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方法文章

利用巯基乙酸（TGA）测定植物生物量中的木质素含量

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DOI：

10.3791/62055

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2021年7月24日

 ,  , 
1Department of Plant and Soil Science, Texas Tech University, 2Fiber and Biopolymer Research Institute (FBRI), Department of Plant and Soil Science, Texas Tech University

本文内容

摘要

本文介绍了一种改良的热重分析法（TGA），用于估算草本植物生物质中的木质素含量。该方法通过与木质素形成特定的硫醚键来测定木质素含量，相较于克拉森法具有优势，因其仅需较少样品即可完成木质素含量的测定。

摘要

木质素是一种天然聚合物，是地球上含量仅次于纤维素的第二大丰富聚合物。木质素主要沉积于植物的次生细胞壁中，是一种芳香族杂聚物，主要由三种具有重要工业价值的单木质醇组成。木质素在植物生长发育过程中发挥重要作用，并提供保护 在生物和非生物胁迫耐受性、动物饲料品质、木材以及工业木质素产品方面具有重要作用。准确测定木质素含量对于深入理解木质素生物合成机制以及生物质的工业应用均至关重要。巯基乙酸（TGA）法是一种高度可靠的植物生物质总木质素含量测定方法。该方法通过木质素中的苄醇基团与巯基乙酸反应生成在碱性条件下可溶、酸性条件下不溶的硫醚化合物，从而定量木质素。总木质素含量的测定采用商业竹子木质素绘制的标准曲线进行估算。

引言

木质素是植物细胞壁中重要的承重组分之一，也是地球上第二丰富的聚合物1。从化学结构上看，木质素是一种由高分子量复杂酚类化合物交联而成的杂聚物，构成了芳香族聚合物的天然可再生来源，并可用于生物材料的合成2,3。这种天然聚合物在植物生长、发育、存活、机械支撑、细胞壁刚性、水分运输、矿质运输、抗倒伏性、组织和器官形成、能量沉积以及抵御生物和非生物胁迫等方面发挥着重要作用4,5,6,7。木质素主要由三种不同的单体木脂醇组成：松柏醇、芥子醇和对香豆醇，它们均来源于苯丙烷代谢途径8,9。木质素的含量及其单体组成因植物种类、组织/器官类型以及植物发育的不同阶段而异10。根据来源和单体木脂醇的组成，木质素 broadly 被分为软木木质素、硬木木质素和禾本科木质素。软木木质素主要由95%的松柏醇组成，含4%的对香豆醇和1%的芥子醇；硬木木质素中松柏醇与芥子醇的比例大致相等；而禾本科木质素则含有不同比例的松柏醇、芥子醇和对香豆醇11,12。单体的组成至关重要，因为它决定了木质素的强度、降解特性以及细胞壁的分解能力，同时也影响其分子结构、支化程度以及与其他多糖的交联情况13,14。

木质素研究因其低成本和高丰度，在牧草、纺织工业、造纸工业以及生物乙醇、生物燃料和生物制品领域正变得日益重要15,16。已用于木质素定量分析的方法包括多种化学方法（如乙酰溴法、酸性洗涤剂法、Klason法和高锰酸盐氧化法）以及仪器分析方法（如近红外（NIR）光谱法、核磁共振（NMR）光谱法和紫外（UV）分光光度法）9,17。木质素的分析方法通常根据电磁辐射、重量法和溶解度进行分类。基于 电磁辐射测定木质素的原理依赖于木质素的 化学特性，即其在特定波长下吸收光。该方法的测定依据是木质素对紫外光的吸收能力强于碳水化合物。1962年，Bolker和Somerville使用氯化钾压片法测定木材中的木质素含量18。然而，由于草本样品中存在非木质素酚类化合物且缺乏合适的消光系数，该方法在测定草本样品木质素含量时存在局限性。1970年，Fergus和Goring发现愈创木基和丁香基化合物的最大吸收波长分别为280 nm和270 nm，从而修正了Bolker与Somerville方法中的消光系数问题19。此后，红外光谱法作为一种对酚类物质高度敏感的技术，也被用于仅需少量植物生物量样品的木质素测定。其中一项技术实例 为漫反射傅里叶变换光谱法。然而，该方法缺乏类似于紫外法的标准化体系20。随后，人们也采用近红外光谱（NIRS）和核磁共振（NMR）技术测定木质素含量。尽管这些方法存在一些缺点，但其优势在于不会改变木质素的化学结构，从而保持其纯度20。

