我们介绍了从蜜蜂采集花粉篮中花粉的方法，以及对花粉进行颜色分选、乙酰解处理和显微镜载玻片制备以进行分类学鉴定的操作流程。此外，我们还展示了利用花粉采集器从五种不同作物系统中收集到的花粉团在颜色特征和分类学多样性方面的结果。
本文内容
摘要
摘要
研究人员常采集和分析蜜蜂后足花粉篮中的花粉，以鉴定蜜蜂采集花粉的植物来源，或评估蜜蜂通过花粉接触农药的程度。本文介绍了一种有效的花粉采集方法，用于收集返回蜂巢的蜜蜂后足花粉篮中的花粉。该采集方法可获得大量可用于科研的花粉样本。蜜蜂会从多种植物上采集花粉，但在每次采集行程中通常只访问一种植物。因此，每个花粉团主要来自单一植物种类，且每个花粉团可通过颜色进行描述。这使得研究人员可通过颜色对花粉样本进行分类，从而区分不同的植物来源。研究人员还可通过分析经乙酰解处理的花粉粒形态，进一步对花粉进行分类学鉴定。这些方法广泛应用于与传粉者相关的研究中，例如传粉效率、传粉者觅食动态、饮食质量及多样性研究。本文详细介绍了使用花粉采集器收集花粉、按颜色对花粉进行分类以及花粉粒乙酰解处理的具体方法。此外，还展示了从五种不同作物系统中采集的蜜蜂花粉团颜色频率及其分类群的结果。
引言
西方蜜蜂（Apis mellifera L.）是许多依赖蜜蜂授粉的农作物的重要传粉者1。十多年来，已有多项关于西方蜜蜂蜂群大量损失的报道2,3,4,5,6,7,8,9。多种因素——包括寄生虫和疾病、营养不良以及杀虫剂——均被认为与蜂群衰退有关10。营养不良可归因于农业集约化及觅食栖息地的丧失11。为了改善蜜蜂的营养状况并支持蜜蜂保护工作，有必要了解蜜蜂在不同景观中所利用的植物资源。花粉是蜜蜂蛋白质、脂类、维生素和矿物质的主要来源，已被广泛用于多项农业与生态学研究中，以了解蜜蜂蜂群的觅食偏好、评估花粉采集器对蜜蜂蜂群的影响，并确定蜜蜂接触杀虫剂的情况12,13,14。
蜜蜂从花朵上采集花粉，并将花粉装入后足胫节上的花粉篮（即距胫节花粉筐）中形成花粉团，然后返回蜂巢储存。可通过在蜂巢入口或花朵上捕捉采集蜂，短暂冷藏使其无法活动，再用镊子从其后足上取下花粉团，从而获得花粉筐中的花粉。这种逐只捕捉采集蜂并手工收集花粉筐花粉的方法费时费力，若需要大量花粉，则效率低下。一种更简单且高效的大规模花粉收集方法是在蜂巢入口处使用花粉截取装置，拦截蜜蜂花粉筐中的花粉团。花粉截取装置的设计原理是：当携带花粉归巢的工蜂进入蜂巢时，迫使它们穿过网状孔洞，这些孔洞的尺寸仅略大于工蜂身体，可使蜜蜂通过，但会将花粉团从其后足上震落15。
当蜜蜂穿过这些孔洞之一时，其腿部较大的花粉团会被刮下并落入收集托盘中16。研究表明，花粉采集装置可刺激采集蜂收集更多的花粉，从而提高周围作物和植被的授粉效率17,18,19,20。花粉采集方法还可用于了解蜜蜂在景观中所利用的蜜源植物，这是确定开花植物物种数量、质量和分类群的第一步。因此，有效的花粉采集方法有助于推动授粉和蜜蜂营养研究。这些花粉采集方法的比较见表1。蜜蜂的花粉采集行为会根据蜂群对储存花粉的需求与其卵和幼虫数量之间的关系而发生变化21,22。由于这些变化包括采集强度的波动，因此在同一地点的不同蜂群之间，或在同一作物系统或景观类型的不同地点之间，花粉采集量通常存在较大差异23,24。增加用于采集花粉的蜂群数量和采样地点数量将有助于应对这种变异性。
花粉采集器的效率存在差异25,26。蜜蜂采集的花粉团大小因植物种类而异，并可能随着蜂群内花粉储存量的变化而改变27,28。这可能导致通过花粉采集器收集的样本中，较小的花粉团被低估，而较大的花粉团被高估。成年蜜蜂个体体型存在差异，这也会影响采集花粉在样本中的代表性。此外，在某些生境中，有些植物主要分泌花蜜，若仅通过分析采集的花粉，则这些植物将无法被检测到。采集效率还受到采集蜂偏移和迷失方向的影响，而这些因素又受花粉采集器类型和蜂箱设备状况的影响。通过采用本文所述的技术，可缓解这一问题。研究者还可考虑结合其他研究方法，例如统计采集蜂对花朵的访问次数，以补充蜂群层面采集偏好的研究结果。评估花粉多样性的有效方法之一是按颜色对携粉足上的花粉团进行分类。尽管蜜蜂属于广食性采集者，但它们也表现出访花忠诚性，即在单次采集行程中，倾向于从同一地点的同一种植物上收集花粉。基于这种采集行为，通常认为单个携粉足花粉团主要来自一种植物物种27,29,30,31。因此，科研人员可通过按花粉团颜色分类，并报告所检测到的颜色总数或每种颜色组别在总量中所占比例，来描述花粉多样性12,32,33,34。该方法可通过测量每种颜色组别的花粉团质量或数量来实现。若已知或怀疑不同分类群的花粉团重量存在系统性差异，则建议采用计数每种颜色组别花粉团数量的方法。这种系统性差异可能由花粉团大小或采集蜂在形成花粉团时添加的花蜜量不同所致。
