我们描述了一种新型DNA锚定的T7 RNA聚合酶的构建方法，用于调控体外转录反应。本文讨论了蛋白质合成与表征的步骤，验证了转录调控的概念验证实验，并探讨了其在分子计算、诊断学以及分子信息处理中的应用。
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本文内容
摘要
摘要
DNA 纳米技术能够实现核酸按照用户预设的形状和动态进行可编程的自组装，适用于多种应用。本研究展示了DNA纳米技术的概念可用于编程噬菌体来源的T7 RNA聚合酶（RNAP）的酶活性，并构建可扩展的合成基因调控网络。首先，通过表达N端带有SNAP标签的RNAP，并将其与苯甲基鸟嘌呤（BG）修饰的寡核苷酸进行化学偶联，从而构建寡核苷酸锚定的T7 RNAP。随后，利用核酸链置换反应实现对聚合酶转录活性的按需编程。此外，辅助性核酸组装结构可用于 "人工转录因子" 调控DNA编程的T7 RNA聚合酶与其DNA模板之间的相互作用。这种体外转录调控机制可实现多种电路行为，如数字逻辑、反馈、级联和多路复用。该基因调控架构的可组合性有助于设计的抽象化、标准化和规模化，这些特性将推动体外系统的快速原型构建 用于生物传感、疾病检测和数据存储等应用的遗传装置。
引言
DNA计算利用一组设计好的寡核苷酸作为计算的介质。这些寡核苷酸通过编程赋予特定序列，能够根据用户指定的逻辑动态组装，并响应特定的核酸输入。在概念验证研究中，计算的输出通常由一组荧光标记的寡核苷酸组成，可通过凝胶电泳或荧光酶标仪检测。在过去30年中，已展示出日益复杂的DNA计算电路，例如各种数字逻辑级联、化学反应网络以及神经网络1,2,3。为了辅助这些DNA电路的构建，研究人员已采用数学模型来预测合成基因电路的功能4,5，并开发了用于正交DNA序列设计的计算工具6,7,8,9,10。与基于硅的计算机相比，DNA计算机的优势在于其能够直接与生物分子相互作用、在无需电源的情况下于溶液中运行，以及整体上的紧凑性和稳定性。随着下一代测序技术的出现，过去二十年中合成DNA计算机的成本下降速度已超过摩尔定律
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方案
1. 缓冲液的配制
注意：蛋白质纯化缓冲液的配制可在任意一天进行；此处是在开始实验前完成的。
- 准备裂解/平衡缓冲液，包含 50 mM 三(羟甲基)氨基甲烷 (Tris)、300 mM 氯化钠 (NaCl)、5% 甘油和 5 mM β-巯基乙醇 (BME)，pH 8。将 1.5 mL 1 M Tris、1.8 mL 5 M NaCl、1.5 mL 甘油和 25.2 mL 去离子水 (ddH2O) 加入 50 mL 离心管中，使用前立即加入 10.5 µL 14.2 M BME。
注意：Tris 可引起急性毒性，避免吸入其粉尘，避免接触皮肤和眼睛。BME 有毒，仅可在通风橱中使用。务必在重悬细胞和进行细胞裂解前最后加入 BME。裂解缓冲液配方见表 1。 - 准备洗涤缓冲液（pH 8），包含 50 mM Tris、800 mM NaCl、5% 甘油、5 mM BME 和 20 mM 咪唑。将 1.5 mL 1 M Tris、4.8 mL 5 M NaCl、1.5 mL 甘油和 22.2 mL ddH2O 加入 50 mL 离心管中。使用前，向上述溶液 20 mL 中加入 7 µL 14.2 M BME 和 200 µL 2 M 咪唑。
注意：为防止咪唑引起的急性毒性，应使用个人防护装备。务必在洗脱柱中蛋白前最后加入 BME 和咪唑。洗涤缓冲液配方....
