使用硫二甘酸（TGA）估计植物生物质木质素含量

木质素是植物细胞壁的重要承重成分之一，也是地球上第二丰富的聚合物^1。从化学上讲，木质素是一种由高分子量复合酚类化合物组成的交联异质体，形成芳香聚合物的天然可再生来源，并合成生物材料^2、3。这种天然聚合物在植物生长、发育、生存、机械支持、细胞壁刚性、水运、矿物运输、耐食性、组织和器官发育、能量沉积以及生物和生物应力^{4、5、6、7}等方面起着重要作用。利格宁主要由三种不同的单酚组成:针叶醇、西纳皮尔和p-coumaryl酒精，它们来自苯丙酮通路^8，9。木质素的数量和单体的组成因植物种类、组织/器官类型和^{植物发育的}不同阶段而异。根据来源和单酚成分，木质素大致分为软木、硬木和草木质素。软木主要由95%的针叶醇和4%的p-coumaryl和1%的甲基醇组成。硬木有针叶醇和甲基醇的比例相等，而草木质素是由针叶醇，锡那皮尔和p-coumaryl酒精^11，12的不同比例组成。单体的组成至关重要，因为它决定了细胞壁的木质素强度、分解和降解，以及确定分子结构、分支和与其他多糖^13、14的交叉连接。

由于其成本低^、丰度高，在觅食、纺织业、造纸业以及生物乙醇、生物燃料和生物制品方面，木质素研究越来越受到^重视。各种化学方法（如乙酰溴化物、酸洗涤剂、克拉森和高锰酸盐氧化）以及仪器方法（如近红外（NIR）光谱、核磁共振（NMR）光谱和紫外线（UV）光谱仪）用于木质素定量^9、17。木质素的分析方法一般根据电磁辐射、重力和溶解度进行分类。电磁辐射对木质素的估计原理是基于木质素的化学特性，木质素吸收特定波长的光。这些结果的估计依据是，木质素比碳水化合物具有更强的紫外线吸收性。1962年，博尔克和萨默维尔使用氯化钾颗粒来估计木材^中的木质素含量。然而，由于存在非木质素酚类化合物，且缺乏适当的灭绝系数，这种方法在草本样品中木质素含量的估计存在缺陷。1970年，弗格斯和戈林发现瓜亚西尔和注射器的复合吸收最大度为280纳米和270纳米，这纠正了博尔克和萨默维尔方法¹⁹的灭绝系数问题。后来，红外光谱学，一种高度敏感的表诺菌特征技术，也用于木质素估计与少量植物生物质样品。这种技术的一个例子是扩散反射傅立雅转换光谱仪。然而，这种方法缺乏一个类似于紫外线方法²⁰的适当标准。后来，NIRS（近红外光谱）和NMR（核磁共振光谱）估计了木质素含量。虽然这些方法有缺点，但它们不会改变木质素的化学结构，保持其纯度^20。

重度克拉森法是木质茎木质素估计的直接和最可靠的分析方法。重力木质素估计的基础是非木质化合物的水解/溶解和重力²¹不溶性木质素的收集。在这种方法中，通过浓缩H₂SO₄对生物量进行水解，提取木质素残留物^{20、22。。}这种方法估计的木质素含量称为酸不溶性木质素或克拉森木质素。克拉森方法的应用取决于植物种类、组织类型和细胞壁类型。单宁、多糖和蛋白质等非木质素成分的可变量存在，导致酸不溶性/可溶性木质素含量的估计存在成比例差异。因此，只建议采用克拉森法，用于木质素对木质茎等高木质物质含量生物量的估计^。溶解性方法，如乙酰溴化物（AcBr）、酸不溶性木质素和硫二甘醇酸（TGA），是估计各种植物生物质来源木质素含量的最常用方法。Kim等人建立了两种通过溶解提取木质素的方法。第一种方法通过溶解纤维素和半纤维素提取木质素作为不溶性残留物，而第二种方法将木质素分离在可溶性部分，将纤维素和血细胞素作为不溶性残留物^24。

