小鼠窦房结和房室结的全组织免疫荧光染色、共聚焦成像及三维重建

摘要

我们提供了一种针对小鼠心脏窦房结（SAN）和房室结（AVN）进行整体免疫荧光染色的逐步实验方案。

摘要

窦房结（SAN）中的起搏细胞在生理条件下产生的电信号，通过包括房室结（AVN）在内的传导系统进行传导，从而引发整个心脏的兴奋与收缩。SAN或AVN任一部分的功能障碍均会导致心律失常，表明它们在电生理学和心律失常发生机制中的基础性作用。小鼠模型在心律失常研究中被广泛应用，但对SAN和AVN的特异性研究仍具挑战性。

窦房结位于界嵴与上腔静脉的交界处，房室结位于由冠状窦口、三尖瓣环和Todaro腱构成的Koch三角的顶点。然而，由于其体积较小，通过常规组织学方法进行可视化仍然具有挑战性，并且无法在三维环境中对窦房结和房室结进行研究。

本文介绍了一种整体免疫荧光染色方法，可实现对小鼠窦房结（SAN）和房室结（AVN）标记细胞的局部可视化。整体免疫荧光染色适用于无需手动切片的小型组织样本。具体操作中，首先解剖小鼠心脏并去除无关组织，随后进行固定、通透和封闭处理。接着使用抗HCN4抗体对窦房结和房室结内传导系统的细胞进行染色。通过共聚焦激光扫描显微镜观察及图像处理，可有效区分结区细胞与工作心肌细胞，并清晰定位窦房结和房室结。此外，还可联合使用其他抗体以同时标记其他类型的细胞，例如神经纤维。

与传统的免疫组织化学相比，整体免疫荧光染色能够保持心脏传导系统的解剖完整性，从而便于对房室结（AVN）进行研究，尤其是其解剖结构以及与周围工作心肌细胞和非肌细胞之间的相互作用。

引言

心律失常是影响数百万人的常见疾病，也是全球范围内导致发病和死亡的重要原因。尽管在治疗和预防方面已取得巨大进展，例如心脏起搏器的开发，但心律失常的治疗仍然具有挑战性，主要原因是目前对疾病潜在机制的了解极为有限^1,2,3。更深入地理解心脏正常电生理学以及心律失常的病理生理学，可能有助于未来开发出新颖、创新且具有因果针对性的治疗策略。此外，为了全面研究心律失常的发生机制，重要的是在动物模型（如小鼠）中定位并可视化特定的心脏传导系统，因为小鼠被广泛应用于电生理学研究。

心脏传导系统的主要部分包括窦房结（SAN），其由特化的起搏细胞产生电冲动，以及房室结（AVN），后者是心房与心室之间唯一的电连接通路⁴。当窦房结和房室结的电生理特性发生改变时，可能引发诸如病态窦房结综合征或房室传导阻滞等心律失常，进而导致血流动力学恶化、晕厥甚至死亡，因此凸显了窦房结和房室结在电生理学及心律失常发生中的关键作用⁵。

对窦房结（SAN）或房室结（AVN）进行全面研究需要精确定位并可视化这两个结构，理想情况下应在它们的生理环境中进行。然而，由于这些结构体积微小且位于工作心肌内部，缺乏明确的肉眼可见解剖标志，使得对SAN和AVN的解剖学与电生理学研究具有挑战性。可利用解剖学标志粗略识别包含SAN和AVN的区域^6,7,8。简而言之，SAN位于右心房的上下腔静脉之间，紧邻肌性终末嵴（CT）；AVN则位于由三尖瓣、冠状窦口和Todaro腱围成的Koch三角内。迄今为止，这些解剖标志主要用于定位、分离并随后将SAN和AVN作为独立结构进行研究（例如通过常规组织学方法）。然而，为了更深入理解SAN和AVN复杂的电生理特性（例如工作心肌邻近细胞的调节作用），有必要在生理性的三维环境中研究这些传导系统。

整体免疫荧光染色是一种用于研究解剖结构的方法 原位 同时保持周围组织的完整性⁹利用共聚焦显微镜和图像分析软件，可通过针对这些区域特异性表达的离子通道的荧光标记抗体来可视化窦房结和房室结。

