利用巯基乙酸（TGA）测定植物生物量中的木质素含量

摘要

本文介绍了一种改良的热重分析法（TGA），用于估算草本植物生物质中的木质素含量。该方法通过与木质素形成特定的硫醚键来测定木质素含量，相较于克拉森法具有优势，因其仅需较少样品即可完成木质素含量的测定。

摘要

木质素是一种天然聚合物，是地球上含量仅次于纤维素的第二大丰富聚合物。木质素主要沉积于植物的次生细胞壁中，是一种芳香族杂聚物，主要由三种具有重要工业价值的单木质醇组成。木质素在植物生长发育过程中发挥重要作用，并提供保护 在生物和非生物胁迫耐受性、动物饲料品质、木材以及工业木质素产品方面具有重要作用。准确测定木质素含量对于深入理解木质素生物合成机制以及生物质的工业应用均至关重要。巯基乙酸（TGA）法是一种高度可靠的植物生物质总木质素含量测定方法。该方法通过木质素中的苄醇基团与巯基乙酸反应生成在碱性条件下可溶、酸性条件下不溶的硫醚化合物，从而定量木质素。总木质素含量的测定采用商业竹子木质素绘制的标准曲线进行估算。

引言

木质素是植物细胞壁中重要的承重组分之一，也是地球上第二丰富的聚合物¹。从化学结构上看，木质素是一种由高分子量复杂酚类化合物交联而成的杂聚物，构成了芳香族聚合物的天然可再生来源，并可用于生物材料的合成^2,3。这种天然聚合物在植物生长、发育、存活、机械支撑、细胞壁刚性、水分运输、矿质运输、抗倒伏性、组织和器官形成、能量沉积以及抵御生物和非生物胁迫等方面发挥着重要作用^4,5,6,7。木质素主要由三种不同的单体木脂醇组成：松柏醇、芥子醇和对香豆醇，它们均来源于苯丙烷代谢途径^8,9。木质素的含量及其单体组成因植物种类、组织/器官类型以及植物发育的不同阶段而异¹⁰。根据来源和单体木脂醇的组成，木质素 broadly 被分为软木木质素、硬木木质素和禾本科木质素。软木木质素主要由95%的松柏醇组成，含4%的对香豆醇和1%的芥子醇；硬木木质素中松柏醇与芥子醇的比例大致相....

方案

1. 植物样品的制备

1. 从温室中采集两个月大的棉花植株（图1A).
2. 轻轻翻转花盆，通过松动植株周围的土壤，使土壤与根系分离，保留完整的侧根图1B).
3. 用盛有水的托盘彻底清洗采集的植物，以去除所有污物（适用于根部样本）图1C).
4. 使用纸巾将分离的根、茎和叶组织擦干，并做好标记（图1D）。在室温下风干2天，以防止真菌污染（图1E).
5. 将样品组织转移至已标记的容器或铝箔中，在温度可控的培养箱中于 49 °C 孵育 7 至 10 天（图1F).
   注意：较高的温度可能会改变木质素结构。或者，可使用冷冻干燥机对样品干燥1至2天，此过程不会引起植物生物量的任何化学变化。
6. 使用刀片将培养箱干燥的组织切成5 mm大小的片段，或者 alternatively 使用生物质研磨仪研磨植物组织（图1G, 图1H).
   注意：每次切割或研磨样....

结果

比较了两个不同棉花实验品系在不同组织中木质素含量的差异。在280 nm处测定各样本提取的木质素含量，并记录其相应的吸光度值。将每个生物学重复的平均吸光度值与木质素标准曲线的回归线（表2，图3C）进行比较。利用回归线方程 y = mx + c 计算两个提取实验品系（样本1和样本2）中未知的木质素含量。将测得的平均OD值代入“x”，并将木质素标准曲线回归线中的“m”和“c”值代入方程，从而得到木质素浓度“y”（单位：mg）（表3，图3B）。下一步，为计算每1 mg样品中的木质素含量，需将“y”值除以甲醇提取后样品的重量（15 mg）。随后，为换算成每克（= 1,000 mg）样品中的含量，将 y/15 的值乘以 1,000。为获得木质素百分比，将 y/15 的值除以 1,000 后再乘以 100。对三个生物学重复（每个品系，样本1和样本2）的木质素百分比取平均值后进行比较，结果显示样本1为11.7%，样本2为10.3%。不同生物学重复间的木质素数值具有一致.......

讨论

木质素在植物生长和发育中起着重要作用，近年来在生物燃料、生物能源和生物产品的应用方面得到了广泛研究。木质素富含芳香族化合物，存在于所有维管植物的次生细胞壁中。它具有多种工业用途，例如用于木板制品、生物分散剂、絮凝剂、聚氨酯泡沫以及电路板树脂^29,30,31。造纸和制浆工业产生的大部分木质素作为废弃物被排放或燃烧以产生热能。因此，如果能够高效加工，木质素可被用作化石燃料基产品的替代品^32,33，也可用于生物发电³⁴。因此，准确测定木质素含量和组分对于工业应用至关重要，因为其组分因植物种类及植物器官类型的不同而存在差异。木质素测定的主要局限性在于所选用测定方法本身带来的差异³⁵。不同方法之间的测定差异主要源于其他非木质素组分的污染、溶解度的差异、.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
生物分光光度计（动力学型）	Eppendorf kinetic	6136000010	用于测定 280 nm 处的吸光度
离心机	Eppendorf	5424	用于离心 样品
商用竹木质素	Aldrich	1002171289	用于标准曲线的制备
蒸馏水	Fischer Scientific	16690382	用于实验方案中
Falcon 管	VWR	734-0448	溶液容器
冷冻研磨仪	Spex Sample Prep	68-701-15	用于植物组织样品的精细研磨
加热块/热混仪	Eppendorf	13527550	用于木质素提取过程中的温度控制步骤
加热磁力搅拌器	Walter	WP1007-HS	用于溶液的配制
盐酸（HCl）	Sigma	221677	用于实验方案中
培养箱	Fisherbrand	150152633	用于植物组织样品的彻底干燥
电子天平	Mettler Toledo	30243386	用于称量植物组织重量、标准品及微量离心管
甲醇（100%）	Fischer Scientific	67-56-1	用于实验方案中
微量离心管（2 mL）	Microcentrifuge	Z628034-500EA	用于木质素提取的容器
植物生物质研磨器	Hanchen	Amazon	用于粉碎干燥样品
pH 计	Fisher Scientific	AE150	用于测定木质素提取所用溶液的 pH 值
温控培养箱/烘箱	Fisher Scientific	15-015-2633	用于实验方案中
巯基乙酸（TGA）	Sigma Aldrich	68-11-1	用于实验方案中
真空干燥器	Eppendorf	22820001	用于样品干燥
涡旋混合器	Eppendorf	3340001	用于样品的充分混匀