在木质素估计中采用的类似方法基于溶解性是硫二甲酸 （TGA） 和乙酰溴化物 （AcBr） 方法²⁵.TGA和乙酰溴化物方法均通过测量溶解木质素在280纳米的吸收量来估计木质素含量:然而，AcBr方法在木质素溶解过程中降解木兰，并显示木质素含量²⁶的虚假增加。硫二甲酸酯 （TGA） 方法是更可靠的方法，因为它取决于与木质素的苯甲酸酯醇组与 TGA 的具体结合。TGA结合木质素是在酸性条件下使用HCl沉淀的，木质素的吸收量估计为280nm^27。TGA 方法具有结构修饰较少、木质素估计可溶性、非木质素成分干扰少以及与 TGA 特定结合导致木质素精确估计等额外优点。

这种TGA方法是根据用于木质素含量估算的植物生物质样品的种类进行修改的。在这里，我们修改和调整了快速TGA方法的稻草²⁷棉花组织估计木质素含量。简言之，干粉植物样品经过蛋白质溶解缓冲和甲醇提取，以去除蛋白质和酒精可溶性成分。酒精不溶性残留物在酸性条件下用TGA和沉淀木质素处理。使用商业竹木质素生成木质素标准曲线，并获得回归线（y = mx+c）。"x"值使用280纳米的木质素平均吸收值，而"m"和"c"值则从回归线输入，以计算棉花植物生物质样品中未知的木质素浓度。该方法分为五个阶段:1）植物样品的制备:2） 用水和甲醇清洗样品:3） 用TGA和酸处理颗粒，沉淀木质素:4） 木质素降水:和 5） 样品的标准曲线制备和木质素含量估算。前两个阶段主要侧重于植物材料制备，其次是水、PSB（蛋白质溶解缓冲器）和甲醇提取，以获得酒精不溶性材料。然后，它与TGA（硫二甘油酸）和HCl一起在第三阶段形成木质素复合物。最后，HCl被用来沉淀木质素，木质素溶解在氢氧化钠中，以测量其吸收量在280纳米^28。

1. 植物样本的制备

1. 从温室收集两个月大的棉花植物（图1A）。
2. 通过松开植物周围的土壤（图1B），轻轻翻转植物盆，将土壤和根部与完整的横向根分开。
3. 将收集的植物彻底清洗在装满水的托盘中，以清除所有污垢（用于根部样本）（图1C）。
4. 使用纸巾干燥分离的根、茎和叶组织，并贴上标签（图1D）。空气干燥2天在室温下，以防止任何真菌污染（图1E）。
5. 将样品组织转移到贴有标签的容器/铝箔中，并在温度控制的孵化器中孵化7至10天（图1F）。
   注意:较高的温度可能会改变木质素结构。或者，冷冻干燥机可用于干燥样品 1 到 2 天，而不会对植物生物质造成任何化学变化。
6. 使用刀片将孵化器干燥的组织切成5毫米大小的碎片，或者使用生物质研磨机研磨植物组织（图1G，图1H）。
   注:生物质研磨机/刀片必须在每个样品切割/磨碎后进行清洁。
7. 使用冰柜磨机或低温研磨机将切割组织/生物质接地植物材料转移到研磨小瓶中，并磨成1毫米大小的细_粉末。"
8. 以 10 CPS（每个周期跨度 2 分钟）的速度将样品研磨三个周期，放入均匀粉末（图 1I，1J，1K）。
   注意:此时可以暂停实验，样品可在室温下储存在密封容器中，以便长期储存。

