需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

DNA锚定的RNA聚合酶用于可编程的体外转录与分子计算

4K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/62073

⸱

2021年12月29日

 ,  , 
1Institute of Biomedical Engineering, University of Toronto

本文内容

摘要

我们描述了一种新型DNA锚定的T7 RNA聚合酶的构建方法，用于调控体外转录反应。本文讨论了蛋白质合成与表征的步骤，验证了转录调控的概念验证实验，并探讨了其在分子计算、诊断学以及分子信息处理中的应用。

摘要

DNA 纳米技术能够实现核酸按照用户预设的形状和动态进行可编程的自组装，适用于多种应用。本研究展示了DNA纳米技术的概念可用于编程噬菌体来源的T7 RNA聚合酶（RNAP）的酶活性，并构建可扩展的合成基因调控网络。首先，通过表达N端带有SNAP标签的RNAP，并将其与苯甲基鸟嘌呤（BG）修饰的寡核苷酸进行化学偶联，从而构建寡核苷酸锚定的T7 RNAP。随后，利用核酸链置换反应实现对聚合酶转录活性的按需编程。此外，辅助性核酸组装结构可用于 "人工转录因子" 调控DNA编程的T7 RNA聚合酶与其DNA模板之间的相互作用。这种体外转录调控机制可实现多种电路行为，如数字逻辑、反馈、级联和多路复用。该基因调控架构的可组合性有助于设计的抽象化、标准化和规模化，这些特性将推动体外系统的快速原型构建 用于生物传感、疾病检测和数据存储等应用的遗传装置。

引言

DNA计算利用一组设计好的寡核苷酸作为计算的介质。这些寡核苷酸通过编程赋予特定序列，能够根据用户指定的逻辑动态组装，并响应特定的核酸输入。在概念验证研究中，计算的输出通常由一组荧光标记的寡核苷酸组成，可通过凝胶电泳或荧光酶标仪检测。在过去30年中，已展示出日益复杂的DNA计算电路，例如各种数字逻辑级联、化学反应网络以及神经网络1,2,3。为了辅助这些DNA电路的构建，研究人员已采用数学模型来预测合成基因电路的功能4,5，并开发了用于正交DNA序列设计的计算工具6,7,8,9,10。与基于硅的计算机相比，DNA计算机的优势在于其能够直接与生物分子相互作用、在无需电源的情况下于溶液中运行，以及整体上的紧凑性和稳定性。随着下一代测序技术的出现，过去二十年中合成DNA计算机的成本下降速度已超过摩尔定律11。基于DNA的计算机应用正逐步涌现，例如用于疾病诊断12,13、驱动分子生物物理学研究14，以及作为数据存储平台15。

显示交叉路径的DNA重组示意图，突出基因交换与重排。
图1：由趾区介导的DNA链置换机制。 趾区（δ）是部分双链上一段游离且未结合的序列。当第二条链上引入一个互补区域（δ*）时，游离的δ区域可作为杂交的趾区，使该链的其余部分（ɑ*）通过一种称为链迁移的可逆拉链/解链反应，缓慢地将其竞争链置换下来。随着δ长度的增加，正向反应的ΔG降低，置换反应更易发生。请点击此处查看该图的放大版本。

迄今为止，大多数DNA计算机利用了动态DNA纳米技术领域中一种成熟的结构模式，即由“趾区”介导的DNA链置换反应（toehold-mediated DNA strand displacement，TMDSD，图1）16。该模式由一段部分双链的DNA（dsDNA）组成，其上带有较短的“趾区”突出端（通常为7至10个核苷酸（nt））。核酸“输入”链可通过趾区与部分双链结构结合，进而将其中一条链从部分双链中置换出来；被释放的链随后可作为下游部分双链结构的输入信号。因此，TMDSD能够实现信号级联放大和信息处理。理论上，正交的TMDSD结构可在溶液中独立运行，从而实现并行的信息处理。目前已发展出多种TMDSD反应的变体形式，例如由趾区介导的DNA链交换反应（TMDSE）17、具有双长结构域的“无泄漏”趾区18、序列错配的趾区19以及由“手柄区（handhold）”介导的链置换反应20。这些创新的设计原理可更精确地调控TMDSD的热力学与动力学特性，从而提升DNA计算的性能。

合成基因回路（如转录基因回路）也具备计算能力21,22,23。这些回路由蛋白质转录因子调控，后者通过结合特定的调控DNA元件来激活或抑制基因的转录。与基于DNA的回路相比，转录回路具有多个优势。首先，酶促转录的周转速率远高于现有的催化性DNA回路，因而每一份输入可产生更多的输出拷贝，提供更高效的信号放大手段。此外，转录回路可产生多种功能性分子作为计算输出，例如适配体或编码治疗性蛋白质的信使RNA（mRNA），可用于多种不同应用。然而，当前转录回路的一个主要局限在于其缺乏可扩展性。这是因为正交的蛋白质转录因子种类极为有限，而从头设计新的蛋白质转录因子在技术上仍具有挑战性且耗时较长。

包含T7 RNAP、SNAP标签、DNA相互作用和RNA转录过程的基因编辑示意图。
图2：“拴系”和“笼状”聚合酶复合物的抽象示意图与作用机制。（A 和 B）通过SNAP标签反应，将寡核苷酸拴系物酶促标记至T7聚合酶上。由“伪”T7启动子及带有与拴系物互补突出端的“笼状”结构组成，可与拴系物杂交并阻断转录活性。（C）当存在操纵子（a*b*）时，其结合至寡核苷酸拴系物（ab）的黏性末端，并置换笼状结构中的b*区域，从而启动转录。本图经Chou和Shih27修改。缩写：RNAP = RNA聚合酶。请点击此处查看该图的放大版本。

