齿类动物的精子并未显示出任何由孕酮刺激引起的CatSper电流变化。在牛和猪的精子中，即使基础状态下的CatSper通道活性也低于可检测水平（图9），这表明在这些物种中，钙离子内流及随之而来的超活化可能由其他通道或转运体介导，或者其CatSper通道需要不同的天然激活物才能被激活。在本文提及的所有精子物种中，包括牛和猪的精子细胞，均已实现对精子细胞内部的完整电学接触，并以全细胞记录模式进行记录，这可通过破膜后出现的大电容伪迹得以证实（图7）。该条件有利于功能性CatSper通道的记录，而猪和牛精子中缺乏此类电流表明，该通道可能被这些物种精子细胞中尚不明确的内源性抑制剂所阻断，或需要特定的调节因子才能被激活。然而，这些仅为初步实验结果，尚需对猪和牛的精子细胞开展进一步实验，以确认CatSper通道在这些物种中的功能重要性。这种跨物种精子离子通道的多样性可能与精子与卵子的大小比例、精子尺寸与卵子保护结构之间的关系有关，或作为防止异种受精的屏障机制66。

精子结构比较与膜片钳示意图；显微镜图像。
图1：哺乳动物精子的形态多样性。（A）下图：精子细胞的示意图；细胞区室已标注。上图：不同物种精子的微分干涉差（DIC）图像，顺时针方向依次为：大鼠（Rn；Rattus norvegicus）；小鼠（Mm；Mus musculus）；牛（Bt；Bos taurus）；猪（Sd；Sus scrofa domesticus）；人（Hs；Homo sapiens）；恒河猴（Mmu；Macaca mulatta）。比例尺适用于所有DIC图像。插图显示胞质滴。（B）哺乳动物精子细胞的膜片钳记录。为在移液管尖端与细胞质膜之间形成有效封接，需将部分质膜轻柔地吸入移液管尖端。通过破裂移液管尖端与细胞之间的质膜，实现全细胞记录模式。本图已从文献8中重印。右侧面板：附着于记录用微移液管的人类精子细胞。（C）人类精子细胞的示意图，以及利用膜片钳技术在人类精子中研究的部分鞭毛离子通道及其传导的离子。CatSper—钙离子通道39,51；Hv1—质子通道51,56,67；Slo3/Slo1—钾离子通道50,53,65,68；TRPV4—瞬时受体电位香草素型4阳离子通道48。请点击此处查看该图的放大版本。

精子细胞的比较显微镜观察；人、小鼠、CHO细胞；鞭毛结构分析。
图2：精子大小及胞质滴形态的变异性。 完整活体精子细胞的微分干涉差（DIC）图像。(A) 人类精子细胞（下方）与两个CHO细胞（上方）的大小比较。(B) 完整的人类（Homo sapiens）精子（下方）和一个无头精子细胞（鞭毛，上方）。胞质滴由黄色箭头指示；本图已从文献8中重印。(C) 具有正常形态胞质滴（CD）的小鼠（Mus musculus）完整精子，胞质滴由黄色箭头指示。(D–G) 附睾来源的小鼠精子细胞具有不同大小和形状的胞质滴；只有(C)和(G)适用于膜片钳实验。(D) 胞质滴微小且偏向一侧；(E) 缺失胞质滴；(F) 胞质滴内部含有颗粒，可能堵塞记录电极；(G) 胞质滴表面光滑、均匀且未肿胀。使用此类胞质滴形成吉欧封接（gigaseal）很可能获得成功的记录结果。 请点击此处查看该图的放大版本。

用于光学激发和光谱分析的显微镜装置；包括激光系统、显微镜和数据结果。
图3：精子膜片钳装置的组件。（A）典型的精子电生理记录装置及其关键组件：（1）倒置显微镜；（2）低噪声数据采集器；（3）放大器；（4）低漂移显微操作器，通过显微操作器平台与倒置显微镜连接；（5）PC计算机；（6）减振气浮台；（7）法拉第笼，用于屏蔽环境中的电干扰。装置中所有带电组件（包括计算机键盘和鼠标）必须产生极低或无50 Hz或60 Hz的电噪声，并且所有组件必须正确接地。（B）用于制备记录电极的微电极拉制仪。（C）（1）用于电极火焰抛光的微加工仪；（2）硼硅酸盐玻璃毛细管，外径1.5 mm，内径0.86 mm，内部含拉丝；（3）电极收集盒。（D）成功进行火焰抛光的电极各阶段示意图：（a）未抛光电极，内径2 mm；（b）经火焰抛光电极，内径0.5 mm；（c）过度抛光后封口的电极，不适合用于记录。请点击此处查看该图的放大版本。

