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方法文章

一种快速的食物偏好检测方法 果蝇

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DOI：

10.3791/62051

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2021年2月11日

 , 
1Monell Chemical Senses Center, 2Department of Physiology, The Diabetes Research Center, University of Pennsylvania Perelman School of Medicine

本文内容

摘要

我们介绍一种果蝇的双选进食实验方案。该进食实验操作快速简便，不仅适用于小规模实验室研究，也适用于果蝇的高通量行为筛选。

摘要

为了在摄取具有营养价值的食物的同时避免摄入有害物质，动物需要一个复杂而稳健的味觉系统来评估其食物环境。Drosophila melanogaster（黑腹果蝇）是一种遗传操作简便的模式生物，被广泛用于解析食物偏好的分子、细胞和神经机制。为了分析果蝇的食物偏好，需要一种可靠且高效的喂养方法。本文描述了一种双选喂养实验法，该方法严谨、成本低且操作快速。该实验基于培养皿，将添加了蓝色或红色染料的两种不同食物分别置于培养皿的两个半区。随后，将约70只经过饥饿处理的2至4日龄果蝇放入培养皿中 ，在黑暗条件下让其自由选择摄食蓝色或红色食物，持续约90分钟。之后通过观察每只果蝇腹部的颜色，并计算偏好指数。与多孔板方法相比，每个培养皿填充耗时仅约20秒，节省了大量时间和操作成本。该喂养实验可用于快速判断果蝇对某种特定食物的喜好或厌恶程度。

引言

尽管果蝇与哺乳动物在味觉器官的解剖结构上存在显著差异，果蝇对许多味质物质的行为反应却与哺乳动物惊人地相似。例如，果蝇偏好表明营养存在的糖类1,2,3,4,5,6,7,8、氨基酸9,10和低浓度盐11，但会拒绝摄入难吃或有毒的苦味食物12,13,14,15。在过去的二十年中，果蝇已被证明是研究味觉感知和食物摄取相关诸多基本科学问题的极具价值的模式生物，包括味质检测、味觉转导、味觉可塑性以及摄食调控16,17,18,19,20。值得注意的是，大量研究已表明，果蝇与哺乳动物在味觉感知所依赖的味觉转导机制和神经环路机制上具有相似性。因此，果蝇是一种理想的实验生物，使研究人员能够揭示在动物界中调控食物探测与摄取的进化上保守的概念与原理。

为了研究果蝇的味觉感知，建立一种快速且严谨的实验方法以客观测量其食物偏好至关重要。多年来，已开发出多种摄食方法，用于定量测量果蝇的食物偏好和/或摄食量，包括基于染料的检测方法11,12,13,21,22,23、果蝇喙伸展反应检测24、毛细管摄食（CAFE）检测25,26、果蝇液体食物交互计数（FLIC）检测27以及其他组合方法28,29,30,31。其中一种常用摄食范式是基于染料的双选择摄食检测，该方法可使用多孔微孔板12,21,32或如本文所述的小型培养皿11,22作为摄食腔室。该检测方法基于果蝇腹部的透明特性设计。实验过程中，将果蝇放入摄食腔室，并提供两种食物选择，分别混合红色染料或蓝色染料。检测结束后，根据果蝇摄取的食物种类，其腹部呈现红色或蓝色。

培养皿和多孔板染料喂食实验均具有高度的稳健性，且结果大致相同。利用这两种实验方法，研究人员在解析感知食物味道和食物质地的多样化受体与细胞方面，已取得诸多重要发现与突破11,12,21,22,32,33。在染料喂食实验中，一个耗时耗力的实验步骤是将食物制备并装入喂食腔。为了减少食物准备和装载时间，该实验方法经过改进，用小型培养皿替代了多孔微量滴定板，并将培养皿分为两个相等的区域。在基于培养皿的实验中，将添加了蓝色或红色染料的两种不同食物分别加入培养皿的两个半区。随后，将约70只饥饿处理过的2至4日龄果蝇放入培养皿中，在黑暗条件下让其自由选择摄食蓝色或红色食物，持续约90分钟。之后观察每只果蝇的腹部着色情况，并计算偏好指数（PI）。

这种基于培养皿的双选摄食实验成本低、操作简单且快速。填充一块多孔板大约需要110秒，而每个培养皿仅需约20秒。此外，多孔板实验需要将少量食物精确加入大量小孔中（例如每块板60个或更多孔），对操作精度和注意力要求较高。相比之下，基于培养皿的实验每块板仅需执行两个操作步骤。由于摄食实验通常涉及大量重复样本，基于培养皿的方法可显著节省时间和工作量。该方法所得结果与多孔板实验相当，并已成功用于研究味觉感知中的多个基本问题，包括盐味编码11、由食物经验调节的味觉可塑性22，以及食物质构感知的分子基础33。总之，这种基于培养皿的双选实验是研究果蝇如何感知内外营养环境以引发适当摄食行为的有力工具。