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结果
图 5：SNAP T7 RNAP 表达的 SDS-PAGE 分析及体外转录检测。 （A）SNAP T7 RNAP 蛋白纯化分析，SNAP T7 RNAP 分子量：119.4 kDa。FT = 柱流穿液，W1 = 含杂质的洗涤缓冲液洗脱组分，E1-3 = 含纯化产物的洗脱组分，DE = 10 倍稀释的去盐总洗脱液。使用 4–12% 预制 Bis-Tris 蛋白凝胶，染色剂：考马斯亮蓝，运行缓冲液：MES 缓冲液，电泳条件：200 V，35 分钟。（B）通过随时间测量荧光适体的生成量，对 SN.......
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讨论
本研究展示了一种受DNA纳米技术启发的方法，通过将N端带有SNAP标签的重组T7 RNA聚合酶（T7 RNAP）与含BG修饰的寡核苷酸共价偶联，实现对T7 RNA聚合酶活性的调控，并进一步用于编程TMDSD反应。设计上选择将SNAP标签置于聚合酶的N端，因为野生型T7 RNAP的C端埋藏于蛋白质结构核心内部，并与DNA模板形成关键相互作用28。此前尝试修饰聚合酶C端均导致酶活性完全丧失，除非引入其他补偿性突变29,30。相比之下，T7 RNAP的N端融合通常可被良好耐受，尽管所选融合标签可能影响聚合酶活性。不同标签对RNAP活性的具体影响尚未系统阐明。本研究选用SNAP标签，因其具有高效性和稳健性，可实现蛋白质与寡核苷酸之间化学计量比的定量标记。此外，也可采用其他偶联化学方法将寡核苷酸连接至聚合酶，例如Ybbr31标签、Sortase标签32、SpyTags
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披露
所有作者均无任何需要声明的竞争性经济利益。
致谢
L.Y.T.C. 感谢新前沿研究基金-探索项目（New Frontiers in Research Fund-Exploration，NFRF-E）、加拿大自然科学与工程研究委员会（NSERC）发现资助计划以及多伦多大学“设计医学”计划提供的大力支持，其中“设计医学”计划获得了加拿大优先研究卓越基金（Canada First Research Excellence Fund，CFREF）的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.5% 聚山梨酯 20 (TWEEN 20) | BioShop | TWN510.5 | |
| 0.5M 乙二胺四乙酸 (EDTA) | Bio Basic | SD8135 | |
| 10 mM 磷酸钠缓冲液 (pH 7) | Bio Basic | PD0435 | 用于配制 10 mM 缓冲液的片剂 |
| 10% 过硫酸铵 (APS) | Sigma Aldrich | A3678-100G | |
| 100 kDa Amicon Ultra-15 离心过滤单元 | Fisher Scientific | UFC910008 | |
| 100% 丙酮 | Fisher Chemical | A18P4 | |
| 100% 乙醇 (EtOH) | House Brand | 39752-P016-EAAN | |
| 10x 体外转录 (IVT) 缓冲液 | New England Biolabs | B9012 | |
| 10x Tris-硼酸-EDTA (TBE) 缓冲液 | Bio Basic | A0026 | |
| 1M 异丙基 β-d-1-硫代半乳糖吡喃糖苷 (IPTG) | Sigma Aldrich | I5502-1G | |
| 1M 碳酸氢钠缓冲液 | Sigma Aldrich | S6014-500G | |
| 1M 三(羟甲基)氨基甲烷 (Tris) | Sigma Aldrich | 648311-1KG | |
| 1X Tris-EDTA (TE) 缓冲液 | ThermoFisher | 12090015 | |
| 2M 咪唑 | Sigma Aldrich | 56750-100G | |
| 2-巯基乙醇 (BME) | Sigma Aldrich | M3148 | |
| 3M 醋酸钠 | Bio Basic | SRB1611 | |
| 40% 丙烯酰胺 (19:1) | Bio Basic | A00062 | |
| 4x LDS 蛋白样品上样缓冲液 | Fisher Scientific | NP0007 | |
| 5M 氯化钠 (NaCl) | Bio Basic | DB0483 | |
| 5mM 二硫苏糖醇 (DTT) | Sigma Aldrich | 43815-1G | |
| 6x 凝胶上样染料 | New England Biolabs | B7024S | |
| 琼脂糖 B 粉末 | Bio Basic | AB0014 | |