以下方案详细说明了进行已确立的完整组织染色方法以实现窦房结（SAN）和房室结（AVN）显微定位与可视化的必要步骤。具体而言，本方案描述了（1）如何通过解剖标志物对窦房结和房室结进行定位，以制备适用于染色和显微分析的样本；（2）如何对参考标志物HCN4和Cx43进行完整组织免疫荧光染色；（3）如何制备窦房结和房室结样本以用于共聚焦显微镜观察；（4）如何对窦房结和房室结进行共聚焦成像。我们还介绍了如何修改该方案，以包括对周围工作心肌或非心肌细胞（如自主神经纤维）的额外染色，从而实现对心脏内心脏传导系统的全面研究。

方案

动物饲养和所有实验操作均遵循慕尼黑大学动物护理与伦理委员会的指导方针，所有在小鼠上进行的操作均获得德国巴伐利亚州政府批准（ROB-55.2-2532.Vet_02-16-106，ROB-55.2-2532.Vet_02-19-86）。C57BL6/J 小鼠购自杰克逊实验室。

注意：图1 显示了实验所需的仪器。图2 显示了心脏大体解剖结构的示意图。图3 显示了成年小鼠心脏中窦房结（SAN）和房室结（AVN）的位置。图4 显示了加载到共聚焦显微镜上的制备样品。

1. 准备工作

1. 通过将10 mL的16%甲醛溶液加入30 mL的PBS中，配制4%甲醛溶液（4% PFA）。
2. 分别将15 g和30 g蔗糖粉末溶解于100 mL PBS中，配制15%蔗糖溶液和30%蔗糖溶液。待蔗糖粉末完全溶解后，使用0.2 µm针头滤器过滤溶液，然后于4 °C保存。
3. 配制3%-4%琼脂糖凝胶：将3 g或4 g琼脂糖粉末与100 mL 1x TAE（由50x TAE储备液稀释而成）加入烧杯中。将烧杯置于磁力搅拌器上加热至沸腾，直至琼脂糖完全溶解。
4. 将30 mL 3%-4%琼脂糖凝胶小心倒入直径为100 mm的培养皿中，制备解剖盘。将培养皿置于室温下静置，使其冷却并凝固。
5. 根据表1中提供的配方配制封闭液和洗涤液。所有溶液均应在使用当天配制，不建议长期保存。
6. 将抗体用冷的（4 °C）1x PBS稀释，稀释过程中需避光（例如用铝箔包裹容器），并将稀释后的抗体置于冰上直至使用。抗体应在孵育前短时间内稀释，避免稀释后的抗体在室温下放置。
   注意：应通过常规免疫荧光染色在类似组织样本上测试合适的抗体稀释比例。本实验中，我们通过染色厚度为10 µm的冷冻切片来测试抗体。

2. 器官收获与组织制备

1. 将小鼠放入连接至 异氟烷蒸发器的孵育室中以进行麻醉。 将蒸发器设置为输送4-5%异氟烷（相应含96-95%氧气）。
   注意：通过轻轻翻转孵育室使小鼠仰卧，若其姿势反应和翻正反射完全消失，则表明已达到充分麻醉状态。
2. 将小鼠仰卧位固定于手术台上。将小鼠鼻部插入连接改良Bain回路的麻醉面罩，其中内管连接异氟烷蒸发器。以1 L/min的流速输送含1-2%异氟烷的氧气以维持麻醉。通过面罩的外管收集多余麻醉气体，并经由活性炭罐吸收，从而清除过量麻醉蒸气。
3. 当确认达到完全麻醉后，腹腔注射芬太尼以提供镇痛（0.1 µg/25 g体重）。
4. 当脚趾夹捏反射不可察觉时，使用虹膜剪从胸骨上切迹至耻骨联合处作一清晰切口，去除毛发和皮肤。再使用虹膜剪沿肋骨下方从左至右作另一切口，小心打开腹腔。
5. 用弯头镊子轻轻抬起剑突，以便在不损伤任何器官的情况下从左至右剪开膈肌。使用虹膜剪在双侧腋中线处剪开肋骨 cage，将其向上翻折，以暴露心脏。
6. 使用虹膜剪在膈肌水平处剪断下腔静脉和降主动脉。用27 G针头在心尖区域穿刺心脏，随后小心将针头推进至左心室（LV）。缓慢向左心室注入5-10 mL冰冻PBS以灌注心脏。
   注意：心脏颜色应由红色转为灰色，表明PBS灌注成功。
7. 用镊子轻轻提起心尖，以便剪断大血管并完整取出心脏。
8. 尽可能远离心脏处剪断大动脉和大静脉，以避免损伤上腔静脉（SVC）。保留SVC结构，因其在后续处理中将作为重要解剖标志。
9. 取出心脏后，关闭异氟烷蒸发器。
10. 将心脏置于解剖皿中，皿内盛有冰冻PBS，并置于解剖显微镜下。确定心脏的左右及前后方位后，将心脏翻转，使心前部朝下（以暴露位于后方的大血管）。
11. 用细针穿过心尖和左心耳（LAA），将其固定于解剖皿底部的琼脂糖中，以稳定心脏（图2A）。使用精细镊子和剪刀，小心去除SVC和下腔静脉（IVC）周围非心脏组织（如肺、脂肪、心包膜），以暴露上下腔静脉之间的区域（图3A）。
12. 使用显微剪沿心室与心房之间的沟槽平行剪切，去除大部分心室组织。保留一小部分心室组织，以便后续装载至Plexiglas 环上。
13. 为进行固定和脱水，将样本（包含心房、SVC和IVC）置于4%多聚甲醛（PFA）中，4 °C下过夜。
14. 次日，将心脏转移至15%蔗糖溶液中，4 °C下孵育24小时。
15. 再过一日，将心脏转移至30%蔗糖溶液中，4 °C下孵育24小时。
    注意：在步骤2.13、2.14和2.15的固定与脱水过程中，样本置于4°C环境中，无需额外搅拌或振荡。