带有标注组件的灌流系统设置示意图；用于生物组织实验。
图4：记录室系统的组件及其组装方式。（A）记录室系统的基本组件：（1）适用于20系列平台的显微镜载物台适配器，配有（2）两个载物台固定夹；（3-4）PM系列磁力加热平台，带有（3）用于固定灌流室的磁性夹具；（5）灌流室；（6）琼脂桥；（7）带2 mm插孔的磁性夹具，连接至Ag/AgCl电极颗粒作为参比电极；（8）用于吸液管路的磁性支架（MAG-1）；（9）吸液管；（10）吸液管O型支架。（B）已组装完成的记录室系统，标示出（A）中各组件。请点击此处查看该图的放大版本。

带有注射器、歧管连接器、硅胶管和聚四氟乙烯管的灌注管路示意图。
图 5：灌注系统的组成部件。（A）组装完成的灌注管路，以及（B）其关键组件：（1）20 mL 和 3 mL 注射器；（2）带鲁尔接头的三通阀，4 通，公端锁紧；（3）鲁尔母端软管接头适配器，1/16"；（4）聚四氟乙烯（PTFE）灌注管（微孔 PTFE 管，内径 0.022" × 外径 0.042"）；（5）8 通道聚四氟乙烯灌注歧管；（6）硅胶连接管（铂催化固化硅胶管，内径 1/32" × 外径 3/32"）；（7）歧管连接管（PTFE 管，内径 1/32" × 外径 1/16"）。 请点击此处查看该图的放大版本。

附睾解剖图，标注部分：睾丸、头、体、尾。
图 6：雄性小鼠解剖图。 （A）小鼠雄性生殖器官；显示睾丸和附睾。（B）将附睾转移至含有 HS 溶液的 35 mm 细胞培养皿中，并去除残留脂肪和输精管。（C）使用 #15 手术刀片将每侧附睾分为头、体和尾三部分。请点击此处查看此图的放大版本。

膜片钳技术示意图；细胞电学测量过程；吉欧密封形成；全细胞模式。
图7：小鼠精子细胞中吉欧密封的形成及破膜进入全细胞模式。 商业化膜片钳软件中“膜特性测试”（Membrane Test）工具的界面。精子膜片钳记录的三个阶段：（A）记录电极浸入浴液HS溶液中，电极电阻为14.8 MΩ；（B）形成吉欧密封（电阻为4.7 GΩ），电容瞬变信号已完成补偿，并将精子从盖玻片上提起；（C）过渡至全细胞模式。如左侧所示，通过施加短暂（1 ms）、逐步增加（430–650 mV，约每步50 mV）的电压脉冲并结合轻微负压吸引，实现破膜并进入全细胞模式。破膜成功的标志是出现较大的电容瞬变信号，反映整个细胞的电容（本例精子细胞约为2.93 pF）。 请点击此处查看该图的放大版本。

在不同电压条件下显示CatSper通道电流的电生理分析图。
图8：来自野生型（WT）附睾尾部、已获能及CatSper基因敲除精子的鼠源CatSper记录。 为记录单价离子CatSper活性，每5秒施加一次斜坡电压刺激，CatSper电流由从保持电位0 mV开始的电压斜坡诱发39,51。电压斜坡（-80 mV至80 mV；850 ms）在HS溶液和名义上无二价阳离子的溶液（DVF）中施加。数据采样频率为2–5 kHz，滤波频率为1 kHz。在HS溶液中记录基线电流，由于细胞外高浓度镁离子的抑制作用，该条件下不产生CatSper电流39,51。基线电流可用于估算漏电导（非离子通道通路）。代表性Cs+全细胞CatSper电流密度（pA/pF；蓝色）记录自尾部野生型小鼠精子细胞（未获能；左图和已获能；中图）以及CatSper缺陷型尾部小鼠精子细胞（右图）。电流由从0 mV保持电位开始的电压斜坡诱发，斜坡范围为-80 mV至80 mV，在HS溶液和名义上无二价阳离子的溶液中进行。基线电流（黑色）在HS溶液中记录。为获得电流密度，CatSper电流幅值被标准化为细胞电容（pA/pF）。请点击此处查看该图的放大版本。

