通过压力-容积环分析确定心脏对β-肾上腺素能刺激的反应

摘要

本文介绍了一种通过静脉输注逐渐增加剂量的异丙肾上腺素来评估小鼠心脏内在功能及β-肾上腺素能储备的心脏压力-容积环分析方法。我们采用改良的开胸法进行压力-容积环测量，在该方法中引入了具有正压呼气末通气的呼吸支持。

摘要

评估心脏功能是心血管疾病动物模型中一种可靠的终点分析方法，可用于表征特定治疗对心脏的影响。由于基因操作的可行性，小鼠已成为研究心脏功能及寻找潜在新治疗靶点最常用哺乳类动物模型。本文介绍了一种在基础状态以及通过静脉输注递增浓度异丙肾上腺素诱导β-肾上腺素能刺激条件下，利用压力-容积环测量与分析技术在活体动物中测定心脏功能的实验方案 。我们提供了一种优化的实验流程，包括通气支持，并考虑呼气末正压，以减轻开胸测量期间可能产生的不利影响；同时采用强效镇痛（布托啡诺），避免实验过程中因疼痛引发不可控的心肌应激。总体而言，本方案对操作步骤的详细描述及对潜在问题的讨论，有助于实现高度标准化和可重复的压力-容积环分析，通过避免可能的方法学偏差，减少实验动物从研究队列中的剔除。

引言

心血管疾病通常会影响心脏功能。这一问题凸显了在动物疾病模型中评估体内详细心脏功能的重要性。动物实验遵循“3R原则”（减少、优化、替代）的指导框架。在当前发展阶段，若要理解涉及全身反应的复杂病理过程（例如心血管疾病），主要策略是优化现有方法。优化方法还可因降低实验变异性而减少所需动物数量，从而提高分析和结论的统计效能。此外，将心脏收缩功能测量与心脏病动物模型相结合，包括通过神经体液刺激或压力超负荷（如主动脉缩窄）诱导的模型，可模拟例如儿茶酚胺/β-肾上腺素能水平的改变^1,2,3,4，为临床前研究提供有力手段。考虑到基于导管的方法仍是深入评估心脏收缩功能最广泛使用的技术⁵，本文旨在基于既往经验（包括对该方法特定参数的评估）^6,7，介绍一种在β-肾上腺素能刺激期间通过压力-容积环（PVL）测量小鼠体内心脏功能的优化方法。

评估心脏血流动力学参数的方法包括成像技术和基于导管的技术。针对具体科学问题，需仔细权衡这两种方法各自的优缺点。成像技术包括超声心动图和磁共振成像（....

方案

所有动物实验均经卡尔斯鲁厄地区委员会和海德堡大学批准，并遵循其相关规定（批准编号：AZ 35-9185.82/A-2/15、AZ 35-9185.82/A-18/15、AZ 35-9185.81/G131/15、AZ 35-9185.81/G121/17），符合欧洲议会关于用于科学目的动物保护的 2010/63/EU 指令指南。本方案中展示的数据来源于野生型 C57Bl6/N 雄性小鼠（年龄 17 ± 1.4 周）。 小鼠饲养于海德堡医学院动物实验中心（IBF）的特定病原体-free环境中。饲养条件为12小时光照-黑暗循环，相对湿度56–60%，每小时换气15次，室温22°C ± 2°C。小鼠饲养在II型或II型长型常规笼具中，笼内提供动物垫料和纸巾作为环境丰富材料。标准高压灭菌饲料和高压灭菌饮水均按需自由供应 ad libitum。

1. 仪器和药物溶液的准备

1. 中心静脉导管：将微管（外径 0.6 mm）剪成约 20 cm 长的导管管段。用镊子将管子一端套在 23 号套管针的尖端上。将管子的另一端斜向剪切，形成一个可刺入股静脉的锐利尖端。
2. 气管插管：取 20 号静脉穿刺套管，截取 3 cm 长度作为插管，移除注射器连接部分。
   1. 如果插管与呼吸机连接口不完全匹配，可在连接端缠绕数层 Parafilm 膜以加厚接口，确保连接稳固且密封（....