本文介绍了一种用于分子计算的新型构建模块，该模块结合了转录电路的功能与基于DNA电路的可扩展性。该构建模块是由T7 RNA聚合酶（T7 RNAP）通过共价连接单链DNA链（图2A）所组成。为了合成这种DNA拴系的T7 RNAP，将聚合酶与N端SNAP标签融合，并在Escherichia coli中进行重组表达24。随后，SNAP标签与带有BG底物修饰的寡核苷酸发生反应。该寡核苷酸链可通过DNA杂交将分子“客体”定位至聚合酶附近。其中一种“客体”为竞争性转录阻断剂，称为“笼”（cage），其结构为不含下游基因的“伪”T7启动子DNA双链（图2B）。当该“笼”通过寡核苷酸链与RNAP结合后，会通过竞争性占据RNAP结合位点，抑制其他DNA模板的结合，从而使RNAP处于“关闭”（“OFF”）状态（图2C）。

为了将聚合酶激活至“开启”状态，设计了在基因的T7启动子上游带有单链“操作子”区域的T7 DNA模板。该操作子区域（即图 a*b*2C 所示区域）可通过TMDSD机制使笼状结构从RNAP上解离，并将RNAP定位至基因T7启动子附近，从而启动转录。此外，也可设计操作子序列与辅助核酸链互补的DNA模板，这些辅助核酸链被称为“人工转录因子”（即 图 3A 中的 TFA 和 TFB 链）。当两条链被引入反应体系后，它们将在操作子位点处组装，形成一个新的拟连续区域 a*b*，进而通过TMDSD机制置换笼状结构，启动转录过程（图 3B）。这些核酸链可通过外源添加或在体系内自行生成的方式提供。

基因调控示意图；转录因子 TF<sub>A</sub>、TF<sub>B</sub>; RNA 聚合酶结合。
图3：通过三组分开关激活剂对聚合酶活性进行选择性编程。（A）当转录因子（TFA 和 TFB）存在时，它们会结合到启动子上游的操作子区域，形成一段伪单链序列（a*b*），该序列可通过黏性末端介导的DNA链置换反应（toehold-mediated DNA displacement）将笼状结构置换出来。（B）该 a*b* 区域可通过TMDSD置换笼状结构，从而启动转录。本图经Chou和Shih27修改。缩写：TF = 转录因子；RNAP = RNA聚合酶；TMDSD = 黏性末端介导的DNA链置换反应。请点击此处查看此图的放大版本。

利用基于核酸的转录因子实现体外转录调控，可规模化地构建复杂的电路行为，例如数字逻辑、反馈和信号级联。例如，可通过设计核酸序列，使上游基因的转录产物激活下游基因，从而构建逻辑门级联。该技术所实现的信号级联与多重化能力，可应用于开发更复杂的分子计算电路，用于便携式诊断和分子数据处理。此外，将分子计算与从头RNA合成能力相结合，可拓展新的应用。例如，可设计分子电路以检测一种或多种用户自定义的RNA作为输入，并输出具有治疗功能的RNA，或编码功能性多肽或蛋白质的mRNA，用于即时医疗应用场景。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

1. 缓冲液的配制

注意：蛋白质纯化缓冲液的配制可在任意一天进行；此处是在开始实验前完成的。

  1. 准备裂解/平衡缓冲液，包含 50 mM 三(羟甲基)氨基甲烷 (Tris)、300 mM 氯化钠 (NaCl)、5% 甘油和 5 mM β-巯基乙醇 (BME)，pH 8。将 1.5 mL 1 M Tris、1.8 mL 5 M NaCl、1.5 mL 甘油和 25.2 mL 去离子水 (ddH2O) 加入 50 mL 离心管中，使用前立即加入 10.5 µL 14.2 M BME。
    注意：Tris 可引起急性毒性，避免吸入其粉尘，避免接触皮肤和眼睛。BME 有毒，仅可在通风橱中使用。务必在重悬细胞和进行细胞裂解前最后加入 BME。裂解缓冲液配方见表 1。
  2. 准备洗涤缓冲液（pH 8），包含 50 mM Tris、800 mM NaCl、5% 甘油、5 mM BME 和 20 mM 咪唑。将 1.5 mL 1 M Tris、4.8 mL 5 M NaCl、1.5 mL 甘油和 22.2 mL ddH2O 加入 50 mL 离心管中。使用前，向上述溶液 20 mL 中加入 7 µL 14.2 M BME 和 200 µL 2 M 咪唑。
    注意：为防止咪唑引起的急性毒性，应使用个人防护装备。务必在洗脱柱中蛋白前最后加入 BME 和咪唑。洗涤缓冲液配方见表 2。
  3. 准备洗脱缓冲液（pH 8），包含 50 mM Tris、800 mM NaCl、5% 甘油、5 mM BME 和 200 mM 咪唑。将 0.5 mL 1 M Tris、1.6 mL 5 M NaCl、0.5 mL 甘油和 6.4 mL ddH2O 加入 15 mL 离心管中。使用前，向上述溶液 10 mL 中加入 3.5 µL 14.2 M BME 和 1 mL 2 M 咪唑。
    注意：务必在从层析柱中洗脱蛋白前最后加入 BME 和咪唑。洗脱缓冲液配方见表 3。
  4. 准备 2× 储存缓冲液（需与甘油按 1:1 混合），包含 100 mM Tris、200 mM NaCl、40 mM BME 和 2 mM 乙二胺四乙酸 (EDTA)，以及 0.2% 非离子型表面活性剂（见材料表）。在 50 mL 离心管中加入 5 mL 1 M Tris、2 mL 5 M NaCl、42.56 mL ddH2O、200 µL 0.5 M EDTA 和 100 µL 非离子型表面活性剂，配制 50 mL 储存缓冲液。混合至溶液均匀，用 0.2 µm 注射式滤器过滤，并在使用前向上述溶液中加入 140.8 µL BME。
    注意：为避免 EDTA 引起的急性毒性，避免吸入其粉尘，避免接触皮肤和眼睛。务必在储存纯化蛋白前最后加入 BME，并将整个储存缓冲液与甘油按 1:1 混合。储存缓冲液配方见表 4。