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方案

1. 组装检测室

注意：虽然本方案描述使用35 mm的培养皿（图1A），但也可使用任何可被平分且可加盖的防水、底部光滑的容器来达到理想效果。

  1. 首先，将一个带盖的 35 mm 培养皿沿中线剖分为二：用防水胶将一段塑料（宽 5 mm，高 3 mm）固定在培养皿中线上，形成两个不渗漏的独立腔室。需确认密封完全，以避免泄漏导致两种待测食物基质混合。
    ​注意：组装完成后，只要密封完好，该装置可重复使用。

2. 准备饥饿瓶

  1. 准备足够数量的空塑料果蝇培养瓶；然后在瓶底松散地压实一小块纸巾。压实程度应足以填满瓶底空间，但不可过于紧密而形成致密团块。
    注意：确保纸巾无较深的缝隙或褶皱，以免果蝇被困其中。
  2. 向瓶内加入约 3 mL 纯水，使纸巾完全饱和，但无积水。确保瓶壁上无较大的多余水滴。或者，可用琼脂糖替代浸湿的纸巾：通过向每个空瓶中加入 5 mL 1% w/v 琼脂糖溶液（不含蔗糖），并在室温下使其凝固，制备替代基质。

3. 实验前果蝇的饥饿处理

  1. 在实验前24小时开始饥饿处理。在CO2麻醉条件下，将约70只、2至4日龄的果蝇按基因型分组放入已准备好的饥饿培养管中，并在每根培养管上标注基因型和饥饿处理时间。

4. 试剂准备

  1. 染料的制备
    ​注意：在进行任何实验之前，重要的是先进行预实验对照，以确定所用红色和蓝色染料的合适浓度。
    1. 对照实验中，为每种染料配制一系列稀释浓度，并使用含不同颜色染料的相同食物进行摄食实验。利用实验结果确定两种染料的浓度（一种红色，一种蓝色），使得在未添加实验化合物时，摄食指数（PI）约为0（参见第7节）。
      注意：例如，最终蓝色染料浓度固定为 50 µM，并与一系列红色染料浓度进行测试。根据红色染料的剂量曲线，最佳红色染料浓度为 210 µM，此时染料偏差最小（图1B）。较高的红色染料浓度会促使果蝇偏好红色食物，而较低的浓度则会促使果蝇偏好蓝色食物。应以1 µM为增量，仔细调整蓝色或红色染料的浓度，因为等于或大于该幅度的浓度差异均可能影响实验结果。
  2. 1% 琼脂糖的制备
    1. 将0.5 g琼脂糖与50 mL纯水（或按比例增加的相应倍数）混合 在微波炉适用的容器中加热琼脂糖溶液至完全溶解，必要时进行搅拌。
  3. 其他食物成分的制备
    1. 将每种食物成分（包括蔗糖和任何实验化合物）溶解于水中，配制成最终测试浓度100倍或更高浓度的溶液。
      ​注意：添加到1%琼脂中的每种食物成分的总体积不应超过每10 mL熔融琼脂1 mL，否则琼脂糖浓度过低，将无法正常凝固。
  4. 食品培养基的制备
    1. 将琼脂、染料和所需的实验化合物加入锥形聚丙烯离心管（15 或 50 mL）中；对照食物中使用水代替实验性味物质。在琼脂仍完全呈液态时进行混合，并使用涡旋振荡器充分混匀。未使用时将离心管置于 60 °C 水浴中，以防止琼脂在分装入培养皿前凝固。
  5. 准备实验用的培养皿
    注意：开始前请确保所有培养皿完全干燥。
    1. 将1 mL红色实验性食物培养基用移液器加入检测培养皿的一侧（图1A）；根据需要重复此步骤至所需数量的培养皿。让琼脂糖冷却至凝固（3-5 分钟），然后用移液器将 1 mL 蓝色对照食物加入培养皿的另一侧（图1A）。对对照红色/实验蓝色组合重复此过程。
      ​注意：实验开始前请确保所有培养皿已完全凝固，并在30分钟内使用。

5. 启动双向喂养实验

  1. 将实验果蝇品系暂时置于冰上使其麻痹，直至观察不到飞行和爬行等明显运动活动。果蝇 immobilized 后，轻轻倒置试管，轻敲以将所有果蝇转移至检测室。
    注意：冷休克处理约需 3–5 分钟。长时间暴露于低温可能影响果蝇的生理状态和健康，应避免。
  2. 迅速将盖子盖在检测室上并放置一旁。待所有果蝇转移完成后，将所有检测室移至黑暗密闭空间。让实验持续运行 90 分钟。
    ​注意：黑暗环境可最大限度减少果蝇视觉通路对摄食行为的影响，并消除培养皿外部的任何环境线索。

6. 终止双向喂养实验

  1. 90 分钟后，将培养室转移至 -20 °C 冰箱中以处死果蝇。约 1 小时后，统计果蝇数量。
    ​注意：在将每个培养皿放入冰箱前应先将其倒置，以确保果蝇不会被冻结在培养基上。