颜色分选是一种省时且简单的方法，但对于某些传粉研究而言，其准确度可能无法满足要求，因为不同植物分类群的花粉团颜色可能相似35,36。此外，花粉团可被区分的颜色组数量在操作上也存在限制。因此，在传粉研究中，未必总能将每个植物分类群的花粉单独归入各自独特的颜色组。通过光学显微镜对花粉粒进行形态学鉴定，通常可辅助颜色分组，以区分同一颜色组花粉团中两种或多种分类群的花粉。尽管在同一个花粉团颜色组中常可发现多个分类群的花粉粒，但蜜蜂采集的单个花粉团通常以一个主要分类群为主，可能仅含少量其他分类群。因此，通常可假设蜜蜂后足花粉团具有分类学上的专一性。而对于不表现出访花专一行为的其他传粉者（如熊蜂）所采集的花粉团，则通常包含多种植物物种，且可能不存在主导分类群。当需要对多花源花粉团中各分类群的比例进行定量估算时，还需额外采用包括乙酸解离在内的显微分析方法，以实现准确分析。
评估醋解后花粉粒的形态特征是进行分类学鉴定最常用的方法16。醋解过程可去除花粉粒的原生质体，暴露出可在光学显微镜下观察的诊断性特征37,38。利用该方法，研究人员可报告不同分类单元、特定种植系统中各类群的出现频率，以及不同颜色花粉团中的主要类群33,36。醋解法是揭示花粉形态的最佳分析技术28。然而，某些醋解后的花粉粒（如许多蔷薇科类型）仅通过醋解和光学显微镜无法鉴定到属或种的水平。研究人员通常将扫描电子显微镜或宏条形码技术作为实现属或种级鉴定的替代方法。然而，这些替代方法仅能提供定性的分类单元鉴定，无法估算多花源花粉团中不同花粉类群的比例36,39。此外，这些方法的成本更高，且需要更专业的技术 expertise。各种鉴定方法的比较见表1。
| 方法 | 时间 | 费用 | 分辨率 | 专业要求 |
| 花粉采集 | ||||
| 花粉采集器收集 | 低 | 中等 | 可变 | 中等 |
| 采集采集花粉的蜜蜂 | 高 | 中等 | 高 | 低 |
| 花粉鉴定 | ||||
| 视觉法（仅按颜色分类） | 中等 | 低 | 低 | 低 |
| 乙酸解法 | 中等 | 中等 | 中等 | 中等 |
| 扫描电子显微镜 | 高 | 高 | 高 | 高 |
| 代谢条形码技术 | 可变 | 高 | 高 | 高 |
表1：基于时间、费用、分辨率和专业知识的不同花粉采集与鉴定方法的比较。 视觉方法（仅按颜色分类）报告所检测到的颜色总数，或每种颜色组别在总量中所占比例，以此作为判断花粉来源的指标，但无法提供分类单元的鉴定结果。
关于花粉捕获、分选及醋酸解离花粉粒的信息来源广泛且分散，不同领域研究人员所获取的内容常有差异。本文详细介绍了多种类型的花粉捕获器，可供研究人员和养蜂人使用，以高效收集大量蜂胶囊花粉。同时提供了花粉样品制备的实验方案，包括醋酸解离、染色和玻片封片等步骤，用于植物分类群的鉴定。文中详述的方法体系全面，是识别特定景观中蜜蜂采集植物优势种的独特资源，尤其适用于农作物种植系统。此前一项研究已应用这些方法并报告了相关结果，记录了蜜蜂在五种不同农作物系统中采集的蜂胶囊花粉颗粒的颜色多样性及植物分类群组成14。
方案
1. 使用花粉采集器从蜜蜂蜂群中收集蜜囊花粉
- 确定从目标蜂场位置采集花粉的合适时间。
注意：理想的气候条件包括充足的阳光照射、低风速、低湿度，且在计划采集花粉的期间无降水预报。 - 在目标蜂场中选择最适合采集花粉的蜜蜂群体。
- 通过在2分钟内计数返回蜂巢入口的采集蜂数量来评估蜂群群势。选择返回采集蜂数量最多的蜂群。
- 选择木质结构状况良好的蜂箱，最好没有额外的入口或变形的箱盖。优先选用替代入口较少的蜂群，因为这些蜂群的采集蜂更可能重新定向至花粉采集器的入口。
- 尽可能选择朝南的蜂箱入口。若蜂箱放置于托盘上，则在同一托盘上将花粉采集器安装在所有朝向相同的蜂群上，以避免采集蜂误入邻近蜂箱的入口。
- 如需评估蜂群的育雏区，可通过检查巢框上是否存在幼虫来进行判断。选择幼虫数量相对较多的蜂群。
- 在选定的蜜蜂群体上安装花粉采集器。
注意：安装方式因花粉采集器类型而异。类型包括 a) 前置式、b) 底置式、c) 顶置式，或 d) 钻孔入口式。详见讨论部分。- 对于前置式采集器，使用订书钉、螺丝和胶带将采集器固定在蜂箱入口前方，或使用绑在蜂箱周围的弹力绳连接采集器；对于底置式采集器，将采集器置于最底层蜂箱下方，并将采集器入口固定在靠近原蜂箱入口的位置；对于钻孔入口式采集器，使用订书钉、螺丝和胶带将采集器直接固定在蜂箱钻孔前方；对于顶置式采集器，将采集器置于最上层蜂箱上方、箱盖下方。
- 使用无粘性且可塑性的材料（如乳胶或聚氨酯泡沫）或#8金属网（孔径2.7 mm）封堵蜂群所有其他可能的入口，钻孔处可用此类材料封闭。小缝隙可用胶带密封。