3. 全胚胎免疫荧光染色

1. 将心脏在 PBS 中稀释的 1% Triton X-100 溶液中洗涤，并在封闭液（表 1）中于 4 °C 下封闭和透化过夜。
2. 将心脏放入 1.5 mL 离心管中，加入用封闭液稀释的兔抗小鼠 connexin-43 抗体（1:200 稀释）和大鼠抗小鼠 HCN4 抗体（1:200 稀释），于 4 °C 孵育 7 天。
   注意：在使用说明书推荐浓度作为参考之前，应预先测试一抗的最佳浓度。在此步骤中也可对其他感兴趣的抗原进行染色，前提是其一抗宿主物种与其他抗体不同。如先前研究所示，提高 Triton X-100 的浓度可能有助于获得更高效的抗体染色效果¹⁰，但具体浓度需根据实验条件单独确定。
3. 7 天后，用移液器吸除含一抗的溶液，并用含 1% Triton X-100 的溶液在摇床上室温洗涤心脏 3 次，每次 1 小时。
4. 洗涤后，将心脏与 Alexa Fluor 488 标记的山羊抗大鼠 IgG（1:200 稀释）和 Alexa Fluor 647 标记的山羊抗兔 IgG（1:200 稀释）于 4 °C 孵育 7 天。
5. 7 天后，用移液器吸除所有含二抗的溶液，然后用洗涤液（表 1）在摇床上室温洗涤心脏 3 次，每次 1 小时。
6. 为染色细胞核，将心脏在 DAPI 溶液（10 µg/mL）中于 4 °C 孵育过夜。
7. 次日，用洗涤液在摇床上室温洗涤心脏 3 次，每次 1 小时。
   注意：在步骤 3.1、3.2、3.4 和 3.6 中的封闭、透化、抗体孵育及 DAPI 染色过程中，样品应保持静置于 4 °C 环境中，无需搅拌。染色后的组织可完全浸没于洗涤液中，于 4 °C 避光保存数天，直至进行共聚焦显微镜成像。