重力法Klason法是测定木本茎秆中木质素含量最直接且最可靠的分析方法。重力法测定木质素的基础是通过水解或溶解非木质素组分，并收集不溶性木质素进行称重定量21。该方法利用浓H2SO4对生物质进行水解，去除碳水化合物，从而提取木质素残渣20,22。通过该方法测定的木质素含量被称为酸不溶性木质素或Klason木质素。Klason法的应用取决于植物种类、组织类型以及细胞壁类型。由于单宁、多糖和蛋白质等非木质素组分含量存在差异，会导致酸不溶性/可溶性木质素含量测定结果出现相应偏差。因此，Klason法仅推荐用于高木质素含量的生物质（如木本茎秆）的木质素测定17,23。乙酰溴法（AcBr）、酸不溶性木质素法和巯基乙酸法（TGA）等溶解性方法是目前最常用的多种植物生物质来源中木质素含量测定方法。Kim等人建立了两种基于溶解作用的木质素提取方法：第一种方法通过溶解纤维素和半纤维素，将木质素以不溶性残渣形式提取；第二种方法则将木质素分离至可溶性组分中，而纤维素和半纤维素保留在不溶性残渣中24。

基于溶解度的木质素含量测定方法包括巯基乙酸（TGA）法和乙酰溴（AcBr）法25。TGA法和乙酰溴法均通过测定溶解的木质素在280 nm处的吸光度来估算木质素含量；然而，AcBr法在木质素溶解过程中会降解木聚糖，导致木质素含量出现假性升高26。相比之下，巯基乙酸（TGA）法更为可靠，因其依赖于TGA与木质素中苄醇基团的硫醚基团之间的特异性结合。TGA结合的木质素在酸性条件下（使用HCl）沉淀析出，并通过测定其在280 nm处的吸光度来估算木质素含量27。TGA法还具有其他优势，包括对木质素结构的修饰较少、以可溶形式进行木质素测定、非木质素组分的干扰较小，以及由于与TGA的特异性结合而实现更精确的木质素定量。

该热重分析（TGA）方法根据用于木质素含量测定的植物生物质样品类型进行了修改。本文中，我们对水稻秸秆的快速TGA方法27进行了修改和优化，以适用于棉花组织中的木质素含量测定。简言之，将干燥的粉末状植物样品先后用蛋白溶解缓冲液（PSB）和甲醇进行提取，以去除蛋白质及醇溶性组分。所得醇不溶性残渣在酸性条件下经TGA处理，使木质素沉淀。使用市售竹子木质素建立木质素标准曲线，并获得回归直线（y = mx+c）。其中，"x"值采用木质素在280 nm处的平均吸光度值，而"m"和"c"值则来自回归方程，用于计算棉花植物生物质样品中未知的木质素浓度。该方法分为五个阶段：1）植物样品的制备；2）用水和甲醇洗涤样品；3）用TGA和酸处理沉淀物以沉淀木质素；4）木质素的沉淀；5）标准曲线的制备及样品木质素含量的测定。前两个阶段主要涉及植物材料的预处理，包括水、PSB（蛋白溶解缓冲液）和甲醇提取，以获得醇不溶性物质。随后在第三阶段使用TGA（巯基乙酸）和HCl处理，使木质素形成复合物。最后，利用HCl使木质素沉淀，并将其溶解于氢氧化钠溶液中，测定其在280 nm处的吸光度28。

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方案

1. 植物样品的制备

  1. 从温室中采集两个月大的棉花植株（图1A).
  2. 轻轻翻转花盆，通过松动植株周围的土壤，使土壤与根系分离，保留完整的侧根图1B).
  3. 用盛有水的托盘彻底清洗采集的植物，以去除所有污物（适用于根部样本）图1C).
  4. 使用纸巾将分离的根、茎和叶组织擦干，并做好标记（图1D）。在室温下风干2天，以防止真菌污染（图1E).
  5. 将样品组织转移至已标记的容器或铝箔中，在温度可控的培养箱中于 49 °C 孵育 7 至 10 天（图1F).
    注意：较高的温度可能会改变木质素结构。或者，可使用冷冻干燥机对样品干燥1至2天，此过程不会引起植物生物量的任何化学变化。
  6. 使用刀片将培养箱干燥的组织切成5 mm大小的片段，或者 alternatively 使用生物质研磨仪研磨植物组织（图1G, 图1H).
    注意：每次切割或研磨样品后，必须清洁生物质研磨机/刀片。
  7. 将切割后的组织/研磨过的植物材料转移至研磨管中，使用冷冻研磨机或液氮研磨仪在液氮条件下研磨成约1毫米粒径的细粉2.
  8. 以每分钟10个循环（每个循环持续2分钟）的速度研磨样品，共进行3个循环，直至形成均匀的粉末图1I, 1J, 1K).
    ​注意：实验在此步骤可以暂停，样品可置于密闭容器中，于室温下长期保存。