- 若使用前置式采集器，应在采集篮与草地之间放置屏障（如橡胶垫），以防止露水造成湿气损害。
- 在安装花粉采集器24小时后、当日采集蜂飞行开始前（傍晚或清晨）启动采集装置。
注意：此步骤为理想操作，但非必需。若在特定时间段内持续对同一蜂群进行花粉采集，可每隔一周启动一次花粉采集器。 - 从采集托盘中收集携粉足上的花粉，将其放入塑料袋或离心管中，并置于装有冰块的冷藏箱中保存。
- 若需评估花粉种类的多样性与丰度（例如用于景观尺度的营养研究），建议在两个或三个72小时的时间段内采集花粉40。
- 若用于农药残留分析，应在24至96小时内采集花粉，每次至少收集3 g用于后续处理41。
- 清理花粉，去除蜜蜂残体及其他蜂巢杂质。
注意：处理花粉样品时应佩戴一次性手套，并在处理不同样品之间更换手套。每个采集器收集的花粉应使用独立的工具去除杂质，工具在用于下一批花粉样品前需清洗并干燥。 - 若花粉将用于花粉来源鉴定、数量评估或农药残留分析，应将其储存于-20 °C或更低温度下，以保持其成分完整性41,42。
- 从蜂箱上移除采集器后，将所有设备在5%的次氯酸钠溶液中消毒，冲洗干净并晾干，以备下次使用。
2. 用于后续花粉来源鉴定和数量评估的花粉团颜色分选
- 确保花粉样品量至少为 20 g。将花粉样品在其包装袋或另一个合适大小的容器中充分混合，以获得包含其中所有花粉颗粒的均匀混合物。在从样品袋中取出子样品之前，应遮蔽样品的颜色组成，以避免下一步操作中产生无意的偏差。
- 使用取样勺或大勺，从中取出 10 g 花粉作为整体的代表性子样品。缓慢将颗粒从勺中倒入天平，直至显示读数为 10 g。若第一次取样不足，可从样品中以相同方式再取一次。
注意：此处规定的重量要求（20 g 和 10 g）仅为示例。研究人员应根据具体需求调整每一步所用花粉的量。 - 从 10 g 子样品中去除所有蜜蜂残体及其他杂质。如有必要，可从原始样品中再添加少量花粉，使子样品总重量达到 10 g。
- 将 10 g 子样品中的每个花粉颗粒按颜色分组。依据花粉的颜色和质地差异进行分组。
注意：组内存在一定变异是正常的，但在分组过程中使用潘通（Pantone）色卡可提高一致性。 - 为确保后续步骤中每种颜色组至少有 0.25 g，将不足以形成至少 0.25 g 颜色组的颗粒归入一个杂项组。使用潘通色卡为每个颜色组命名，并将杂项组标记为 misc。
- 使用单独的称量纸称量每个颜色组的重量，和/或统计每个颜色组的颗粒数量。在数据表上记录各颜色组的名称及其重量或数量。
注意：选择称重或计数取决于研究人员关注的指标及项目目标。 - 使用耐溶剂笔和粘性纸质管标签，为每个颜色组制作微量离心管标签。标签上应包含当前日期、样品编号、样品采集日期及颜色组编号。将标签贴在洁净干燥的 2 mL 微量离心管上。
- 从每个颜色组中称取 0.25 g（± 0.05 g）花粉颗粒，放入相应标记的微量离心管中。
注意：若某一颜色组的花粉在颜色或质地上存在轻微差异，应确保每管中包含具有代表性的颗粒样本。后续试剂体积、孵育时间及离心时间均基于 0.25 g 花粉设定。因此，在用于乙酰解的微量离心管中应使用此量花粉。本方案可提供足量染色花粉，便于通过光学显微镜进行下游植物来源鉴定。若在乙酰解中使用不同量的花粉，则需相应调整试剂体积和处理时间。 - 将每个颜色组剩余的花粉分别放入单独的塑料袋中（每种颜色一个袋子），并在袋上标注颜色组名称。将这些袋子与相应原始样品的其他部分一同存放于 -20 °C 环境中保存。
- 用干净的木质牙签在离心管中彻底搅拌花粉 10 至 15 秒。
3. 乙酰解的准备工作
- 首次进行乙酰解的任何步骤之前，须联系指定机构的环境健康与安全（EHS）部门，获取有关乙酰解相关试剂及废弃物处理方法的指导。
- 准备以下试剂的储备液，并根据化学药品储存的EHS指南将其置于通风橱内：95%乙醇；蒸馏水；冰醋酸，无水；浓硫酸；甘油；以及透明指甲油。
- 配制以下试剂的储备液，并根据化学药品储存的EHS指南将其置于通风橱内：饱和碳酸氢钠溶液（8% w/v，溶于蒸馏水）；藏红O（1% w/v，溶于50%乙醇）。
4. 醋解
- 进行冰醋酸预处理。在通风橱内操作，穿戴实验服、护目镜和丁腈手套。
- 将加热块预热至 80 °C。
注意：确保饱和碳酸氢钠挤压瓶易于取用，以中和通风橱内可能发生的酸液泄漏。 - 分别标记一个玻璃烧杯用于酸性废液，一个用于乙醇废液，一个用于乙酰解混合液。
- 使用预先配制的储备液，在已标记且大小合适的玻璃烧杯中配制以下试剂的工作液：约 23.0 mL 冰醋酸；约 33.0 mL 蒸馏水；约 23.0 mL 95% 乙醇；约 25.0 mL 碳酸氢钠（用于处理被酸污染的固体废弃物）。