2. 过夜培养物生长：第1天

  1. 通过将500 mg卡那霉素溶解于10 mL ddH2O中，制备1,000倍浓缩的卡那霉素储备液。
    注意：请使用个人防护装备，以防止卡那霉素引起的急性毒性。
  2. 向20 mL LB培养基中加入20 µL 1,000倍浓缩的卡那霉素储备液。使用无菌移液器吸头挑取转化后的BL21 E. coli甘油菌种，并将该吸头插入培养基中，接种菌液。

pQE 80L Kan SNAP T7 RNAP 质粒图谱；基因元件、启动子、复制起点。
图 4：SNAP T7 RNAP 质粒图谱。 该质粒编码T7 RNA聚合酶（T7 RNAP），其N端带有组氨酸标签（6x His）和SNAP-tag结构域（SNAP T7 RNAP），由pQE-80L骨架上的lac阻遏蛋白（lacI）调控。其他元件包括卡那霉素抗性基因（KanR）和氯霉素抗性基因（CmR）。缩写：RNAP = RNA聚合酶。 请点击此处查看此图的放大版本。

注意：该质粒编码一个含有N端组氨酸标签和SNAP标签结构域的T7 RNA聚合酶（SNAP T7 RNAP），以及位于pQE-80L骨架上的卡那霉素抗性基因（图4）25。

  1. 再次向另一个含有 20 mL 溶菌肉汤的培养瓶中加入 20 µL 的 1,000 倍卡那霉素储备液，并作为对照进行培养。
  2. 将两个样品（来自步骤 2.2 和 2.3）在 37 °C、10 × g 振荡条件下过夜培养 12–18 小时。

3. 细胞培养与诱导：第2天

  1. 取4 mL步骤2.4中过夜培养的菌液，接种于含有400 µL卡那霉素储备液的400 mL LB（Luria-Bertani）培养基中。将培养瓶置于37 °C、10 × g振荡培养。
  2. 当培养液在600 nm处的光密度（OD）达到约0.5时，从培养瓶中取出1 mL样品作为对照。将对照样品置于4 °C保存。
  3. 通过向每100 mL培养液中加入40 µL 1 M的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），使IPTG终浓度为0.4 mM，以诱导细胞表达。将样品在37 °C、10 × g条件下继续振荡培养3小时，然后在8,000 × g离心10分钟，收集菌体沉淀。弃去上清液，将菌体沉淀于-20 °C保存，待后续使用。
    ​注意：为避免IPTG引起的急性毒性，请勿吸入其粉尘，避免与皮肤和眼睛接触。必要时，可在此暂停实验，次日继续操作。

4. 细胞裂解、蛋白纯化：第3天

  1. 将储存的细胞沉淀物在冰上用 10 mL 裂解缓冲液重悬，轻轻旋转混匀，确保整个沉淀完全重悬。然后将 1 mL 样品分装至十个预冷的 1.5 mL 离心管中，保持在冰上。
  2. 对每个样品进行超声处理，设定振幅为“1”，以 50% 占空比脉冲超声 2 秒，持续 30 秒。每次处理前后均需用 70% 乙醇和 ddH2O 清洗超声探头。所有样品在超声过程中及之后均需保持在冰上。
    注意：70% 乙醇应远离热源和明火。
  3. 将镍离子负载的亚氨二乙酸（Ni-NTA）纯化离心柱平衡至工作温度 4 °C。将该柱置于 4 °C 下保存，并在使用时保持在冰上。
  4. 将十个 1 mL 样品在 4 °C 下以 15,000 × g 离心 20 分钟。小心吸取上清液（含重组 RNAP），避免扰动沉淀。如有必要，使用额外的平衡缓冲液调节总体积至 ≥ 6 mL。
  5. 轻轻移除 Ni-NTA 离心柱底部标签，使液体可流经柱体。将柱放入离心管中，并保持在冰上。
    注意：使用 50 mL 离心管配合 3 mL Ni-NTA 离心柱。
  6. 在 4 °C 下以 700 × g 离心 2 分钟，去除储存缓冲液。向柱中加入 6 mL 平衡缓冲液，使缓冲液完全进入树脂床，以完成柱的平衡。
  7. 在 4 °C 下以 700 × g 离心 2 分钟，去除平衡缓冲液。在将制备好的细胞提取物加入柱前，先在柱底部插入底塞，防止产物损失。然后将细胞提取物加入柱中，在 4 °C 下于旋转摇床中混合 30 分钟。
  8. 移除柱的底塞，并将柱放入标记为穿流液的 50 mL 离心管中。在 700 × g 下离心 2 分钟，收集穿流液。
  9. 向柱中加入 6 mL 洗涤缓冲液，洗涤树脂。在 700 × g 下离心 2 分钟，将组分收集至新标记为洗涤 1的离心管中。重复此步骤两次，共获得三个独立的洗涤组分，并分别收集至不同的离心管中（洗涤 2 和 洗涤 3）。
  10. 向柱中加入 3 mL 洗脱缓冲液，洗脱 His 标签蛋白。在 700 × g 下离心 2 分钟，将组分收集至新标记为洗脱液 1的离心管中。重复此步骤两次，共获得三个独立的洗脱组分，并分别收集至不同的离心管中（洗脱液 2 和 洗脱液 3）。
  11. 合并洗脱液，并进行脱盐处理以去除蛋白溶液中的盐分。
    1. 用移液器将 15 mL 0.05 % w/v 吐温-20（polysorbate 20）加入 100 kDa 离心过滤装置中。在 4,000 × g 下离心 40 分钟，弃去穿流液。
    2. 使用包被的滤膜浓缩洗脱液 1、2 和 3（共 9 mL 蛋白洗脱液 + 6 mL 储存缓冲液）至约 1,500 µL。在 3,220 × g 下离心 20 分钟，并轻轻用移液器冲洗膜表面，防止沉淀。
    3. 用储存缓冲液将样品稀释至 15 mL。通过重复步骤 4.11.2 两次，使用储存缓冲液（1:1,000）进行缓冲液置换。
  12. 通过测定组分在 280 nm 处的吸光度来定量纯化后的蛋白。使用储存缓冲液（4 °C 下的 2 倍储存缓冲液）作为空白对照校准分光光度计。轻轻混匀合并后的洗脱液样品，并测定其吸光度。
    注意：对蛋白样品进行 1 倍、10 倍和 50 倍稀释，分别测定三次吸光度，取平均值用于蛋白定量。稀释时使用储存缓冲液。
  13. 使用 2 倍储存缓冲液将蛋白样品调整至 100 µM。将调整后的样品与 100% 甘油按体积 1:1 混合。将所得蛋白溶液储存于 -80 °C。