4. 共聚焦显微镜

1. 准备有机玻璃 环，并用黏土填充（图1）。在黏土中心处制作一个小凹槽，用于放置心脏。制作浅凹槽有助于获得平坦的成像平面，并在第4.4步中便于调节空间，避免样品与盖玻片之间产生气泡。
2. 依次对同一心脏样本进行窦房结（SAN）和房室结（AVN）的成像。对于SAN成像，可直接放置心脏；而对于AVN成像，则需先进行显微解剖。
   1. SAN成像
      1. 通过解剖标志识别窦房结（SAN）：其位于心脏背侧的上下腔静脉之间区域（即上下腔静脉之间的区域）。界嵴（CT）是SAN与右心耳（RAA）之间的肌性条纹。
      2. 将心脏背侧朝上放入黏土凹槽中。向心脏表面滴加PBS，以排出心腔内的所有空气，直至心脏完全被PBS覆盖（通常几滴PBS即可）。
      3. 在解剖显微镜下，轻轻将右心耳、左心耳及左心室剩余部分压入黏土中以固定心脏。确保整个上下腔静脉区域及界嵴清晰可见（不被黏土覆盖）。待成像区域如图3A所示。
   2. AVN成像
      1. 完成SAN成像后，回收同一心脏样本并用于后续AVN成像。进行AVN显微解剖时，将心脏置于解剖皿中，并在解剖显微镜下操作。
      2. 将心脏右侧朝上放置（包括右心室剩余部分）。用大头针穿过左心室游离壁的剩余部分（此时位于底部）以固定组织（图2B）。
      3. 沿三尖瓣和上腔静脉方向向上切开右心室游离壁，然后将右心室和右心房翻转，以暴露室间隔和房间隔（图3B）。
         注：注意不要损伤冠状窦（CS），因其是定位Koch三角的重要解剖标志，而Koch三角可进一步用于定位房室结（AVN）。冠状窦位于心脏后侧左房室沟内横向走行，其开口位于房间隔下部的下腔静脉与三尖瓣之间（图3A和B）。
      4. 识别位于右心房内膜面的Koch三角：其前界为三尖瓣隔叶附着缘的铰链线，后界为Todaro腱，底边由冠状窦开口构成（图3B）。由于该区域是AVN成像的目标区域，必须确保其清晰可见。
      5. 将心脏转移至填充黏土的有机玻璃 环中的凹槽内，确保Koch三角完全暴露（即不被黏土覆盖）。轻轻将Koch三角周围的组织压入黏土中以固定样本。向心脏滴加PBS，排出腔内所有空气，直至心脏完全被PBS覆盖（通常几滴PBS即可）。
3. 在有机玻璃 环边缘涂抹硅胶，以便用盖玻片覆盖已装入黏土填充有机玻璃 环中的心脏样本。
4. 轻轻按压黏土背面，挤出部分PBS，使心脏贴附于盖玻片，同时避免成像区域内出现气泡。
   注：按压黏土背面时，需确保感兴趣区域未发生折叠或被覆盖。为保持组织解剖结构并实现样品的正确共聚焦成像，必须获得一个无样品过度压缩的平坦成像平面。对于SAN，需确保上下腔静脉区域完全暴露；对于AVN，Koch三角应完全暴露。
5. 将整体染色样本倒置放置于共聚焦显微镜载物台上。此时，附着于盖玻片的暴露SAN/AVN位于显微镜载物台底部（图4）。
   注：成像时，我们使用蔡司（Carl Zeiss）LSM800配备Airyscan单元及ZEN 2.3 SP1 black软件。
6. 选择激发Alexa Fluor 647标记的抗HCN4抗体的滤光片组合"BP420-480 + LP605"。主增益设置在650–750之间调整。
7. 使用Tile Scan功能获取整个SAN和AVN区域的概览图像。然后在概览图像上点击并在感兴趣区域周围添加方框，以选定HCN4阳性区域进行扫描。
8. 检查共聚焦显微镜其余通道（Alexa Fluor 488和DAPI）的参数，包括滤光片和主增益，并按照第4.6步所述进行设置。
9. 从样本顶部到底部缓慢调节焦距，预览整个样本，并设定Z轴堆栈的起始和终止位置。根据光学样本厚度设置合适的Z轴步进间隔。我们使用20倍物镜，Z轴步进间隔为0.8–1 µm。
10. 在所有参数正确设置后，扫描整个SAN和AVN区域。
11. 使用软件（例如Imaris 8.4.2版本）进行图像的三维重建。
    1. 选择图像处理 | 背景扣除以去除背景染色。
    2. 为选定通道和感兴趣区域选择表面生成设置以进行处理。

结果

通过采用上述方案，可稳定地对窦房结（SAN）和房室结（AVN）进行共聚焦显微镜成像。利用靶向HCN4的荧光抗体对传导系统进行特异性染色，并利用靶向Cx43的荧光抗体对工作心肌进行染色，可在完整解剖结构中清晰识别窦房结（图5，视频1）和房室结（图6，视频2）。

图1：解剖用器械及Plexig...