注意：以上体积可满足总共 10 个颜色组样品（10 个微量离心管）的后续乙酰解步骤。 - 向每个含有 0.25 g 颜色组花粉的微量离心管中缓慢加入 500 µL 冰醋酸。在目视观察下，用洁净牙签搅拌花粉 10–15 秒，确保管内物质充分混匀。使用后将牙签放入碳酸氢钠废液烧杯中；对每根试管重复此操作。
注意：每根试管均需使用洁净、全新的牙签。确保每根试管的管盖已紧密闭合。 - 将样品在 1,100 × g 条件下离心 3 分钟。将上清液倾入酸性废液烧杯中。然后用洁净纸巾轻轻短暂接触管口，以去除管口边缘残留的冰醋酸。
注意：倾倒上清液时需小心，避免损失花粉沉淀。
- 将加热块预热至 80 °C。
- 进行乙酰解处理。
注意：在通风橱内操作，穿戴实验服、护目镜和丁基乙烯手套。- 配制乙酰解混合液（冰醋酸:浓硫酸 = 9:1），首先将 10.8 mL 冰醋酸（来自工作液）加入标记为乙酰解混合液的烧杯中。然后使用装有 1250 µL 滤芯吸头的 1000 µL 移液器，缓慢将 1200 µL（1.2 mL）浓硫酸从储备液加入含冰醋酸的乙酰解混合液烧杯中。使用后的吸头丢弃至碳酸氢钠烧杯中。
注意：乙酰解混合液烧杯可能变热，混合液可能变为黄色。混合液变深色有两种可能原因：(a) 试剂已过有效期，或 (b) 加入了过多浓硫酸。若混合液变深，请将其倒入酸性废液烧杯中丢弃，并重新配制新鲜的乙酰解混合液。 - 用玻璃棒或木制搅拌棒轻轻搅拌乙酰解混合液，确保其均匀混合。使用后的搅拌棒放入碳酸氢钠烧杯中。
- 使用装有 1250 µL 滤芯吸头的 1000 µL 移液器，从烧杯中缓慢向每根试管加入 1000 µL 乙酰解混合液。在目视观察下，用洁净牙签搅拌 10–15 秒，确保管内物质充分混匀。使用后将牙签放入碳酸氢钠废液烧杯中。
注意：每个样品均需使用洁净、全新的牙签。 - 将样品置于预热（80 °C）的加热块上。孵育 5 分钟，在孵育中途用洁净牙签彻底搅拌每根试管。使用后将牙签放入碳酸氢钠烧杯中。
注意：切勿将牙签留在样品中，酸会将其溶解。
- 配制乙酰解混合液（冰醋酸:浓硫酸 = 9:1），首先将 10.8 mL 冰醋酸（来自工作液）加入标记为乙酰解混合液的烧杯中。然后使用装有 1250 µL 滤芯吸头的 1000 µL 移液器，缓慢将 1200 µL（1.2 mL）浓硫酸从储备液加入含冰醋酸的乙酰解混合液烧杯中。使用后的吸头丢弃至碳酸氢钠烧杯中。
- 进行乙酰解后冰醋酸清洗步骤。
注意：在通风橱内操作，穿戴实验服、护目镜和丁基乙烯手套。- 向每根试管缓慢加入 500 µL 冰醋酸。在目视观察下，用洁净牙签搅拌 10–15 秒，确保管内物质充分混匀。使用后将牙签放入碳酸氢钠烧杯中。
注意：每个样品均需使用洁净、全新的牙签。确保每根试管的管盖已紧密闭合。 - 将样品在 1,100 × g 条件下离心 3 分钟。将每根试管的上清液倾入酸性废液烧杯中。然后用洁净纸巾轻轻短暂接触管口，以去除管口边缘残留的酸液。
- 用流动水彻底冲洗丁基乙烯手套至少 30 秒，取下并晾干。
注意：请遵循制造商关于丁基乙烯手套重复使用的指导说明。
- 向每根试管缓慢加入 500 µL 冰醋酸。在目视观察下，用洁净牙签搅拌 10–15 秒，确保管内物质充分混匀。使用后将牙签放入碳酸氢钠烧杯中。
- 对每个样品进行三次水洗。在通风橱内操作，穿戴实验服、护目镜和丁腈手套。
- 从蒸馏水烧杯中用移液器向每根试管加入 1000 µL 蒸馏水。在目视观察下，用洁净牙签搅拌 10–15 秒，确保管内物质充分混匀。使用后将牙签放入碳酸氢钠废液烧杯中。
注意：每个样品均需使用洁净、全新的牙签。确保每根试管的管盖已紧密闭合。 - 将样品在 1,100 × g 条件下离心 3 分钟。将上清液倾入碳酸氢钠烧杯中。然后用洁净纸巾轻轻接触管口，以去除管口边缘残留的水分。
- 重复步骤 4.4.1–4.4.2 两次，共完成三次水洗。
- 从蒸馏水烧杯中用移液器向每根试管加入 1000 µL 蒸馏水。在目视观察下，用洁净牙签搅拌 10–15 秒，确保管内物质充分混匀。使用后将牙签放入碳酸氢钠废液烧杯中。
- 对每个样品进行乙醇清洗。
注意：在通风橱内操作，穿戴实验服、护目镜和丁腈手套。- 使用装有 1250 µL 滤芯吸头的 1000 µL 移液器，从乙醇烧杯中向每根试管加入 1000 µL 95% 乙醇。将使用后的吸头丢弃至非危险性废弃物容器中。在目视观察下，用洁净牙签搅拌 10–15 秒，确保管内物质充分混匀。