黄体酮激活CatSper离子通道；哺乳动物精子中电流密度的图示
图9：不同哺乳动物物种中黄体酮对CatSper的调控作用。（A）通过所示电压斜坡方案从不同物种精子细胞中诱发的代表性CatSper电流。物种包括：人（Hs；H. sapiens）；恒河猴（Mmu；M. mulatta）；小鼠（Mm；M. musculus）；牛（Bt；B. taurus）；大鼠（Rn；R. norvegicus）；猪（Sd；S. scrofa domesticus）。记录了在无（蓝色）和有（红色）1 mM黄体酮条件下的CatSper电流，以及HS溶液中的基础电流（黑色）。（B）来自不同物种精子细胞的CatSper电流幅值（ICatSper，pA）以及（C）平均电流密度（pA/pF）记录，如图所示；n表示所用单个精子细胞的数量。数据为均值±标准误。请点击此处查看该图的放大版本。

大鼠和人精子DNA链的显微镜图像；DNA可视化与比较的实验装置。
图10：鞭毛运动能力的差异。 细胞质滴与鞭毛运动的两个代表性示例。叠加图像显示了同一时间点的大鼠（Rn）和人（Hs）精子细胞，此时鞭毛远端偏转最为明显。虚线矩形框标示了细胞质滴所在区域及其相应的空间运动性。请点击此处查看该图的高清版本。

使用U形管压差计装置进行流体动力学实验，展示压力测量过程。
图11：U形管组件及其关键组成部分。（A）U形管的组成部分：（1）10 mL刻度移液管；（2）硅胶管；（3）硅胶连接管；（4）1 mL注射器；（5）雌性鲁尔凸接头适配器；（6）雄性鲁尔一体锁紧接头 1/8"；（7）带鲁尔接头的旋塞阀；四通；雄性锁紧；（8）雄性鲁尔串联凸接头，1/16"。（B）完全组装好的U形管，以及（C）连接至法拉第笼的U形管。请点击此处查看该图的放大版本。

U形管气压实验示意图；显示包括移液管、注射器、旋塞装置在内的实验装置。
图12：U形管组件的示意图。 左图：通过口腔施加正压，使U形管中液体水平面产生差异，右侧支管中的液面上升2 cm。在形成该液面差后，旋转旋塞，将U形管连接至通向记录移液管的管路。右图：右侧支管中较高的液面产生正压，持续推动移液管溶液从移液管尖端流出，从而保持尖端清洁，无碎屑污染。 请点击此处查看该图的放大版本。

化学试剂摩尔质量 (g/mol)毫摩尔浓度 (mM)配制1L溶液所需质量
NaCl58.4497.85.72 g
KCl74.5550.373 g
KH2PO4136.090.3750.4 mg
MgSO4 x 7.H2O246.480.249.3 mg
CaCl2 x 2.H2O147.0220.294 g
HEPES238.3204.766 g
葡萄糖180.230.540 g
乳酸钠 (60% w/w)112.06203 ml
丙酮酸钠1100.444 mg

表1：人肾小管液（HTF）溶液

化学试剂摩尔质量 (g/mol)毫摩尔浓度 (mM)配制 1L 所需质量或体积
NaCl58.441357.889 g
KCl74.5550.373 g
CaCl2 x 2. H2O147.0220.294 g
MgSO4 x 7. H2O246.4810.247 g
HEPES238.3204.766 g
葡萄糖180.250.901 g
乳酸钠 (60% w/w)112.06101.5 ml
丙酮酸钠11010.110 g

表2：高盐溶液（HS）

化学试剂摩尔质量 (g/mol)毫摩尔浓度 (mM)质量 (500 ml 所需，g)
CsMeSO3 228.014015.960 g
HEPES238.3404.766 g
EDTA292.2410.146 g

表3：CsMeSO3 浴液（二价离子自由浴液：DVF）

化学试剂摩尔质量 (g/mol)毫摩尔浓度 (mM)质量 (25 ml 所需，mg)
CsMeSO3228.0130741 mg
HEPES238.370417 mg
EDTA292.24214.6 mg
EGTA380.35328.5 mg
CsCl1 M 溶液125 μl