5. 蛋白质产物的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析：第3天

  1. 进行 SDS-PAGE 凝胶电泳以分析蛋白质。取 9 µL 样品与 3 µL 4x 十二烷基硫酸锂（LDS）蛋白上样缓冲液混合，于 95 °C 加热 10 分钟。
  2. 将样品上样至 4-12% Bis-Tris SDS-PAGE 凝胶。在第 1 孔加入蛋白分子量标记物，随后依次上样（从左至右）：穿流组分、洗涤 1、洗涤 2、洗涤 3、洗脱 1、洗脱 2、洗脱 3 和总脱盐洗脱液。
    注意：表 5 提供了 SDS-PAGE 凝胶的样品上样示例表。
  3. 在 2-(N-吗啉代)乙磺酸（MES）缓冲液中以 200 V 电压电泳 35 分钟。使用 200 mL 去离子水（ddH2O）在洁净托盘中清洗凝胶三次，每次 10 分钟，并轻轻振荡以去除凝胶基质中的 SDS。
    注意：请穿戴个人防护装备，避免因接触 MES 引起急性毒性。
  4. 用 20 mL 考马斯亮蓝染色液对凝胶染色，并在室温下轻轻振荡孵育过夜。随后在 200 mL 去离子水（ddH2O）中脱色两次，每次 1 小时，使用旋转摇床轻轻振荡。
    注意：延长洗涤时间或频繁更换水可提高染色灵敏度。此外，在容器中放入折叠的洁净擦拭纸巾以吸收多余染料，可加快脱色进程。

6. 通过体外转录对 SNAP T7 RNAP 进行功能验证

注意：本实验方案使用编码荧光 Broccoli RNA 适体的 DNA 模板，可通过荧光酶标仪利用荧光信号监测转录动力学。

  1. 设置三个体外转录（IVT）反应，以比较SNAP T7 RNAP与来自商业来源的野生型（WT）T7 RNAP以及仅含缓冲液的对照组的活性。将每个反应的体积调整至20 µL。
    1. 通过混合2 µL 10x转录缓冲液、0.4 µL 25 mM核糖核苷三磷酸（rNTP）混合物、5 µL 500 nM DNA模板、2 µL 500 nM SNAP T7 RNAP以及10.6 µL ddH2O，配制SNAP T7 RNAP IVT反应体系。
    2. 通过混合2 µL 10x转录缓冲液、0.4 µL 25 mM rNTP混合物、5 µL 500 nM DNA模板、2 µL WT T7 RNAP以及10.6 µL ddH2O，配制WT RNAP IVT反应体系。
    3. 通过混合2 µL 10x转录缓冲液、0.4 µL 25 mM rNTP混合物、5 µL 500 nM DNA模板以及12.6 µL ddH2O，配制仅含缓冲液的IVT反应体系。
      注意：RNAP应在最后加入，并在加入前将样品保持在冰上。表6、表7和表8包含IVT反应的配方。
  2. 使用荧光酶标仪在37 °C条件下每2分钟监测一次转录动力学，持续2小时，激发波长为470 nm，发射波长为512 nm。

7. BG修饰寡核苷酸的制备：第1天

  1. 将带有3'-胺基修饰的寡核苷酸溶解于ddH2O中，使其终浓度为1 mM。将此溶液标记为S1。
    1. 取25 µL 1 M 碳酸氢钠（NaHCO3）、284 µL 100% 二甲基亚砜（DMSO）、125 µL S1（寡核苷酸储备液）以及66 µL 用DMSO稀释的50 mM BG-N-羟基琥珀酰亚胺酯（BG-GLA-NHS），加水调节总体积至500 µL，在室温下以100 × g 条件孵育过夜。
      注意：DMSO为可燃液体，应远离热源和明火。表9列出了BG与寡核苷酸偶联的反应配方。

8. BG-寡核苷酸偶联物的乙醇/丙酮沉淀：第2天

  1. 离心步骤 7.1.1 的产物，13,000 × g 5分钟。小心将上清液转移至新管，弃去任何沉淀的BG。将反应液均分为两等份 250 µL 分装样品以防止溢出，并对两份分装样品同时进行以下步骤。
  2. 加入1/10th 3 M 醋酸钠体积的25 µL)，随后加入2.5倍体积的100%乙醇（625 µL）。于 -80 °C 1小时。
    注意：处理乙酸钠（可能引起眼睛、皮肤、消化道和呼吸道刺激）和乙醇（极度易燃，接触可引起刺激）时，须使用个人防护装备。必要时，可在此暂停实验，次日继续。
  3. 将试管放入离心机中，并标记外缘。在17,000 × g 30 分钟 4 °C.
    注意：寡核苷酸沉淀将出现在试管的标记边缘处。
  4. 不扰动沉淀，弃去上清液。用……补足体积 750 µL 70% 乙醇，4℃离心，转速为 17,000 × g 10 分钟 4 °C.
  5. 不扰动沉淀，弃去上清液。用……补足体积 750 µL 100% 丙酮，于 17,000 × g 10 分钟 4 °C.
    注意：处理丙酮时需使用个人防护装备，因为丙酮极易燃，接触后会引起刺激。
  6. 管盖打开，室温干燥5分钟，通过蒸发去除残留的丙酮。将寡核苷酸重新溶解于 250 µL 1× Tris-EDTA（TE）缓冲液，以产生约~850 µM BG-寡核苷酸溶液
  7. 重复步骤 8.2 至 8.6，并重新溶解于 70 µL 1× TE 缓冲液。标记此管 S2.