注意：使用后将牙签放入碳酸氢钠废液烧杯中。每个样品均需使用洁净、全新的牙签。确保每根试管的管盖已紧密闭合。 - 将样品在 1,100 × g 条件下离心 3 分钟。将上清液倾入乙醇废液烧杯中，并用洁净纸巾轻轻接触管口，以去除管内残留的乙醇。
- 使用装有 1250 µL 滤芯吸头的 1000 µL 移液器，从乙醇烧杯中向每根试管加入 1000 µL 95% 乙醇。将使用后的吸头丢弃至非危险性废弃物容器中。在目视观察下，用洁净牙签搅拌 10–15 秒，确保管内物质充分混匀。
- 穿戴实验服、护目镜和丁腈手套进行染色。轻轻颠倒混匀藏红花 O 染色储备液。
- 使用一次性塑料移液管，向每根试管加入 5–10 滴藏红花 O 染色液。在目视观察下，用洁净牙签搅拌 10–15 秒，确保管内物质充分混匀。将牙签留在试管中。
- 使用装有 1250 µL 滤芯吸头的 1000 µL 移液器，从乙醇烧杯中向每根试管加入 1000 µL 95% 乙醇。将使用后的吸头丢弃至非危险性废弃物容器中。用牙签搅拌 10–15 秒，确保管内物质充分混匀。使用后将牙签放入非危险性废弃物容器中。
- 确保每根试管的管盖已紧密闭合。在 1,100 × g 条件下离心 3 分钟。将上清液倾入乙醇废液烧杯中。
注意：此次切勿用纸巾接触管口。 - 使用一次性塑料移液管向每根试管加入 10–15 滴甘油。在目视观察下，用洁净牙签搅拌 10–15 秒，确保管内物质充分混匀。
注意：使用后将牙签放入非危险性废弃物容器中。每个样品均需使用洁净、全新的牙签。确保所有试管标签清晰可读。
- 将试管敞口置于通风橱中，在室温下静置至少 2 小时，使乙醇完全挥发。检查样品是否有乙醇气味：若仍可闻到，则样品尚未干燥完全，需继续放置直至乙醇气味消失。
- 清洗所有实验器材，并妥善处理废弃物。关闭离心机和加热块。根据所在机构的环境健康与安全指南，分类处置所有固体和液体废弃物。
- 准备显微镜载玻片用于花粉鉴定，确保标签清晰可辨。为每个待封片的颜色组/样品准备洁净的玻璃载玻片并正确标记。在目视观察下，用洁净牙签搅拌样品 10–15 秒，确保管内物质充分混匀。
注意：载玻片制备可在实验台进行。使用后将牙签丢弃至非危险性废弃物容器中。每个样品均需使用洁净、全新的牙签。- 使用洁净的一次性塑料移液管，从试管中取出一滴花粉残留物，置于对应标记的载玻片中央。让液滴自然略微铺展。将洁净的盖玻片覆盖于液滴之上。
- 待载玻片干燥后，用透明指甲油将盖玻片密封固定于载玻片上。在盖玻片的每个角落滴一小滴指甲油，并沿盖玻片与载玻片接触的边缘涂一圈指甲油。待指甲油完全干燥后，再涂第二层指甲油封边。
结果
先前一项研究报道了对蜜蜂在以下农作物中采集的花粉多样性的评估：杏仁、樱桃、高丛蓝莓、杂交胡萝卜和草本植物稻草花14采用所述方法收集蜂巢花粉，按颜色分类，并鉴定每类花粉团的植物来源，以评估花粉多样性。在多种作物的多个地点蜂群中安装底部蜂巢花粉采集器图1A）。从每个采样点收集的花粉数量足以满足颜色分选和乙酰解分析方法对样品重量的要求。每份花粉样品均包含多个可区分的颜色组。图2 和 图3）。在某些样本中，花粉颜色组仅包含4-5个花粉团；然而，大多数组的花粉数量明显多于该数目，因此可作为独立的颜色标记组进行乙酰解处理（图4 和 图5）。经乙酰解后（图6），采用明场光学显微镜，通过将各色群的形态特征与各研究地点周边区域采集的标本进行比对，有效鉴定至尽可能低的分类阶元图7).
图1：安装在蜜蜂蜂群上的花粉采集器，用于收集蜜囊花粉。（A）底部安装式采集器，置于蜂箱底板上方，紧邻最底层蜂箱下方。其他类型的花粉采集器包括（B）前端安装式和（C）螺旋孔入口安装式采集器。请点击此处查看此图的放大版本。
图2：花粉采集器的捕获机制与收集托盘。 采集花粉归巢的工蜂必须穿过金属丝网构成的捕获装置，才能进入蜂巢。请点击此处查看该图的放大版本。
图3：花粉采集器的收集托盘。 花粉采集器将归巢的花粉采集蜂后足花粉筐中的花粉刮下，使其落入下方的收集托盘中。 请点击此处查看该图的放大版本。
图 4：将蜂篮中的花粉样品按颜色分类。 蜂篮中的花粉在按颜色分组后可进行干燥和称重，以报告所采集的不同颜色花粉粒的比例。 请点击此处查看该图的放大版本。
图 5：利用潘通色卡按颜色分类的四组花粉粒。 颜色分组标注为（A）灰色，Pantone 5855C；（B）棕色，Pantone 7557C；（C）黄色，Pantone 458C；以及（D）浅棕色，Pantone 3547C。 请点击此处查看该图的放大版本。
图6：通风橱内的乙酰解设备设置。 热块仪、试剂、溶剂废液容器、酸废液容器、已标记的烧杯、移液器、移液器吸头、搅拌棒和微量离心管均放置在通风橱内。 请点击此处查看该图的放大版本。