表4： CsMeSO3 移液管溶液

讨论

我们介绍了一种针对多种物种精子细胞进行电生理记录的详细实验方案。鉴于离子通道和生电性转运蛋白在精子生理功能中的重要作用，该技术是研究精子细胞生理学以及导致男性不育相关缺陷的有力工具。实验人员在初次操作该技术时可能会感到具有挑战性，但只要坚持不懈，终将获得成功。

哺乳动物精子通常较长（一般 >50 µm），细长且具有高度运动性。哺乳动物精子的基频（BF）差异很大，平均值从4 Hz（小鼠）不等 69），7-15 Hz（公猪 70,71），11 Hz（大鼠 72），11-20 Hz（公牛 18），24 Hz（猕猴 23，最高可达 25 Hz（人类） 3）。胞质滴（CD）是记录精子细胞的入口。在啮齿类动物的精子中，胞质滴通常位于远端，但会沿鞭毛移动。图10），这为记录带来了额外的困难。然而，在人类精子细胞中，颈环（CD）通常更靠近头部。因此，成功进行精子膜片钳记录的关键在于具备优质的光学系统，以获得清晰、锐利的颈环视野，以及高度精确且无漂移或振动的显微操作系统。 初期高失败率 在精子膜片钳实验的最初几天内，出现预期且正常的现象。我们建议每周进行多次常规练习。每周每天获得数次记录，有助于建立操作习惯并提高操作技能。

直到最近，由于无法直接研究精子离子通道，其鉴定和药理学表征一直受到阻碍。该领域主要依赖免疫细胞化学研究，而这类研究常存在抗体非特异性和/或缺乏相应遗传 模型的问题。对于钙通道的研究，经典的方法是广泛使用的钙成像技术，该方法具有自身的优点和局限性73,74,75,76,77。尽管钙成像是一种相对简便的方法，适用于中高通量研究78,79,80,81，且侵入性较小，但它需要细胞保持相对完整，因此难以在脱离细胞内信号级联的情况下解析离子通道的功能，或将其与钙离子交换体区分开来。此外，该方法难以控制膜电位，因而更难排除电压门控钙通道的贡献。钙荧光测定法的若干优势之一是可使用钙离子比率型染料，从而精确测量钙离子 浓度的变化。但同时必须注意，这些染料的灵敏度可能随细胞内pH值的变化而改变。

以下我们将介绍该实验方案中的关键步骤，包括方法的故障排除步骤。配制实验溶液时必须使用高纯度试剂，因为即使微量杂质也可能影响实验结果。 少量不希望存在的离子（如镁离子或重金属）污染可能会影响单价离子电流的检测。鉴于精子细胞体积较小，可预期其数量相对较少 每细胞的离子通道数量。因此，净电流范围从几个皮安到数百皮安不等。为确保能够检测到微小电流，记录设备的内部电噪声必须尽可能低，强烈建议使用无漂移的仪器。为了将特定电导与电噪声及背景漏电流区分开，必须优化记录装置和接地系统。这可通过正确接地以避免任何电干扰来实现。82强烈建议使用法拉第笼，以防止来自各种电气设备（如建筑物照明和墙内电线）产生的电干扰。实验装置中所有通电组件，包括计算机键盘和鼠标，必须产生极少或不产生电噪声（50 Hz 或 60 Hz），并且装置的所有组件都应正确接地。当全细胞记录模式下所有离子通道均处于关闭状态时，电噪声应 < 0.5-1 pA

另一个重要点是监测工作溶液的正确渗透压。必须精确确定细胞内外溶液的成分，并正确测量其渗透压 。相对于移液管溶液，细胞外溶液应略呈低渗状态，以引起微小的细胞膨胀，防止精子膜堵塞移液管。注意：如果移液管溶液过于高渗，且与浴液之间的渗透压差超过 10 mOsm，则会导致细胞过度膨胀，密封破裂。结果是细胞变得脆弱，破膜后数秒内即失去吉欧密封（gigaseal）。根据我们的经验，溶液配制不准确是导致膜片钳实验失败最常见的原因之一。

另一个需要避免的潜在障碍是含有增塑剂/邻苯二甲酸盐的塑料以及经矿物油润滑的注射器。所有接触溶液（因而也接触精子细胞）的管路、注射器及其他塑料器材均不应析出增塑剂或其他环境毒素或油类，因为此类化学物质可能显著改变离子通道的活性。我们使用小直径的聚四氟乙烯（Teflon）管作为主要灌流管线。聚四氟乙烯（PTFE）几乎不析出可溶出物，但质地较硬。柔性连接部分则采用高纯度硅胶管，套接在聚四氟乙烯管外。灌流系统所用的所有注射器均不含任何润滑剂，因为矿物油或其他润滑添加剂可能干扰离子通道记录。