结果

压力-容积环（PVL）测量是一种强大的工具，可用于分析药物的心脏药效动力学，以及研究在正常和病理条件下基因修饰小鼠模型的心脏表型。该方案允许评估成年小鼠模型的心脏β-肾上腺素能储备。本文描述了一种在异氟烷麻醉联合布托啡诺（镇痛剂）和潘库溴铵（肌肉松弛剂）条件下进行的开胸方法，重点是通过股静脉导管输注不同浓度的异丙肾上腺素，观察心脏对β-肾上腺素能刺激的反应。本方案中展示的部分代表性数据来自野生型C57Bl6/N成年雄性小鼠（图3 和 表2）。为了显示PVL分析中某些重要参数测量值的变异性，我们使用野生型组的结果和免费的G*Power软件¹⁷进行了功效分析（α误差概率为0.05，功效为0.8）。在 表3 中列出了在0、0.825和8.25 ng/min异丙肾上腺素作用下，假设心率、压力-容积关系收缩末期斜率（PRSW）、每搏输出量、舒张时间常数Tau、dP/dt_max 和 dP/dt_min 各参数变化10%至30%时，计算.......

讨论

本文提供了一种在逐步增强β-肾上腺素能刺激条件下分析小鼠体内心脏功能的实验方案。该方法可用于评估基因修饰小鼠或经干预处理后小鼠的心脏功能基础参数以及肾上腺素能储备（如变力效应和变时效应）。与其它测定心脏功能的方法相比，压力-容积环（PVL）测量最显著的优势在于能够分析固有的、不受负荷影响的心脏功能。其他所有方法（如磁共振成像和超声心动图）仅能评估受负荷影响的心脏功能参数，尤其无法可靠地测定心肌收缩力。因此，PVL测量已成为深入分析心脏功能终点指标的金标准⁵。然而，前述方法可实现心脏功能的连续性分析，更适合用于纵向观察（例如疾病进展过程中的监测）。此外，在小鼠中，PVL测量所获得的心室腔内容积以及由此计算的每搏输出量和其他衍生参数，可能较磁共振成像结果偏低²⁰。

在本方案中有四个关键步骤，对于获得有效的PVL数据至关重要：1）插管，2）股静脉导管的放置，3）压力-容积导管的放置，以及4）围手术期管理。小鼠的非侵入性插管需要一定的经验，若使用异氟烷则操作更为复杂，因为插管时间窗口较窄（20–.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1.4F SPR-839 导管	Millar Instruments, USA	840-8111
1 ml 注射器	Beckton Dickinson, USA	REF303172
生物放大器	ADInstruments, USA	FE231
桥式放大器	ADInstruments, USA	FE221
牛血清白蛋白	Roth, Germany	8076.2
盐酸布比诺啡	Bayer, Germany	4007221026402
校准比色皿	Millar, USA	910-1049
差分压力传感器 MPX	Hugo Sachs Elektronik- Harvard Apparatus, Germany	型号 39912
Dumont 镊子 #5/45	Fine Science tools Inc.	11251-35
Dumont 镊子 #7B	Fine Science tools Inc.	11270-20
Graefe 镊子	Fine Science tools Inc.	11051-10
GraphPad Prism	GraphPad Software	Ver. 8.3.0
EcoLab-PE-Micotube	Smiths, USA	004/310/168-1
依托咪酯 Lipuro	Braun, Germany	2064006
Excel	Microsoft
肝素	Ratiopharm, Germany	R26881
加热板及控制单元	Labotec, Germany	Hot Plate 062
异氟烷	Baxter, Germany	HDG9623
异氟烷蒸发器	Abbot	Vapor 19.3
盐酸异丙肾上腺素	Sigma-Aldrich, USA	I5627
细孔聚乙烯管，外径 0.61 mm，内径 0.28 mm	Smiths Medical International Ltd, UK	货号 800/100/100
小鼠用 MiniVent 呼吸机	Hugo Sachs Elektronik- Harvard Apparatus, Germany	型号 845
MPVS Ultra PVL 系统	Millar Instruments, USA
NaCl	AppliChem, Germany	A3597
0.9% 等渗 NaCl	Braun, Germany	2350748
泮库溴铵	Sigma-Aldrich, USA	BCBQ8230V
Perfusor 11 Plus	Harvard Apparatus	编号 70-2209
Powerlab 4/35 控制单元	ADInstruments, USA	PL3504
可充电电凝装置套装	Faromed, Germany	09-605
剪刀	Fine Science tools Inc.	140094-11
LabChart 7 Pro 软件	ADInstruments, USA	LabChart 7.3 Pro
标准小鼠饲料	LASvendi GmbH, Germany	Rod18
体视显微镜	Zeiss, Germany	Stemi 508
8/0 外科缝合线	Suprama, Germany	Ch.B.03120X
静脉穿刺套管针 Venflon Pro Safty 20 号	Beckton Dickinson, USA	393224
血管插管镊	Fine Science tools Inc.	00574-11
水浴锅	Thermo Fisher Scientific, USA
注射器滤器（Filtropur S 0.45）	Sarstedt, Germany	货号 83.1826