图7：染色后经醋酸解离处理的花粉粒显微图像。 经醋酸解离处理的芥菜科（Brassicaceae）花粉粒在40倍放大下的多个晶面形态。比例尺 = 50.398 µm。请点击此处查看该图的高清版本。
从杏仁作物采集的花粉多样性相对较低，每个采样点平均有 3.0 ± 0.5 种花粉粒颜色和 3.2 ± 1.2 种植物分类单元（表 2）14。其余四种作物系统的花粉多样性较高，其中樱桃每个采样点平均有 6.0 ± 2.0 种花粉粒颜色和 8.0 ± 1.5 种植物分类单元，高丛蓝莓为 8.8 ± 1.4 种花粉粒颜色和 13.5 ± 2.0 种植物分类单元，杂交胡萝卜为 7.0 ± 1.0 种花粉粒颜色和 11.0 ± 0.0 种植物分类单元，满江红为 10.0 ± 0.0 种花粉粒颜色和 13.0 ± 1.5 种植物分类单元14。
| 作物 | 每个位点花粉团颜色的平均数量（标准误） | 每个位点植物分类单元的平均数量（标准误） | 鉴定出的总分类单元数 | ||
| 科 | 属 | 种 | |||
| 杏仁 | 3.0 (0.5) | 3.2 (1.2) | 4 | 3 | 4 |
| 蓝莓 | 8.8 (1.4) | 13.5 (2.0) | 5 | 10 | 13 |
| 胡萝卜 | 7.0 (1.0) | 11.0 (0.0) | 3 | 5 | 6 |
| 樱桃 | 6.0 (2.0) | 8.0 (1.5) | 4 | 7 | 5 |
| 草本油菜花 | 10.0 (0.0) | 13.0 (1.5) | 5 | 4 | 14 |
表2：从五种作物系统中采集的蜜蜂携粉篮花粉的多样性。 多样性指标包括花粉粒颜色的平均数量（± 标准误），植物分类单元的平均数量（± 标准误）以及鉴定出的总分类单元数。此表格已根据文献14修改。缩写：SE = 标准误。
讨论
不同类型的花粉采集器各有其优势和局限性。以下将讨论四种常用采集器类型的优缺点：（1）前置式、（2）底置式、（3）螺旋孔式以及（4）顶置式花粉采集器。前置式采集器是最通用的类型（图1B）。其安装快速简便，无需搬动蜂箱，且可适配任何朗氏蜂箱设备。由于收集托盘位于蜂群前方，因此收集到的蜂群杂物最少。然而，收集托盘也更易暴露于外界环境——田间灌溉产生的水分、降雨或潮湿天气以及露水可能通过收集托盘接触花粉，若花粉颗粒因过度湿润而无法分离，则可能导致花粉无法使用。为降低花粉受潮风险，应避免在预报有降雨或高湿度天气时进行采集。在采集器下方放置橡胶垫，并在花粉采集器上方加装额外覆盖材料（例如屋顶沥青毡），也可有效保护收集托盘免受天气影响。
本研究中用于收集花粉数据的是底部安装式采粉器（图1A）。由于必须将其置于蜂群的育子区下方，因此安装不够方便。安装过程耗时较长，且会有大量来自蜂群的杂物落入采粉器中，例如蜜蜂残体和微小的蜂蜡碎片。大多数市售的底部安装式采粉器的收集托盘底部由细网构成，以保证适当的通风，防止所收集的花粉受潮。螺旋孔式采粉器有助于减少采集蜂的迷失行为，特别是当蜂群主要使用螺旋孔作为蜂箱入口而非蜂箱底板所设入口时（图1C）。由于螺旋孔式采粉器的收集托盘非常小，必须频繁清空，以防托盘溢出。由于顶部安装式采粉器位于蜂箱上方，因此这种类型的采粉器在安装和拆卸时最为便捷，且所收集的花粉样品不含蜂箱杂物。然而，这种采粉器对蜂箱设备的破损尤为敏感，若蜂箱盖、内盖和上层蜂箱箱体未正确密封，收集托盘将暴露于湿气之中。
本文所述方案要求选择成年蜂和幼虫数量较多的蜂群（步骤1.2）。该选择方法旨在从这些蜂群中获得大量被截留的花粉。具有较大采集蜂群的蜂群在安装花粉采集器后，蜂巢入口处可能出现严重拥堵。选择具有较大巢门的蜂箱可缓解拥堵情况。较大的采集蜂群还可能收集到极大量的花粉，超出收集托盘的容量。应使用容积较大的收集托盘（如大多数底部或顶部安装式采集器所配备的托盘），并频繁清空托盘，以容纳大量被截留的花粉。如果研究目标是评估蜂场中蜂群采集的花粉量，则应选择具有代表性的蜂群，而非优先选择成年蜂和幼虫数量最多的蜂群。所有类型的花粉采集器都会遮挡原有巢门，并创建一个在空间位置上不同于原巢门的新入口16。在安装后，若采集蜂无法重新定位至花粉采集器的新入口，花粉采集常会失败。这些采集蜂容易漂移到邻近蜂箱，若其进入装有花粉采集器的其他蜂箱，可能导致其他花粉样品的交叉污染。因此，在安装后应使采集装置处于非工作状态，让采集蜂至少有24小时的时间适应新入口。选择仅有少数或没有额外巢门的蜂群，也有助于减少蜜蜂对新花粉采集器入口定位时的混淆。