使用合适的玻璃材质并拉制出正确的微电极形状至关重要，其重要性再怎么强调也不为过。因此，成功进行膜片钳实验的前提是优化制备玻璃微电极。我们仅使用含拉丝的硼硅酸盐玻璃 来制作玻璃微电极，以实现更佳的溶液填充效果。微电极尖端必须经过火焰抛光，以形成理想的紧密封接。微电极尖端直径超过 2 μm （因而电阻为 10 MΩ 或更低）者，通常不适用于精子细胞的膜片钳实验。

另一个重要步骤是在形成封接之前，确保微移液管尖端 不沾有任何碎屑或气泡。由于微移液管需插入充满 活动细胞的溶液中，这一操作具有较大难度。为避免微移液管意外"触碰"游动的精子细胞，可采用持续灌流的方法清除所有非黏附细胞。另一种工具是一种自制的"U型管"装置，可通过切换正压与负压模式来保持尖端清洁（图11 和 图12）。

精子细胞的形态存在显著差异 大小 细胞质滴（CD）的选取至关重要，应挑选一个 具有合适形态的液滴。如图所示 图2只有较小（1-3 µm）、表面光滑、均匀且未过度肿胀的CDs适用于膜片钳实验。微小，单侧； "肿胀的"完全透明的环状结构（CD）会产生微弱或无法形成封接。内部含有较大可溶性颗粒的CD可能会堵塞记录电极。当小鼠睾丸精子进入附睾时，其CD位于颈部区域，靠近头部。随着精子在附睾中移动，CD沿中段迁移，最终当精子到达附睾尾部时，CD位于中段与主段连接处（即环状结构，annulus）。因此，如上所述，从附睾体分离的精子细胞中，CD通常位于中段中央附近；而在尾部精子细胞中，CD通常位于annulus附近图2C）。对于人类精子，胞质滴位于颈部区域（图2A，B).

对于从实验动物中分离的精子而言，这并非问题，但不同人类供体之间存在显著差异。同一供体内部精子质量的变化主要影响精子质膜的质量，有时会使封接形成相对困难。离子通道的行为和药理学特性变异较小，这些因素可能与个体的遗传或生理特征相关。研究者必须保持耐心，评估来自多个捐献日的样本，并依赖多位人类供体参与者。使用人类样本需要额外的耐心，因为同一供体捐献的精子质量会因多种环境因素而表现出很大差异。我们建议评估多个捐献日的样本，以最终确定供体状态。虽然射出后纯化的精子通常在数小时内（对于人类精子，分离后最长可达12小时）适用于电生理实验，但小鼠附睾来源的精子仅在分离后2小时的时间窗口内适合进行膜片钳记录。

最后，但同样重要的是 至少，不同精子细胞之间的吉欧封接形成存在差异。对于小鼠/啮齿类动物的精子细胞，吉欧封接几乎瞬间形成，而人类精子则需要数秒（有时长达一分钟）才能形成吉欧封接。通常初始吸吮后输入电阻范围为200 MΩ至800 MΩ。将钳制电位切换至-60 mV并给予 "膜片钳测试" 短脉冲（最高达10 mV）常有助于挽救吉欧封接的形成（通过移液管内膜在电场作用下的移动）。