2. 用水、PSB和甲醇清洗样品

1. 测量并记录实验室笔记本中用于木质素含量估算的所有空 2 mL 微胶管的重量。
2. 将20毫克的地面样品粉末转移到预称重管中。用组织和组织粉称重管子，并将这些重量记录在实验室笔记本中。
3. 在加热块中孵化所有 2 mL 微胶管（带打开盖）20 毫克组织粉末，或在 60 °C 下烤箱中孵化 1 小时。
4. 孵化后，在室温下冷却样品10分钟（RT）。
5. 在每个微管中加入 1.8 mL 的水，然后通过漩涡混合。然后，离心机在RT 10分钟内25，200 x g（15，000 rpm），丢弃超自然（图2）。
6. 在每个保留的颗粒中加入 1.8 mL 的蛋白质溶解缓冲 （PSB） （表 1），然后通过漩涡混合。离心机在 RT 的 25，200 x g （15，000 rpm） 10 分钟，并丢弃超母体。
7. 每个示例再次重复步骤 2.6。
8. 在每个颗粒中加入 1.8 mL 的水，通过漩涡混合，在 25，200 x g（15，000 rpm） 下离心机混合 10 分钟。离心后，保存颗粒并丢弃超自然。
9. 在保留的颗粒中，加入 1.8 mL 的甲醇，在 60 °C 的热块中孵育 20 分钟。然后，离心机在RT 10分钟25，200 x g（15，000 rpm）。离心后，丢弃超自然药物并保留颗粒（图2）。
10. 每个示例再次重复步骤 2.9。
11. 空气干燥在RT的颗粒或立即通过真空干燥进行。真空干燥使用真空干燥器在30°C 2至3小时或直到颗粒完全干燥。
    注意:此时可以通过通宵空气干燥或继续真空干燥来暂停实验。
12. 干燥后，用干燥的颗粒称重样品管，并将重量记录在实验室笔记本中各自的空管重量旁边。通过减去两个值来估计颗粒重量。这些重量将用于木质素提取过程结束时的木质素估计。
13. 此时的木质素提取，包括用于生成木质素标准曲线的商业竹木质素。将商用竹木质素测量成从0.5毫克到5毫克不等的单独管，增量0.5毫克（0.5毫克、1毫克、1.5毫克、2毫克、3毫克、3.5毫克、4毫克、4.5毫克和5.0毫克）。测量每个浓度三次，进行三次技术复制。
    注意:从这里开始，上述步骤中测量的标准的处理方式与干燥的样品相同。

3. 用TGA和酸处理颗粒以沉淀木质素

1. 将上述步骤的处理样品以及测量标准，进行 TGA（硫二甲酸）处理。
2. 在每个颗粒中加入 1 mL 的 3 N HCl （表 1）和 100 μL 的 TGA。
3. 在 80 °C 预热热块中涡流和孵育，在烟罩中孵育 3 小时（图 2）。
   注意:必须监控 80 °C 的加热步骤。高压积聚可能会打开盖子，并可能导致化学品泄漏。建议使用螺丝帽管，但在此步骤中可以松散地封顶 2 mL 管，以防止此类溢出。
4. 孵化后，在RT冷却管10-15分钟，离心机在25，200 x g（15，000 rpm）10分钟在RT。
   注:酸和有机溶剂产生的废物必须分离并储存在带通风盖的玻璃容器中。使用单独的玻璃容器收集TGA酸废物和酸废物。
5. 离心后，丢弃超自然药物并保留颗粒。加入1mL的水，通过漩涡混合，离心机在25，200 x克（15，000 rpm）在RT 10分钟。
6. 离心后，丢弃超自然体，在37°C摇床/热搅拌机的低速下将颗粒混合在1 N NaOH中24小时（图2）。
   注:这个孵化时间可以缩短到1小时^7。
7. 孵化后，在RT.将2mL微胶管在25，200 x g（15，000 rpm）处进行10分钟的离心机，为下一步保留超强分子。
   注:该程序涉及使用强酸和其他具有腐蚀性的化学物质。因此，在整个木质素估计过程中建议佩戴适当的PPP。TGA 有很强的难闻气味，在本质上是腐蚀性的。因此，建议仅在烟罩中使用。

4. 木质素降水

1. 将超自然体转移到新的 2 mL 微富格管中，并在 4 °C 下加入 200 μL 的浓缩 HCl. 孵化剂，为期 4 小时或过夜（图 2）。
   注意:此时可以通过将制冷步骤延长到夜间来暂停提取过程。
2. 离心机在RT 10分钟内25，200 x g（15，000 rpm），在1N NaOH的1mL中溶解颗粒。
3. 在RT的摇床中孵育10分钟，在NaOH中完全悬挂颗粒。
4. 最后，使用光谱仪测量样品在280纳米的吸收度，并与标准木质素曲线进行比较。
5. 使用校准曲线回归线值测量木质素的未知浓度，并在 280 nm 时吸收提取的样品。