2. 使用水、PSB 和甲醇洗涤样品

  1. 在实验记录本中测量并记录用于实验室中木质素含量测定的所有空的 2 mL 微量离心管的重量。
  2. 将 20 mg 研磨后的样品粉末转移至已预先称重的离心管中。称量装有组织及组织粉末的离心管重量，并在实验记录本中记录这些重量。
  3. 将所有装有 20 mg 组织粉末的 2 mL 微量离心管（管盖打开）放入 60 °C 的加热块或烘箱中孵育 1 小时。
  4. 孵育后，在室温（RT）下冷却样品 10 分钟。
  5. 向每个微量离心管中加入 1.8 mL 水，并通过涡旋混合。然后在室温下以 25,200 × g（15,000 rpm）离心 10 分钟，弃去上清液（图 2）。
  6. 向每个保留的沉淀中加入 1.8 mL 蛋白溶解缓冲液（PSB）（表 1），并通过涡旋混合。在室温下以 25,200 × g（15,000 rpm）离心 10 分钟，弃去上清液。
  7. 对每个样品重复步骤 2.6 一次。
  8. 向每个沉淀中加入 1.8 mL 水，通过涡旋混合，然后在室温下以 25,200 × g（15,000 rpm）离心 10 分钟。离心后，保留沉淀并弃去上清液。
  9. 向保留的沉淀中加入 1.8 mL 甲醇，并在 60 °C 加热块中孵育 20 分钟。然后在室温下以 25,200 × g（15,000 rpm）离心 10 分钟。离心后，弃去上清液并保留沉淀（图 2）。
  10. 对每个样品重复步骤 2.9 一次。
  11. 在室温下风干沉淀，或立即进行真空干燥。在 30 °C 下使用真空干燥器干燥 2 至 3 小时，或直至沉淀完全干燥。
    注意：实验可在此处暂停，通过过夜风干，或继续进行真空干燥。
  12. 干燥后，称量含有干燥沉淀的样品管，并在实验记录本中将该重量与相应空管重量并列记录。通过减去两个数值估算沉淀重量。这些重量将在木质素提取过程结束时用于木质素含量的测定。
  13. 在木质素提取的此阶段，加入商品化竹子木质素以制备木质素标准曲线。将商品化竹子木质素分别称取至不同的离心管中，浓度范围为 0.5 mg 至 5 mg，以 0.5 mg 为增量（即 0.5 mg、1 mg、1.5 mg、2 mg、3 mg、3.5 mg、4 mg、4.5 mg 和 5.0 mg）。每个浓度测定三次，以获得三个技术重复。
    ​注意：从本步骤开始，上述所测的标准品将与干燥后的样品以相同方式处理。

3. 使用TGA和酸处理沉淀物以沉淀木质素

  1. 将上一步骤处理的样品以及测定用标准品进行TGA（巯基乙酸）处理。
  2. 向每个沉淀物中加入1 mL的3 N HCl（表1）和100 µL TGA。
  3. 涡旋混匀后，在通风橱内的80 °C预热金属浴中孵育3小时（图2）。
    注意：80 °C加热步骤必须密切监控。压力过高可能导致管盖弹开，造成化学品泄漏。建议使用螺旋盖管，但也可使用2 mL离心管并松开管盖，以防止此类泄漏。
  4. 孵育结束后，将离心管在室温下冷却10–15分钟，随后在室温下以25,200 × g（15,000 rpm）离心10分钟。
    注意：酸和有机溶剂产生的废液必须分开收集，并储存在带通风盖的玻璃容器中。TGA-酸废液和普通酸废液应分别使用不同的玻璃容器收集。
  5. 离心后，弃去上清液，保留沉淀物。加入1 mL水，涡旋混匀，然后在室温下以25,200 × g（15,000 rpm）离心10分钟。
  6. 离心后，弃去上清液，将沉淀物重悬于1 N NaOH中，在37 °C低速摇床/恒温混匀器中孵育24小时（图2）。
    注意：此孵育时间可缩短至1小时7。
  7. 孵育结束后，将2 mL微量离心管在室温下以25,200 × g（15,000 rpm）离心10分钟。保留上清液用于后续步骤。
    ​注意：该操作涉及使用强酸及其他具有腐蚀性的化学品，因此在整个木质素测定过程中建议穿戴适当的个人防护装备（PPE）。TGA具有强烈刺激性气味且具腐蚀性，建议仅在通风橱内使用。

4. 木质素的沉淀

  1. 将上清液转移至新的2 mL离心管中，并加入200 µL浓盐酸。在4 °C下孵育4小时或过夜（图2）。
    注意：可通过将冷藏步骤延长至过夜，在此暂停提取过程。
  2. 在室温下以25,200 × g（15,000 rpm）离心10分钟，并将沉淀溶解于1 mL的1 N NaOH中。
  3. 在室温下置于摇床上孵育10分钟，使沉淀完全悬浮于NaOH中。
  4. 最后，使用分光光度计在280 nm处测定样品的吸光度，并与标准木质素曲线进行比较。
  5. 利用标准曲线回归线数值以及提取样品在280 nm处的吸光度，测定未知木质素浓度。