| BG-GLA-NHS | New England Biolabs | S9151S | |
| BL21 感受态大肠杆菌 (E. coli) | Addgene | C2530H | |
| BLUeye 预染蛋白 Marker | FroggaBio | PM007-0500 | |
| 溴酚蓝 | Bio Basic | BDB0001 | |
| 考马斯亮蓝 (SimplyBlue SafeStain) | ThermoFisher | LC6060 | |
| 花青染料 (SYBR Gold 核酸凝胶染色剂) | Fisher Scientific | S11494 | |
| 花青染料 (SYBR Safe 核酸凝胶染色剂) | Fisher Scientific | S33102 | |
| 干燥二甲基亚砜 (DMSO) | Fisher Scientific | D12345 | |
| 甲酰胺 | Sigma Aldrich | F9037-100ML | |
| 甘油 | Bio Basic | GB0232 | |
| 硫酸卡那霉素 | BioShop | KAN201.5 | |
| LB 培养基 (Lysogeny broth) | Sigma Aldrich | L2542-500ML | |
| 孔雀石绿草酸盐 | Sigma Aldrich | 2437-29-8 | |
| N,N,N',N'-四甲基乙二胺 (TEMED) | Sigma Aldrich | T9281-25ML | |
| NuPAGE MES SDS 电泳缓冲液 (20x) | Fisher Scientific | LSNP0002 | |
| NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris 凝胶 1.0 mm 12 孔 | Life Technologies | NP0322BOX | |
| 寡核苷酸 (笼型反义链) | IDT | N/A | TATAGTGAGTCGTATTAATTTG |
| 寡核苷酸 (笼型正义链) | IDT | N/A | TCAGTCACCTATCTGTTTCAAA TTAATACGACTCACTATA |
| 寡核苷酸 (孔雀石绿适配体反义链) | IDT | N/A | GGATCCATTCGTTACCTGGCT CTCGCCAGTCGGGATCCTATA GTGAGTCGTATTACAGTTCCAT TATCGCCGTAGTTGGTGTACT |
| 寡核苷酸 (孔雀石绿适配体正义链) | IDT | N/A | TAATACGACTCACTATAGGATC CCGACTGGCGAGAGCCAGGT AACGAATGGATCC |
| 寡核苷酸 (转录因子 A) | IDT | N/A | AGTACACCAACTACGAGTGAG |
| 寡核苷酸 (转录因子 B) | IDT | N/A | TCAGTCACCTATCTGGCGATAA TGGAACTG |
| 带有 3’ 胺基修饰的寡核苷酸 (连接臂) | IDT | N/A | GCTACTCACTCAGATAGGTGAC TGA/3AmMO/ |
| Pierce 强离子交换离心柱 | Fisher Scientific | 90008 | |
| 编码 SNAP T7 RNA 聚合酶和卡那霉素抗性基因的质粒 | Genscript | N/A | 定制基因插入片段 |
| 蛋白纯化柱 (HisPur Ni-NTA 离心柱) | Fisher Scientific | 88226 | |
| rNTP 混合物 | New England Biolabs | N0466S | |
| Roche 小型快速 DNA 离心柱 | Sigma Aldrich | 11814419001 | |
| 吐温 X-100 (Triton X-100) | Sigma Aldrich | T8787-100ML | |
| 超低分子量 DNA Marker | Fisher Scientific | 10597012 | |
| 尿素 | BioShop | URE001.1 |
参考文献
- Cherry, K. M., Qian, L. Scaling up molecular pattern recognition with DNA-based winner-take-all neural networks. Nature. 559 (7714), 370-376 (2018).
- Qian, L., Winfree, E., Bruck, J. Neural network computation with DNA strand displacement cascades. Nature. 4....
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重印与许可