5. 样品中的标准曲线制备和木质素估计

1. 处理木质素标准的方式与TGA治疗的实验样本相同。
2. 以0.5毫克、1毫克、1.5毫克、2毫克、2.5毫克、3.0毫克、3.5毫克、4.0毫克、4.5毫克和5毫克为起点，以0.5毫克为增量测量商业竹木质素标准。然后，由TGA，HCl，溶解在1 N NaOH，然后测量吸收在280纳米（图3A）。
3. 使用木质素浓度值和吸收读数生成标准木质素曲线的零散图（图 3B）。
4. 使用散射图中生成的回归线 y = mx+c，使用提取样品的平均吸收量在 280 nm 和"m"和"c"值中从木质素标准曲线回归线中估计已提取样品的未知木质素含量。" x" 值。
5. 将木质素含量除以真空/空气干燥植物生物质样品的总重量，在mg中提取甲醇（约15毫克），以获得每毫克的木质素浓度。然后，将此值乘以 100 以计算每毫克的木质素百分比。

比较了两条不同的棉花实验线，以弥补不同组织中木质素含量的差异。每个样本提取的木质素含量测量为280纳米，并记录其各自的吸收值。将每个生物复制品的平均吸收值与木质素标准曲线的回归线（表2，图3C）进行比较。回归线，y = mx + c，用于计算提取实验线、样本1和样品2的未知木质素含量。平均OD值的结果被替换在"x"中，而"m"和"c"值则从木质素标准曲线的回归线中插入，以获得毫克中的木质素浓度"y"（表3，图3B）。在下一步，要计算每1毫克木质素含量，除以甲醇提取后的样品重量（15毫克）的"y"值。在下一步，以每克（=1，000毫克）计算，y/15值乘以1，000。为了获得木质素的百分比，我们将 y/15 值除以 1，000，乘以 100。将三个生物复制品（每行样本1和样本2）的木质素平均百分比比较了两条实验线样本1（11.7%）和样本2（10.3%）。木质素值在生物复制品中是一致的，表明TGA方法是一种可靠的方法，非常具体地测量木质素含量。还对两条实验线的不同组织类型（根、茎和叶）进行了比较研究，两条线的叶子中木质素含量相对较低（3.4%）与茎（9.4%至9.9%）相比和根 （9.4% 至 9.2%）（表4，图 4） 。

图1:植物生物质样品的制备。 （A） 从绿屋收集棉花植物材料。（B） 轻轻地翻转锅根。（C） 在水中彻底清洗，清除所有污垢。（D） 分离根、茎和叶组织。（E） 分离组织后，风干组织2天。（F） 空气干燥组织在49°C下被转移到孵化器10天。（G） 生物质研磨机用于研磨植物生物质样品。（H） 根、茎和叶的地面植物生物质样本。（I） 地面样品被装入研磨瓶中，放入冰柜磨室，以10 CPS的速度在冰柜磨坊中接地3个周期。（J） 在冰柜磨碎后，研磨小瓶显示细磨组织粉末。（K） 使用冰柜磨削后，将根、茎和叶的细磨组织粉末磨碎。请单击此处查看此图的较大版本。

图2:TGA调解木质素提取的关键步骤。使用TGA方法从植物生物质提取到木质素含量估计的关键步骤的流程图:1. 使用冰柜磨坊充分干燥和研磨成细粉，制备植物样品:2. 20毫克组织粉末受到PSB、甲醇和水洗涤、干燥和提取酒精不溶性物质的影响:3. 使用TGA和酸，木质素沉淀:4. 使用商业竹木质素编制木质素标准曲线:5. 估计木质素含量。请单击此处查看此图的较大版本。

图3:样本中的标准曲线制备和木质素估计。 （A）表显示用于从吸收读数280纳米产生木质素标准曲线的商业竹木质素的不同浓度。（B） 使用表 A. （C） 条图的值生成 Excel 程序产生的零星绘图，该图表示样本 1 和样本 2 的估计根组织木质素含量。请单击此处查看此图的较大版本。

表1:准备协议中使用的解决方案。表显示协议中使用的不同解决方案的准备情况。

表2:从0.5毫克到3.5毫克工业竹木质素的木质素标准曲线。 带有回归线的散射图显示m和c值。 请单击此处下载此表。

表3:用于计算未知木质素含量的木质素模板，使用280纳米（如x）样品的吸收读数和标准曲线回归线"m"和"c"值的标准曲线。请单击此处下载此表。

表4:在开花阶段，来自棉花植物不同组织（根、茎和叶）的木质素含量。请单击此处下载此表。

作者宣称他们没有利益冲突。