5. 标准曲线制备及样品中木质素含量测定

  1. 以与TGA处理的实验样品相同的方式处理木质素标准品。
  2. 测定市售竹子木质素标准品，以0.5 mg为增量，依次取0.5 mg、1 mg、1.5 mg、2 mg、2.5 mg、3.0 mg、3.5 mg、4.0 mg、4.5 mg和5 mg，经TGA处理后用HCl处理，再溶于1 N NaOH中，随后在280 nm处测定吸光度（图3A）。
  3. 利用木质素浓度和吸光度读数生成标准木质素曲线的散点图（图3B）。
  4. 使用散点图中生成的回归直线 y = mx + c，根据提取样品在280 nm处平均吸光度所得的"x"值，以及木质素标准曲线回归直线提供的"m"和"c"值，估算待测样品中未知的木质素含量。
  5. 将回归方程中得到的y值所对应的木质素含量除以甲醇提取后真空/风干植物生物量样品的总重量（单位为mg，约15 mg），得到每mg样品中的木质素浓度；然后将该值乘以100，计算每mg样品中的木质素百分比。

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结果

比较了两个不同棉花实验品系在不同组织中木质素含量的差异。在280 nm处测定各样本提取的木质素含量，并记录其相应的吸光度值。将每个生物学重复的平均吸光度值与木质素标准曲线的回归线（表2，图3C）进行比较。利用回归线方程 y = mx + c 计算两个提取实验品系（样本1和样本2）中未知的木质素含量。将测得的平均OD值代入“x”，并将木质素标准曲线回归线中的“m”和“c”值代入方程，从而得到木质素浓度“y”（单位：mg）（表3，图3B）。下一步，为计算每1 mg样品中的木质素含量，需将“y”值除以甲醇提取后样品的重量（15 mg）。随后，为换算成每克（= 1,000 mg）样品中的含量，将 y/15 的值乘以 1,000。为获得木质素百分比，将 y/15 的值除以 1,000 后再乘以 100。对三个生物学重复（每个品系，样本1和样本2）的木质素百分比取平均值后进行比较，结果显示样本1为11.7%，样本2为10.3%。不同生物学重复间的木质素数值具有一致...

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讨论

木质素在植物生长和发育中起着重要作用，近年来在生物燃料、生物能源和生物产品的应用方面得到了广泛研究。木质素富含芳香族化合物，存在于所有维管植物的次生细胞壁中。它具有多种工业用途，例如用于木板制品、生物分散剂、絮凝剂、聚氨酯泡沫以及电路板树脂29,30,31。造纸和制浆工业产生的大部分木质素作为废弃物被排放或燃烧以产生热能。因此，如果能够高效加工，木质素可被用作化石燃料基产品的替代品32,33，也可用于生物发电34。因此，准确测定木质素含量和组分对于工业应用至关重要，因为其组分因植物种类及植物器官类型的不同而存在差异。木质素测定的主要局限性在于所选用测定方法本身带来的差异35。不同方法之间的测定差异主要源于其他非木质素组分的污染、溶解度的差异、...

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披露

作者声明不存在利益冲突。

致谢

我们感谢植物系 & 土壤科学与棉花公司对本研究的部分资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
生物分光光度计（动力学型）Eppendorf kinetic6136000010用于测定 280 nm 处的吸光度
离心机Eppendorf5424用于离心 样品
商用竹木质素Aldrich1002171289用于标准曲线的制备
蒸馏水Fischer Scientific16690382用于实验方案中
Falcon 管VWR734-0448溶液容器
冷冻研磨仪Spex Sample Prep68-701-15用于植物组织样品的精细研磨
加热块/热混仪Eppendorf13527550用于木质素提取过程中的温度控制步骤
加热磁力搅拌器WalterWP1007-HS用于溶液的配制
盐酸（HCl）Sigma221677用于实验方案中
培养箱Fisherbrand150152633用于植物组织样品的彻底干燥
电子天平Mettler Toledo30243386用于称量植物组织重量、标准品及微量离心管
甲醇（100%）Fischer Scientific67-56-1用于实验方案中
微量离心管（2 mL）MicrocentrifugeZ628034-500EA用于木质素提取的容器
植物生物质研磨器HanchenAmazon用于粉碎干燥样品
pH 计Fisher ScientificAE150用于测定木质素提取所用溶液的 pH 值
温控培养箱/烘箱Fisher Scientific15-015-2633用于实验方案中
巯基乙酸（TGA）Sigma Aldrich68-11-1用于实验方案中
真空干燥器Eppendorf22820001用于样品干燥
涡旋混合器Eppendorf3340001用于样品的充分混匀

参考文献

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