9. 通过凝胶过滤色谱法纯化BG-寡核苷酸

  1. 通过多次剧烈倒置柱子使基质悬浮；取下顶部盖帽，并折断柱子底部的尖端。将柱子放入一个 1.5 mL 离心管中，在室温下以 1,000 × g 离心 1 分钟。弃去流出的缓冲液和收集管。
    注意：必须防止真空形成。制备好的柱子应立即使用。
  2. 将装填好的柱子置于洁净的 1.5 mL 离心管中。向柱床中心加入 300 µL 1× TE 缓冲液，在 1,000 × g 条件下离心 2 分钟，以置换缓冲液。再次弃去流出的缓冲液和收集管。
  3. 将完成缓冲液置换的柱子放入洁净的 1.5 mL 离心管中。将最多 75 µL 样品加至柱床中心，以 1,000 × g 离心 4 分钟。
    注意：操作过程中不得扰动柱床或触碰柱管内壁；凝胶介质的最高点应朝向外侧转子方向。
  4. 从收集管中收集洗脱液，其中含有纯化的核酸。为定量样品，测量其在 260 nm 处的吸光度，并标记为 S3。
    注意：需记录测量时所用的光程长度，并依据朗伯-比尔定律计算浓度。

10. BG-寡核苷酸偶联物的变性PAGE分析

  1. 制备18% Tris-硼酸-EDTA（TBE）-尿素PAGE凝胶。将4.8 g尿素、4.5 mL 40%丙烯酰胺（19:1）、1 mL 10×TBE溶解于2.8 mL去离子H2O中；加入5 µL四甲基乙二胺（TEMED），充分混匀。随后加入100 µL 10%过硫酸铵（APS），再次混匀。将溶液倒入空的凝胶模具中，室温聚合40分钟。
    注意：操作尿素（可引起眼睛和皮肤刺激）、丙烯酰胺（有毒且具致癌性）和TEMED（有毒、易燃、腐蚀性）时，应佩戴适当的个人防护装备。表10列出了18% TBE-尿素聚丙烯酰胺凝胶的反应配方。
  2. 将500 mL TBE缓冲液（0.5×）放入微波炉加热2分30秒或至约70 °C，倒入电泳装置中。配制含95%甲酰胺、1 mM EDTA和溴酚蓝的变性上样染料。将上样染料与各待测样品混合后，加样至聚丙烯酰胺凝胶中。
    注意：甲酰胺具有致癌性，操作时应佩戴适当的个人防护装备。表11提供了一个示例凝胶上样表。
  3. 以270 V电压电泳35分钟，或直至染料前沿迁移至凝胶底部。将凝胶转移至染色盒中，室温下用核酸用氰染料染色15分钟，随后进行成像。
    注意：氰染料具可燃性，操作时应佩戴适当的个人防护装备。

11. 寡核苷酸与SNAP T7 RNAP的偶联及PAGE分析

  1. 准备用于分析规模下BG-寡核苷酸与SNAP T7 RNAP偶联的试剂：用ddH2O对单链DNA（ssDNA）寡核苷酸进行9次稀释，以获得寡核苷酸:RNAP比例从5:1到1:5的系列样品。将蛋白原液稀释至50 µM。
    注：示例比例见表12；这些比例基于RNAP浓度为50 µM计算得出。
  2. 针对每种ssDNA寡核苷酸稀释液，配制10 µL反应体系，包含2 µL SNAP缓冲液、4 µL BG-寡核苷酸和4 µL SNAP T7 RNAP。
    注：表13列出了SNAP-tag标记反应的反应配方。
    1. 另准备两个对照样品：1）RNAP对照，用ddH2O替代BG-寡核苷酸；2）DNA对照，用ddH2O替代SNAP T7 RNAP（适用于SNAP T7 RNAP的最低寡核苷酸浓度）。将所有样品在室温下孵育1小时，之后置于冰上保存待用。
  3. 通过向每种样品中加入2 µL样本、4 µL SNAP缓冲液和2 µL蛋白上样缓冲液，建立11个10 µL的反应体系，并在70 °C加热10分钟。将每种样品取2 µL上样至4-12% Bis-Tris蛋白凝胶，在冰浴条件下以200 V电泳35分钟。
    注：表14列出了凝胶上样样品的反应配方。
    1. 通过振荡器上三次水洗去除SDS，每次洗涤持续10分钟。成像前先用氰基染料对核酸染色15分钟。再用20 mL考马斯亮蓝染色液染色1小时。染色后用ddH2O脱色1小时（或过夜），然后进行成像。
      注：在凝胶中，其中一个反应将产生最多的共价连接聚合酶，同时游离BG-寡核苷酸残留最少；该条件即为最优比例。
  4. 准备用于制备规模下BG-寡核苷酸与SNAP T7 RNAP偶联的试剂。按照分析规模确定的最优比例进行偶联反应。
    ​注：不使用时应将蛋白置于冰上，以尽量减少其暴露于室温环境。