讨论

心脏解剖学传统上通过薄层组织学切片进行研究¹¹。然而，这些方法无法保存传导系统的三维结构，因此仅能提供二维信息。本文所述的全组织免疫荧光染色方案可克服这些局限性，可常规用于窦房结（SAN）和房室结（AVN）的成像。

与需要石蜡包埋、切片和抗原修复等常规步骤的传统免疫组织化学方法相比，整体装片法具有显著优势，可精确定位窦房结（SAN）和房室结（AVN）的三维空间位置并清晰呈现其形态结构，同时能够更好地观察其与周围组织的关系，因为该方法仅造成轻微的组织脱水和物理性损伤，从而最大程度地保留了组织形态。此外，免疫反应性（即抗体与组织抗原的结合能力）也得以高度保留。

我们建立了一种实用的共聚焦显微镜样品处理方法，使用装有油泥的塑料环支架^12,13。油泥是理想材料，因为它可根据组织大小进行个性化调整，且硬度足以可靠固定组织，而不会对组织施加过大压力。最重要的是，油泥本身不产生...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
<强>麻醉
异氟烷蒸发器系统	Hugo Sachs Elektronik	34-0458, 34-1030, 73-4911, 34-0415, 73-4910	包括一个诱导室、一个气体排出装置和活性炭过滤器
改良的贝恩回路	Hugo Sachs Elektronik	73-4860	包含小鼠用麻醉面罩
手术平台	Kent Scientific	SURGI-M
<强>在体 仪器设备
精细镊子	Fine Science Tools	11295-51
虹膜剪	Fine Science Tools	14084-08
弹簧剪	Fine Science Tools	91500-09
组织镊	Fine Science Tools	11051-10
组织固定针	Fine Science Tools	26007-01	可使用27G针头作为替代
<强>通用实验仪器
轨道摇床	Sunlab	D-8040
磁力搅拌器	IKA	RH 基础
移液器，体积 10 µL，100 µ升，1000 µL	Eppendorf	Z683884-1EA
显微镜
解剖体视变焦显微镜	VWR	10836-004
激光扫描共聚焦显微镜	蔡司	LSM 800
<强>软件
Imaris 8.4.2	Oxford Instruments
ZEN 2.3 SP1 black	蔡司
<强>通用实验材料
0.2 µm 注射器滤器	赛多利斯	17597
100 mm 培养皿	Falcon	351029
27G针头	BD Microlance 3	300635
50 ml 聚丙烯锥形管	Falcon	352070
5 ml 注射器	Braun	4606108V
盖玻片	Thermo Scientific	7632160
Eppendorf管	Eppendorf	30121872
<强>化学试剂
0.5 M EDTA	Sigma	20-158	TEA 的组分
16% 甲醛溶液	Thermo Scientific	28908	使用4%溶液
乙酸	默克	100063	TEA 的组分
琼脂糖	Biozym	850070
牛血清白蛋白	Sigma	A2153-100G
DPBS (1X) 达尔伯克氏磷酸盐缓冲液	Gibco	14190-094
正常山羊血清	Sigma	NS02L
蔗糖	Sigma	S1888-1kg
Tris碱	罗氏	TRIS-RO	TEA 的组分
Triton X-100	Sigma	T8787-250ml	用 PBS 稀释至 1%
Tween 20	Sigma	P2287-500ml
<强>药物
芬太尼 0.5 毫克/10 毫升	Braun Melsungen
异氟烷 1 mL/mL	Cp-pharma	31303
氧气 5 L	Linde	2020175	包含一个压力调节器
<强>抗体
Alexa Fluor 标记的山羊抗兔 IgG 488	Cell Signaling Technology	#4412	稀释至1:200
Alexa Fluor 647 标记的山羊抗大鼠 IgG	Invitrogen	#A-21247	稀释至1:200
Hoechst 33342 三盐酸三水合物（DAPI）	Invitrogen	H3570	稀释至1:1000
兔抗连接蛋白-43	Sigma	C6219	稀释至1:200
大鼠抗 HCN4（SHG 1E5）	Invitrogen	MA3-903	稀释至1:200
<强>其他
有机玻璃环			自行设计并3D打印
塑性黏土	Cernit	49655005
Baysilone 硅胶软膏	VWR	291-1220
<强>动物
小鼠，C57BL/6	杰克逊实验室