7. 分配偏好指数（PI）以确定食物偏好

  1. 在标准解剖显微镜下，观察每个培养皿中果蝇的腹部颜色。根据其腹部颜色将果蝇计数为红色、蓝色或紫色（图2A）。若果蝇腹部着色面积超过50%，表明摄食充分，则将其计入（图2B）；若果蝇腹部仅有微小的食物斑点，表明摄食不良，则不予计入（图2C）。
  2. 在统计完摄取蓝色食物、红色食物或同时摄取蓝红两种食物的果蝇数量后，使用以下公式为每个培养皿计算偏好指数（preference index, PI）：

PI = （取食实验食物的果蝇数量 - 取食对照食物的果蝇数量）/（取食实验食物的果蝇数量 + 取食对照食物的果蝇数量 + 同时取食两种食物的果蝇数量）

PI > 0 表示对实验化合物有偏好，PI < 0 表示对实验化合物有厌恶，PI = 0 表示该化合物对摄食行为无影响。

8. 清洗检测室

  1. 立即清洁培养皿，刮除食物基质，并用无香味的肥皂和水冲洗。将培养皿在蒸馏水中浸泡过夜。检查每个培养皿的分隔密封是否仍然防水，然后让培养皿自然晾干。
    注意：确认无残留琼脂糖或染料染色后，培养皿即可再次使用。

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结果

在本实验中，将一个35 mm的培养皿分为两个相等的取食区域，培养皿的每一半均含有与蓝色或红色染料偶联的琼脂糖食物（图1A）。为排除染料偏好性的影响，通过精细优化蓝色和红色染料的浓度，使得仅加入这两种染料时，摄食偏好指数（PI）接近“0”（图1B）。当培养皿中加入待测食物后，将约70只经过湿润饥饿处理的2-4日龄成年果蝇转移至培养皿中，使其在黑暗条件下自由选择两种食物。90分钟后，使用解剖显微镜观察果蝇腹部的颜色。通常情况下，若果蝇主要摄取蓝色或红色食物，其腹部分别呈现蓝色或红色（图2A）；若果蝇同时摄取蓝色和红色食物，则其腹部呈现紫色（图2A）。

摄入大量食物的果蝇被记录下来（图2B），而摄入食物不足的果蝇则被排除（图2C）。将...

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讨论

该方法包含多个关键步骤，其中可能出现问题。首先，需确保果蝇摄入足量的食物，以获得稳定的数据。如果果蝇进食不佳，应确保其已进行至少24小时的湿饥饿处理，并且实验培养基中含有至少最低限度的蔗糖浓度（2 mM）。为进一步促进摄食，可根据果蝇的生理状态将湿饥饿时间延长至24小时以上。若过多果蝇无法耐受延长的饥饿时间，请确保在试管中进行湿饥饿处理时，向滤纸中添加足够的水分，但避免水分过多导致果蝇溺亡。其次，若蓝色和红色染料的浓度未精确平衡，果蝇往往会对其中一种染料产生摄食偏好。染料浓度的微小差异都可能对摄食行为产生显著影响（图1B）。因此，为避免染料偏好，必须精确控制染料浓度。如果发现果蝇对染料存在偏好，应以1 µM为增量精细调整染料浓度，并测试不同的染料组合，以确定在仅添加低浓度蔗糖（例如2 mM）而无其他实验化合物时，能使偏好指数（PI）等于0的红/蓝染料浓度配对。在测试新的果蝇品系或配制新的染料储备液后，应重新优化红色或蓝色染料的浓度。第三，务必确保实验时长严格控制在90分钟以内。根据先前的研究22 ，长时间摄食可能导致味觉...

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披露

作者声明不存在利益冲突或竞争性经济利益。

致谢

作者感谢Tingwei Mi博士在优化双选摄食实验方面提供的帮助。作者还感谢Samuel Chan和Wyatt Koolmees对稿件提出的修改意见。本项目由美国国立卫生研究院资助，资助编号为R03 DC014787（Y.V.Z.）和R01 DC018592（Y.V.Z.），以及由安布罗斯·莫内尔基金会资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
35 mm 培养皿Fisher Scientific08-772E
琼脂糖Thomas ScientificC756P56
透明粘合剂Fisher ScientificNC9884114
锥形离心管Fisher Scientific05-527-90
解剖显微镜AmscopeSM-2T-6WB-V331
FCF 亮蓝Wako Chemical3844-45-9
Fly CO2 麻醉装置Genesee Scientfic59-114/54-104M
具有可编程昼夜循环的果蝇培养箱Powers Scientific Inc.IS33SD
果蝇品系
玻璃培养皿（可微波加热）
吸水纸（Kimwipes）Fisher Scientific06-666A
培养基储存瓶Fisher Scientific50-192-9998
塑料分隔板（从厚度不超过 5 mm 的塑料板上裁剪以适配培养皿）
塑料果蝇培养管Genesee Scientific32-116
蔗糖Millipore SigmaS9378
磺基罗丹明 BMillipore SigmaS9012
待研究的味觉刺激化合物
涡旋混合器Benchmark ScientificBV1000
水浴锅Fisher ScientificFSGPD05

参考文献

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