12. 使用离子交换柱纯化寡核苷酸连接的 SNAP-T7

  1. 如果管路设置与本文所列说明有差异，请遵循制造商的说明。配制 pH 值高于蛋白质等电点的纯化缓冲液。
    注意：在本方案示例蛋白中，使用了10 mM磷酸钠缓冲液（pH 7）作为纯化缓冲液。
    1. 准备 1,000 µL 含50 mM Tris和0.5 M NaCl终浓度的洗脱缓冲液。混匀 50 µL 1 M Tris 溶液 100 µL 5 M NaCl溶液 850 µL 去离子水2O.
      注意： 表15 含有洗脱缓冲液的反应公式。
  2. 将层析柱放入2 mL离心管中，用纯化缓冲液在2,000 × g 15 分钟，或直至所有缓冲液完全洗脱。弃去洗脱的缓冲液。
  3. 按3:1的纯化缓冲液与样品比例，用纯化缓冲液稀释各样品，并将样品加载至层析柱中 400 µL 一次进行。在2,000 × g 10 分钟，或直至所有缓冲液均被洗脱。收集流出液，并标记为 流过式.
  4. 添加 400 µL 将纯化缓冲液加入柱子中心。以2,000 × g 15 分钟，或直至所有缓冲液完全流出。收集流出液，并标记为 洗涤 1再重复两次 洗涤 2 次 和 洗涤 3 次.
  5. 添加 50 µL 将洗脱缓冲液加入柱子的中心位置。以2,000 × g 5 分钟，或直至所有缓冲液完全流出。收集流出液，并标记为 洗脱液 1再重复两次 洗脱液 2 和 洗脱液 3.
  6. 合并洗脱液1、2和3（标记此管 总洗脱液），留取少量每份洗脱液用于凝胶电泳，并测定260 nm（A260）和280 nm（A280）处的吸光度。测定后，按1:1比例加入甘油，于-80 °C保存。20 °C 直至进一步使用。
  7. 使用离心过滤装置（0.5 mL；30 kDa）进行缓冲液置换 总洗脱液 加入2倍储存缓冲液（约1:100）（标记此管 产品）。再次测定 A260/280。按 1:1 比例加入甘油，于 -20 °C 直至进一步使用。
  8. 将每个洗脱组分：流穿液、洗涤液1-3、总洗脱液和产物，连同样品蛋白分子量标记物，一同上样至4-12% Bis-Tris SDS-PAGE凝胶。以200 V电压电泳35分钟，或直至染料前沿迁移至凝胶底部。

13. 锚定式RNA聚合酶活性的按需控制演示

  1. 制备含有 25 mM Tris、5 mM EDTA 和 25 mM 氯化镁（MgCl2）的 5x 退火缓冲液。将每种模板（1 µM）各取 2.4 µL 与 5 µL 退火缓冲液和 14.2 µL ddH2O 混合，配制成 25 µL 的 1 µM 双链 DNA 笼结构。将该溶液在 75 °C 下孵育 2 分钟。同样地，使启动子及孔雀石绿适体 DNA 模板的正义链与反义链进行退火。制备 1 mM 的孔雀石绿草酸盐溶液。
    注：表 16 包含 5x 退火缓冲液的反应配方，表 17 包含两条单链 DNA 模板退火的反应配方。
  2. 将固定化的 SNAP-T7 RNA 聚合酶与双链 DNA 笼以 1:5 的摩尔比在室温下孵育 15 分钟，使 RNAP 的终浓度为 500 nM。孵育后置于冰上保存，待用。
  3. 将酶标仪预热至 37 °C。在冰上设置三组 25 µL 的体外转录（IVT）反应
    1. 设置含有核酸转录因子的封闭型 SNAP-T7RNAP 反应体系：在 10 µL ddH2O 中混合 2.5 µL 10x IVT 缓冲液、1 µL 25 mM rNTP 混合液、1 µL 1 mM 孔雀石绿、2.5 µL RNAP-笼混合物、各 2.5 µL 的 1 µM 转录因子 A 和 B 寡核苷酸链，以及 3 µL 1 mM 孔雀石绿适体模板。
    2. 设置不含核酸转录因子的封闭型 SNAP-T7RNAP 反应体系：在 15 µL ddH2O 中混合 2.5 µL 10x IVT 缓冲液、1 µL 25 mM rNTP 混合液、1 µL 1 mM 孔雀石绿、2.5 µL RNAP-笼混合物，以及 3 µL 1 mM 孔雀石绿适体模板。
    3. 设置仅含缓冲液的对照反应体系：在 17.5 µL ddH2O 中混合 2.5 µL 10x IVT 缓冲液、1 µL 25 mM rNTP 混合液、1 µL 1 mM 孔雀石绿，以及 3 µL 1 mM 孔雀石绿适体模板。
      注：表 18 提供了体外转录反应的通用参考配方。
  4. 将每个反应体系转移至 384 孔板中。使用荧光酶标仪在 37 °C 下监测孔雀石绿适体的转录过程，激发波长为 610 nm，发射波长为 655 nm，持续 2 小时。反应结束后，将板置于冰上保存，待用。
  5. 将 0.5x TBE 缓冲液微波加热 2 分 30 秒，或加热至约 70 °C。在预热的 0.5x TBE 缓冲液中，以 280 V 电压在变性 12% TBE-尿素聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离各孔中的 RNA 产物，持续 20 分钟，或直至染料前沿迁移至凝胶底部。电泳结束后，在摇床上用氰染料核酸染色剂染色 10 分钟，随后进行成像分析。
    注：表 19 包含变性 12% TBE-尿素 PAGE 凝胶的反应配方。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

电泳凝胶蛋白质分析和荧光检测图表，显示 SNAP T7 RNAP 表达结果。
图 5：SNAP T7 RNAP 表达的 SDS-PAGE 分析及体外转录检测。 （A）SNAP T7 RNAP 蛋白纯化分析，SNAP T7 RNAP 分子量：119.4 kDa。FT = 柱流穿液，W1 = 含杂质的洗涤缓冲液洗脱组分，E1-3 = 含纯化产物的洗脱组分，DE = 10 倍稀释的去盐总洗脱液。使用 4–12% 预制 Bis-Tris 蛋白凝胶，染色剂：考马斯亮蓝，运行缓冲液：MES 缓冲液，电泳条件：200 V，35 分钟。（B）通过随时间测量荧光适体的生成量，对 SN...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

本研究展示了一种受DNA纳米技术启发的方法，通过将N端带有SNAP标签的重组T7 RNA聚合酶（T7 RNAP）与含BG修饰的寡核苷酸共价偶联，实现对T7 RNA聚合酶活性的调控，并进一步用于编程TMDSD反应。设计上选择将SNAP标签置于聚合酶的N端，因为野生型T7 RNAP的C端埋藏于蛋白质结构核心内部，并与DNA模板形成关键相互作用28。此前尝试修饰聚合酶C端均导致酶活性完全丧失，除非引入其他补偿性突变29,30。相比之下，T7 RNAP的N端融合通常可被良好耐受，尽管所选融合标签可能影响聚合酶活性。不同标签对RNAP活性的具体影响尚未系统阐明。本研究选用SNAP标签，因其具有高效性和稳健性，可实现蛋白质与寡核苷酸之间化学计量比的定量标记。此外，也可采用其他偶联化学方法将寡核苷酸连接至聚合酶，例如Ybbr31标签、Sortase标签32、SpyTags