应密封蜂箱的额外入口（例如孔洞和变形的箱盖），但在安装诱捕器初期若存在这些入口，会增加采集蜂漂移至邻近蜂箱的风险。如果仅在一组托盘式排列的蜂箱中的一箱上安装花粉诱捕器，采集蜂也容易漂入其他蜂箱的入口。若在同一托盘上朝向相同方向的所有蜂箱均安装诱捕器，则采集蜂发生漂移的可能性较小。顶部安装的花粉诱捕器可能导致更高的蜜蜂漂移风险，因为花粉诱捕器入口与蜂箱原始入口之间的距离较大。在本研究中，为控制不同蜜蜂蜂群之间花粉数量和类群组成的差异，在每个实验地点的多个蜜蜂蜂群上安装了花粉诱捕器。因此，为从景观尺度获得可靠的花粉采集样本，应在多个蜂群上安装诱捕器，因为不同蜂群的花粉采集量和植物种类组成可能因植物种类类型和总采集量而存在显著差异12,13。每个花粉样本的采集周期为7天。在今后的研究中，采用连续两到三个72小时的采集时段，可提高花粉采集量估算的准确性40。
由于花粉采集存在显著的时间波动性，可通过在目标作物系统的初花期、盛花期和末花期重复进行花粉采集过程，以提高花粉估算的准确性24,27,39。即使在同一作物系统或景观类型中，也应从多个地点采集花粉，因为不同蜂场位置之间的花粉数量和植物种类可能存在差异14,27,33,43。长期使用花粉采集器可能对蜜蜂蜂群产生不利影响，潜在影响包括幼虫培育减少、幼虫生长期缩短，以及蜂巢中卵和幼龄幼虫的同类相食现象19,44,45,46。若在整个生长季节等较长时间内持续采集花粉，可能加剧对蜂群繁殖的负面影响。花粉采集还可能导致蜂蜜产量下降，并增加储存蜂蜜的水分含量13。在持续监测某一景观或作物系统时，可在蜂场内轮换不同蜂群使用花粉采集器，以减轻对用于花粉采集的蜂群造成的伤害。若在一段时间内持续对同一蜂群进行花粉采集，建议每隔一周启用一次花粉采集器，以降低不利影响，特别是减少蜂蜜产量的损失13。
此外，最好将花粉采集器放置在强群蜂箱上。有时花粉采集器可能会意外启动，这可以通过在不需要采集花粉时锁定采集器装置来避免。花粉采集器并不能完全清除采集蜂后足胫节上的花粉团。采集效率取决于采集器类型、花粉团大小、蜜蜂体型、一天中的时间和天气条件。因此，在使用花粉采集器采集不同植物种类和不同采集时期样品时，花粉采集量并不一致25,26。例如桉树（Eucalyptus spp.）和柽柳（Tamarix spp.）等植物产生的较小花粉团较难被花粉采集器捕获27。值得注意的是，本研究中在高丛蓝莓（Vaccinium corymbosum L.）采集点未发现高丛蓝莓花粉，这支持了先前的研究证据，即高丛蓝莓的花粉团过小，难以通过花粉采集器有效收集47。相比之下，本研究在所有种植系统中均检测到了蒲公英（Taraxacum officinale F.H. Wigg）花粉。某些植物物种的花粉团可能明显大于其他物种，例如蒲公英属（Taraxacum spp.），因此在花粉采集器收集样品的分析中可能被过度代表27。通过单独捕捉采集蜂并人工移除其后足花粉团，可提高花粉来源评估的准确性，但与使用花粉采集器相比，这种方法极为耗时且资源消耗大（表1）。将花粉团按颜色分类操作相对简单，但较为耗时。除非有特定的研究目标或目的，否则为进行颜色分类而处理的花粉团数量应限制在10 g或以下（针对任何单一样品）。处理超过此数量的完整样品将显著增加分析所需时间。然而，在取用于颜色分类的子样品前，必须确保原始花粉样品充分混匀。若未充分混匀原始样品，可能导致所取子样品无法代表整体，应避免这种情况。
如果原始样品容器没有足够的空间以充分混合花粉粒，则可将整个样品放入一个较大的塑料袋或小纸袋中，即使对于大量样品也足够。带盖的硬质塑料容器同样适用。混合样品时应轻柔操作，避免压碎或破坏花粉粒。在从整份样品中取出子样品时，可能会无意识地产生偏差，例如倾向于舀取"颜色鲜艳的紫色花粉粒"。因此，在取子样品时应遮蔽样品的颜色组成，使其不可见。这样更有可能获得真正代表整体的子样品。然而，这种子取样方法可能无法选中样品中丰度较低的花粉粒。因此，如果研究目标是鉴定样品中所代表的每一个植物分类单元，则采集子样品将不适用，必须对整份样品进行分析。此时，应将花粉粒在玻璃培养皿中进行分拣。分拣完成后，可将合适的Pantone色卡页面置于培养皿下方，以便于色卡与已分拣花粉之间的颜色比对。此方法的示例如图5所示。
在从为作物授粉而放置的蜜蜂蜂群中采集花粉时，使用的颜色类别总数不应超过十种：九种单个颜色和一种 "其他" 由样本中少数颜色组成的色群。对一个样本可划分的最大色群数量设定合理上限，可避免研究者陷入无休止地将样本颗粒细分为越来越多的、极为特异的色群，导致在分选完成后，各色群可能均无法获得足量样本用于乙酰解处理。若从可能采集多种植物花粉的蜂群中进行采集，则可能需要设置更多的色群，相关实验方案应据此优化调整。本研究聚焦于采集自为农作物授粉的蜜蜂蜂群的花粉样本，常见在一个色群中包含多个分类单元，这与以往研究结果相似29,30,31.