精子细胞膜片钳技术可实现对其天然表达系统中特定离子通道的详细研究。该技术的成功依赖于合适的设备、高质量且具有活性的精子细胞、纯净的试剂、 基础的电生理学技能、耐心 以及坚持不懈。该方法通过研究离子通道在进化上的多样性、其调控机制，以及精子从男性到女性生殖道迁移过程中、在外界条件（如pH和配体）影响下功能发生的变化，为精子生理学研究开辟了新的前沿领域。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作得到了美国国立卫生研究院（NIH）资助R01GM111802、Pew生物医学学者奖00028642、阿尔弗雷德·P·斯隆奖FR-2015-65398以及Packer Wentz基金遗赠（授予P.V.L.）的支持。本工作还得到了德国研究基金会（Deutsche Forschungsgemeinschaft）368482240/GRK2416（授予N.M.）以及中国国家留学基金管理委员会奖学金（授予B.L.）的支持。我们感谢Dan Feldman博士提供大鼠组织，感谢加州大学戴维斯分校的Katie Klooster和Stuart Meyers在灵长类精子细胞 获取方面的帮助，以及Steven Mansell在猪和牛精子细胞数据采集分析方面的协助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
IX71 带微分干涉相衬光学系统Olympus IncIX71Nikon TiU 显微镜也可使用
UplanSApo 60xOlympus Inc水浸物镜
减振气浮台Newport IncTMC 气浮台或类似产品可使用
Axopatch™ 200B 放大器Axon™ /Molecular DevicesSutter IPA®/Double IPA® 集成膜片钳系统也是一种优秀的放大器
Axon Digidata 模数转换器Axon™ /Molecular Devices1440 或 1550也可使用
蒸汽压渗透压仪Wescor型号 5600
MPC 385 微操纵器Sutter Instruments, Novato CAMPC 385Eppendorf 微操纵器 TransferMan 系列也可使用
微电极拉制仪Sutter Instruments, Novato CAP1000P97 可用
MicroForgeNarishigeMF-830应配备 Nikon MPlan 100/0.80 ELWD 210/0 物镜
法拉第笼自制用于屏蔽环境电干扰
 5 mm 玻璃盖玻片WPI #502040
灌流腔室Warner Instruments, Inc RC-24E
硼硅酸盐玻璃毛细管Sutter Instruments, Novato CABF 150-85-7.5外径 1.5 mm，内径 0.86 mm，带内丝
Teflon 多通管路 MP-8Warner Instruments, Inc64-0211Teflon 8 位灌流多通管路
Nunc 4 孔板Nunc#179820
1 X HTF 缓冲液EmbryoMaxMR-070-D获能溶液
SA-Oly/2 显微镜平台适配器Warner Instruments, Inc适用于 20 系列平台仅适用于 Olympus 显微镜
磁性加热平台Warner Instruments, IncPM-1 或类似系列用于固定 RC-24E 腔室
MAG-1 磁性夹具Warner Instruments, Inc#64-0358
带 2 mm Ag/AgCl 颗粒的微电极夹持器WPIMEH3F4515
带鲁尔接头的旋塞阀；四通；雄性锁紧Cole-Parmer, IncEW-30600–09
雌性鲁尔软管接头，1/16”Cole-Parmer, IncEW-45508–00
聚四氟乙烯（PTFE）灌流管Cole-Parmer, IncEW-06417–21（微孔 PTFE 管，0.022” 内径 × 0.042” 外径）
硅胶连接管（铂固化硅胶管，1/32” 内径 × 3/32” 外径）Cole-Parmer, IncEW-95802–01
多通管连接管（PTFE 管，1/32” 内径 × 1/16” 外径）Cole-Parmer, IncEW-06407–41
雄性鲁尔接头，1/16”Cole-Parmer, Inc45518–00
雄性鲁尔一体锁紧接头 1/8”Cole-Parmer, Inc45-503-04
硅胶连接管Dow Silicone Corporation;  MI#508-008
注射器Fisher Scientific 或 VWRAir-Tite, Norm-Ject Luer1 mL、3 mL 和 20 mL
NaClSigma-AldrichS7653
KH2PO4Sigma-Aldrich60216
MgSO4 x 7.H2OSigma-Aldrich63140
CaCl2 x 2.H2OSigma-Aldrich21097
HEPESSigma-AldrichH7523-250G
葡萄糖Sigma-AldrichG8270
乳酸钠（60% w/w）Sigma-AldrichL7900
丙酮酸钠Sigma-AldrichP2256
EDTASigma-AldrichBCBG2421V
CsMeSO3Sigma-AldrichC1426甲烷磺酸铯
KClFisher ScientificP217
EGTASigma-AldrichBCBF5871V
Tris-HClQuality Biological315-006-7211 M 溶液或类似溶液
NaOHSigma-Aldrich221465
CsOHSigma-Aldrich232041
Embryomax 人输卵管液培养基：MilliporeMR-070-D小鼠精子细胞的获能培养基
(Embryomax-HTF)
实验动物
雄性 Wistar 大鼠WistarHarlan Laboratories (Livermore, CA)成年大鼠
雄性 C57BL/6 小鼠C57BL/6 小鼠Harlan Laboratories (Livermore, CA)3–6 月龄

参考文献

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