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

所有作者均无任何需要声明的竞争性经济利益。

致谢

L.Y.T.C. 感谢新前沿研究基金-探索项目（New Frontiers in Research Fund-Exploration，NFRF-E）、加拿大自然科学与工程研究委员会（NSERC）发现资助计划以及多伦多大学“设计医学”计划提供的大力支持，其中“设计医学”计划获得了加拿大优先研究卓越基金（Canada First Research Excellence Fund，CFREF）的资助。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.5% 聚山梨酯 20 (TWEEN 20)BioShopTWN510.5
0.5M 乙二胺四乙酸 (EDTA)Bio BasicSD8135
10 mM 磷酸钠缓冲液 (pH 7)Bio BasicPD0435用于配制 10 mM 缓冲液的片剂
10% 过硫酸铵 (APS)Sigma AldrichA3678-100G
100 kDa Amicon Ultra-15 离心过滤单元Fisher ScientificUFC910008
100% 丙酮Fisher ChemicalA18P4
100% 乙醇 (EtOH)House Brand39752-P016-EAAN
10x 体外转录 (IVT) 缓冲液New England BiolabsB9012
10x Tris-硼酸-EDTA (TBE) 缓冲液Bio BasicA0026
1M 异丙基 β-d-1-硫代半乳糖吡喃糖苷 (IPTG)Sigma AldrichI5502-1G
1M 碳酸氢钠缓冲液Sigma AldrichS6014-500G
1M 三(羟甲基)氨基甲烷 (Tris)Sigma Aldrich648311-1KG
1X Tris-EDTA (TE) 缓冲液ThermoFisher12090015
2M 咪唑Sigma Aldrich56750-100G
2-巯基乙醇 (BME)Sigma AldrichM3148
3M 醋酸钠Bio BasicSRB1611
40% 丙烯酰胺 (19:1)Bio BasicA00062
4x LDS 蛋白样品上样缓冲液Fisher ScientificNP0007
5M 氯化钠 (NaCl)Bio BasicDB0483
5mM 二硫苏糖醇 (DTT)Sigma Aldrich43815-1G
6x 凝胶上样染料New England BiolabsB7024S
琼脂糖 B 粉末Bio BasicAB0014
BG-GLA-NHSNew England BiolabsS9151S
BL21 感受态大肠杆菌 (E. coli)AddgeneC2530H
BLUeye 预染蛋白 MarkerFroggaBioPM007-0500
溴酚蓝Bio BasicBDB0001
考马斯亮蓝 (SimplyBlue SafeStain)ThermoFisherLC6060
花青染料 (SYBR Gold 核酸凝胶染色剂)Fisher ScientificS11494
花青染料 (SYBR Safe 核酸凝胶染色剂)Fisher ScientificS33102
干燥二甲基亚砜 (DMSO)Fisher ScientificD12345
甲酰胺Sigma AldrichF9037-100ML
甘油Bio BasicGB0232
硫酸卡那霉素BioShopKAN201.5
LB 培养基 (Lysogeny broth)Sigma AldrichL2542-500ML
孔雀石绿草酸盐Sigma Aldrich2437-29-8
N,N,N',N'-四甲基乙二胺 (TEMED)Sigma AldrichT9281-25ML
NuPAGE MES SDS 电泳缓冲液 (20x)Fisher ScientificLSNP0002
NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris 凝胶 1.0 mm 12 孔Life TechnologiesNP0322BOX
寡核苷酸 (笼型反义链)IDTN/ATATAGTGAGTCGTATTAATTTG
寡核苷酸 (笼型正义链)IDTN/ATCAGTCACCTATCTGTTTCAAA
TTAATACGACTCACTATA
寡核苷酸 (孔雀石绿适配体反义链)IDTN/AGGATCCATTCGTTACCTGGCT
CTCGCCAGTCGGGATCCTATA
GTGAGTCGTATTACAGTTCCAT
TATCGCCGTAGTTGGTGTACT
寡核苷酸 (孔雀石绿适配体正义链)IDTN/ATAATACGACTCACTATAGGATC
CCGACTGGCGAGAGCCAGGT
AACGAATGGATCC
寡核苷酸 (转录因子 A)IDTN/AAGTACACCAACTACGAGTGAG
寡核苷酸 (转录因子 B)IDTN/ATCAGTCACCTATCTGGCGATAA
TGGAACTG
带有 3’ 胺基修饰的寡核苷酸 (连接臂)IDTN/AGCTACTCACTCAGATAGGTGAC
TGA/3AmMO/
Pierce 强离子交换离心柱Fisher Scientific90008
编码 SNAP T7 RNA 聚合酶和卡那霉素抗性基因的质粒GenscriptN/A定制基因插入片段
蛋白纯化柱 (HisPur Ni-NTA 离心柱)Fisher Scientific88226
rNTP 混合物New England BiolabsN0466S
Roche 小型快速 DNA 离心柱Sigma Aldrich11814419001
吐温 X-100 (Triton X-100)Sigma AldrichT8787-100ML
超低分子量 DNA MarkerFisher Scientific10597012
尿素BioShopURE001.1