乙酰解法可溶解花粉粒表面的脂类、蛋白质和有机碎屑，从而暴露外壁的鉴别特征，使花粉更容易染色和鉴定。这是一种古老且常用的方法，广泛应用于多种花粉研究中37。其基本步骤已标准化，不同方案之间差异较小。然而，离心速度与时间、孵育温度与持续时间、根据花粉量调整的试剂体积，甚至上清液去除方式（倾倒或移液）等具体参数，可能需要根据研究目标以及预期遇到的花粉类型在实验中进行优化48。事实上，乙酰解可能会去除某些类群（如锦葵科和兰科）花粉的重要诊断特征38。因此，并非所有花粉都适用于标准的乙酰解方法。如前所述，本研究中的方法已针对鉴定由农作物授粉蜜蜂采集的花粉的主要植物分类来源进行了优化。若研究中需要对花粉粒进行精确定量，则本文未涉及相关细节。
使用溶剂和酸时需要仔细规划、配备适当的个人防护装备（PPE），并妥善处理废弃物（图6）。研究人员在开始乙酰解的任何步骤之前，必须确定试剂的正确储存方式以及废液的处理方法。在本实验室中，整个过程中凡涉及浓硫酸或冰醋酸的操作均使用丁腈手套，因为丁基手套对这两种酸的降解抵抗性和渗透防护性能远优于乳胶手套，同时不牺牲操作灵活性49。建议查阅所在机构的安全指南，以获取关于合适手套及其他个人防护装备的推荐建议49。在乙酰解步骤之前加入冰醋酸有助于去除样品中残留的水分，并为关键的乙酰解反应做好准备。乙酰解步骤中冰醋酸与浓硫酸的混合物可能与水发生剧烈反应，因此必须确保所有玻璃器皿和用品完全干燥，并在乙酰解前彻底去除样品中的水分。乙酰解完成后加入冰醋酸可稀释并中和乙酰解混合液。
乙醇和冰醋酸尤其容易溶解微量离心管标签上的墨水，即使使用了耐溶剂的记号笔，这些试剂一旦滴到管壁外表面仍可能导致标签模糊。在整个操作过程中应频繁检查管壁标签，确保其依然清晰可读。如果条件允许，可考虑使用激光打印的标签，以防范这一风险。上清液倾倒的方式会影响试剂是否沿微量离心管外壁流下。倾倒时应以稳定、流畅的手法进行，这需要通过练习来掌握。在倾倒过程中需格外小心，避免花粉样本从离心管中丢失。倾倒过快可能导致部分或全部花粉残渣丢失；倾倒过慢则可能导致上清液沿管壁下流。尽管通常建议采用100 °C的孵育温度，但在本研究使用的样品量（0.25 g）下，花粉在此温度下容易"过热"，特别是当孵育时间稍长时尤为明显29。事实上，即使在80 °C条件下，若花粉在乙酰解混合液中停留时间过长，花粉粒也可能破裂或受到其他损伤。必须谨慎确定孵育的温度和时间，以避免破坏样本中的花粉粒。
对花粉进行染色可增强外壁特征的清晰度和对比度，从而更易于拍摄和鉴定（图7）。使用塑料移液管滴加5滴1%的藏红O溶液，可有效染色0.25 g花粉。然而，不同种类的花粉染色效果存在差异。若花粉粒染色过浅或过深，可能会影响鉴定。在开始处理实验样品前，应尽可能预先验证预期在研究中出现的花粉种类所需染色液的合适体积。尽管如此，若某个实验样品染色不当，仍可进行修正。对于染色过深的花粉样品，可用清水冲洗后，再用乙醇冲洗以减轻染色强度；若染色不足以致无法观察到鉴别特征，可添加数滴染色液进行补充染色。在添加甘油前，应先检查这些样品的染色效果。同样，可能需要通过若干次尝试来确定花粉残渣所需的最佳甘油用量。在本研究中，15滴甘油可有效防止样品干燥，同时将花粉残渣稀释至适合通过光学显微镜进行后续鉴定的理想浓度。其他量的花粉残渣可能需要更多或更少的甘油，以防止脱水并便于封片。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
感谢 Gretchen Jones 博士（美国农业部农业研究局，APMRU，德克萨斯州大学城）在颜色分选和醋酸解分析方面的协助。本研究得到了俄勒冈州养蜂人协会向 R.R.S. 提供的研究经费支持。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| #8 硬件网布 | 2.7 mm 孔径 | ||
| 10 mL 量筒 | |||
| 1000 µL 微量移液器吸头 | |||
| 1250 µL 滤芯式微量移液器吸头 | |||
| 15 x 75 mm 玻片 | 厚度：0.93 mm - 1.05 mm | ||
| 2 mL 微量离心管 | |||
| 250 mL 量杯（硼硅酸盐玻璃，x3） | VWR | 10754-952 | |
| 50 mL 量杯（硼硅酸盐玻璃，x6） | VWR | 10754-946 | |
| 95% 乙醇 | Pharmco AAPER | 111000200DM55 | ACS/USP/犹太洁食级 |
| 丁基乙烯基手套 | |||
| 离心机 | 最大转速 1060 × g；推荐使用水平摆动转子 | ||
| 化学防护护目镜 | |||
| 比色卡 | Pantone | SKU: GP1601A | 实色涂层 |
| 1 或 1.5 盖玻片 | 厚度：0.13 mm - 0.19 mm | ||
| 蒸馏水 | |||
| 镊子 | |||
| 通风橱 | |||
| 冰醋酸 | BDH Chemicals | BDH3092 | ACS 级 |
| 玻璃漏斗 | |||
| 甘油 | Humco | 103196001_1 | USP 级，99.5%，无水 |
| 危险废物容器 | |||
| 蜂箱工具 | |||
| 加热金属块 | 必须能达到 80 摄氏度 | ||
| 长袖实验服 | |||
| 乳胶或聚氨酯泡沫 | |||
| 显微镜 | |||
| 透明指甲油 | |||
| 腈手套 | |||
| P1000 移液器 | VWR | ||
| 培养皿 | |||
| 塑料勺 | |||
| 沙黄染液 | Ward's Science | 470302-322 | 实验级 |
| 熏烟器 | 用于花粉采集器安装 | ||
| 碳酸氢钠 | EMD Millipore | SX0320 | ACS 级，粉末 |
| 洗瓶（x2） | |||
| 硫酸 | EMD Millipore | SX1244 | ACS 级 |
| Sundance 底置式花粉采集器 | Betterbee 蜂业用品 | PTRAPB | |
| 胶带 | |||
| 木质搅拌棒 | |||
| 木质牙签 |
参考文献
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重印与许可