参考文献

  1. Cherry, K. M., Qian, L. Scaling up molecular pattern recognition with DNA-based winner-take-all neural networks. Nature. 559 (7714), 370-376 (2018).
  2. Qian, L., Winfree, E., Bruck, J. Neural network computation with DNA strand displacement cascades. Nature. 475 (7356), 368-372 (2011).
  3. Chen, Y. -J., et al. Programmable chemical controllers made from DNA. Nature Nanotechnology. 8 (10), 755-762 (2013).
  4. di Bernardo, D., Marucci, L., Menolascina, F., Siciliano, V. Predicting synthetic gene networks. Synthetic Gene Networks: Methods and Protocols. 813, 57-81 (2012).
  5. Xiang, Y., Dalchau, N., Wang, B. Scaling up genetic circuit design for cellular computing: advances and prospects. Natural Computing. 17 (4), 833-853 (2018).
  6. Gould, N., Hendy, O., Papamichail, D. Computational tools and algorithms for designing customized synthetic genes. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 2, (2014).
  7. MacDonald, J. T., Siciliano, V. Computational sequence design with R2oDNA Designer. Mammalian Synthetic Promoters. 1651, 249-262 (2017).
  8. Cervantes-Salido, V. M., Jaime, O., Brizuela, C. A., Martínez-Pérez, I. M. Improving the design of sequences for DNA computing: A multiobjective evolutionary approach. Applied Soft Computing. 13 (12), 4594-4607 (2013).
  9. Zadeh, J. N., et al. NUPACK: Analysis and design of nucleic acid systems. Journal of Computational Chemistry. 32 (1), 170-173 (2011).
  10. Fornace, M. E., Porubsky, N. J., Pierce, N. A. A unified dynamic programming framework for the analysis of interacting nucleic acid strands: enhanced models, scalability, and speed. ACS Synthetic Biology. 9 (10), 2665-2678 (2020).
  11. Wetterstrand, K. DNA sequencing costs: Data. Genome.gov. , (2020).
  12. Lopez, R., Wang, R., Seelig, G. A molecular multi-gene classifier for disease diagnostics. Nature Chemistry. 10 (7), 746-754 (2018).
  13. Pardee, K., et al. low-cost detection of Zika virus using programmable biomolecular components. Cell. 165 (5), 1255-1266 (2016).
  14. Yurke, B., Turberfield, A. J., Mills, A. P., Simmel, F. C., Neumann, J. L. A DNA-fuelled molecular machine made of DNA. Nature. 406 (6796), 605-608 (2000).
  15. Lin, K. N., Volkel, K., Tuck, J. M., Keung, A. J. Dynamic and scalable DNA-based information storage. Nature Communications. 11 (1), 2981(2020).
  16. Yurke, B., Mills, A. P. Using DNA to power nanostructures. Genetic Programming and Evolvable Machines. 4 (2), 111-122 (2003).
  17. Zhang, D. Y., Turberfield, A. J., Yurke, B., Winfree, E. Engineering entropy-driven reactions and networks catalyzed by DNA. Science. 318 (5853), 1121-1125 (2007).
  18. Wang, B., Thachuk, C., Ellington, A. D., Winfree, E., Soloveichik, D. Effective design principles for leakless strand displacement systems. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (52), 12182-12191 (2018).
  19. Machinek, R. R. F., Ouldridge, T. E., Haley, N. E. C., Bath, J., Turberfield, A. J. Programmable energy landscapes for kinetic control of DNA strand displacement. Nature Communications. 5 (1), 5324(2014).
  20. Cabello-Garcia, J., Bae, W., Stan, G. -B. V., Ouldridge, T. E. Handhold-mediated strand displacement: a nucleic acid-based mechanism for generating far-from-equilibrium assemblies through templated reactions. bioRxiv. , (2020).
  21. Brophy, J. A. N., Voigt, C. A. Principles of genetic circuit design. Nature Methods. 11 (5), 508-520 (2014).
  22. Khalil, A. S., et al. A synthetic biology framework for programming eukaryotic transcription functions. Cell. 150 (3), 647-658 (2012).
  23. Swank, Z., Laohakunakorn, N., Maerkl, S. J. Cell-free gene-regulatory network engineering with synthetic transcription factors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (13), 5892-5901 (2019).
  24. Howland, S. W., Tsuji, T., Gnjatic, S., Ritter, G., Old, L. J., Wittrup, K. D. Inducing efficient cross-priming using antigen-coated yeast particles. Journal of immunotherapy. 31 (7), 607(2008).
  25. Abil, Z., Ellefson, J. W., Gollihar, J. D., Watkins, E., Ellington, A. D. Compartmentalized partnered replication for the directed evolution of genetic parts and circuits. Nature Protocols. 12 (12), 2493-2512 (2017).
  26. Baugh, C., Grate, D., Wilson, C. 2.8 Å crystal structure of the malachite green aptamer11. Journal of Molecular Biology. Doudna, J. A. 301 (1), 117-128 (2000).
  27. Chou, L. Y. T., Shih, W. M. In vitro transcriptional regulation via nucleic acid-based transcription factors. ACS Synthetic Biology. 8 (11), 2558-2565 (2019).
  28. Lykke-Andersen, J., Christiansen, J. The C-terminal carboxy group of T7 RNA polymerase ensures efficient magnesium ion-dependent catalysis. Nucleic Acids Research. 26 (24), 5630-5635 (1998).
  29. Pu, J., Disare, M., Dickinson, B. C. Evolution of C-terminal modification tolerance in full-length and split T7 RNA Polymerase biosensors. Chembiochem. 20 (12), 1547-1553 (2019).
  30. Gardner, L. P., Mookhtiar, K. A., Coleman, J. E. Initiation, elongation, and processivity of carboxyl-terminal mutants of T7 RNA polymerase. Biochemistry. 36 (10), 2908-2918 (1997).
  31. Yin, J., Lin, A. J., Golan, D. E., Walsh, C. T. Site-specific protein labeling by Sfp phosphopantetheinyl transferase. Nature Protocols. 1 (1), 280-285 (2006).
  32. Warden-Rothman, R., Caturegli, I., Popik, V., Tsourkas, A. Sortase-tag expressed protein ligation: combining protein purification and site-specific bioconjugation into a single step. Analytical Chemistry. 85 (22), 11090-11097 (2013).
  33. Zhang, W. -B., Sun, F., Tirrell, D. A., Arnold, F. H. Controlling macromolecular topology with genetically encoded SpyTag-SpyCatcher chemistry. Journal of the American Chemical Society. 135 (37), 13988-13997 (2013).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

标签

DNA T7 RNA DNA SDS PAGE
DNA锚定的RNA聚合酶用于可编程的体外转录与分子计算
联系我们
向图书馆推荐

隐私

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。