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类器官来源的上皮单层：一种用于肠道屏障功能研究的临床相关体外模型

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DOI：

10.3791/62074

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2021年7月29日

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1Foundation Hubrecht Organoid Technology (HUB)

本文内容

摘要

本文介绍了由人源类器官衍生的肠上皮单层细胞的制备方法，用于研究肠道屏障功能、通透性及物质转运。由于类器官能够再现原始上皮组织对外界刺激的反应，因此该模型兼具细胞系可扩增性的优势以及原代组织的相关性和复杂性。

摘要

过去，肠道上皮模型系统仅限于永生化细胞系和原代组织。这些模型系统存在固有局限性：前者不能真实反映原始组织的生理特性，而后者来源有限。因此，它们的应用阻碍了基础研究和药物开发研究。基于成体干细胞的类器官（下文简称为类器官）是其所来源的正常或病变上皮组织的微型复制品。类器官可从胃肠道（GI）不同区域高效建立，具有长期扩增能力，并可在体外模拟组织特异性和患者特异性的治疗反应。本文展示了由肠道类器官衍生的上皮单层细胞的建立方法，以及检测上皮屏障完整性、通透性与转运功能、 抗菌蛋白分泌和组织学分析的方法。此外，肠道类器官衍生的单层细胞可富集增殖态干细胞和过渡扩增细胞，以及关键的已分化上皮细胞。因此，该模型系统可被定制用于研究化合物对靶细胞的作用及其作用机制。尽管类器官培养在技术上比细胞系更为复杂，但一旦建立，因其能真实再现体内上皮的复杂性及患者间的异质性，可显著减少药物研发后期的失败风险。

引言

肠上皮在肠道腔内容物与下方组织之间起到物理屏障作用。该屏障主要由单层吸收性肠上皮细胞构成，这些细胞通过紧密连接相互连接，从而在相邻细胞之间形成牢固的细胞间连接。这些细胞构成极化的上皮层，将肠道的顶膜侧（管腔侧）与基底外侧分开，同时调控消化后营养物质和代谢物的细胞旁转运。除肠上皮细胞外，其他重要的上皮细胞如杯状细胞、潘氏细胞和肠内分泌细胞也分别通过分泌黏液、抗菌肽和激素参与维持肠道稳态。肠上皮持续由位于肠隐窝底部的富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体5阳性（LGR5+）干细胞分裂更新，这些干细胞产生过渡扩增（TA）细胞，向上迁移并分化为其他细胞类型1。遗传和环境因素（如食物过敏原、药物化合物以及微生物病原体的暴露）可破坏肠上皮稳态，导致肠道屏障功能受损。这些情况可引发多种肠道疾病，包括炎症性肠病（IBD）、乳糜泻和药物诱导的胃肠道毒性2。

使用多种体外平台系统（如膜插件、器官芯片系统、尤辛室和肠环）可开展肠道上皮相关研究。这些平台适用于建立具有顶膜和基底膜双侧通路的极化上皮单层，可采用永生化细胞系或原代组织作为模型。尽管永生化细胞系（如结肠直肠腺癌细胞系 Caco-2、T84 和 HT-29）在一定程度上能够分化为极化的肠上皮细胞或黏液分泌细胞，但其并不能真实代表体内情况 上皮组织缺失多种细胞类型，且多种受体和转运蛋白异常表达3此外，由于细胞系来源于单一供体，无法代表患者间的异质性，且存在复杂性降低和生理相关性不足的问题。尽管在Ussing室和肠环实验中使用原代组织更能反映体内情况 由于其来源有限、存活时间短且无法扩增，因此不适合作为高通量（HT）研究的实验材料。

类器官是由不同器官（如肠道、肾脏、肝脏、胰腺和肺）建立的体外上皮细胞培养物。研究表明，类器官具有长期稳定的扩增能力以及遗传和表型稳定性，因此可作为原始器官上皮组织的代表性生物学微缩模型，并能真实响应外界刺激4,5,6,7,8,9。类器官可高效地从切除或活检获得的正常、病变、炎症或癌变组织中建立，能够反映患者个体间的异质性反应10,11,12,13,14,15,16。本文展示了如何从类器官培养物中建立肠道上皮单层细胞模型。该单层模型已成功由小肠、结肠及直肠类器官培养物建立。此模型为研究药物在上皮细胞中的转运与通透性及其对上皮的毒理学效应提供了机会。此外，该模型还可用于与免疫细胞和细菌共培养，以研究它们与肠道上皮之间的相互作用17,18,19。进一步地，该模型可用于在患者特异性基础上研究对治疗的响应，并启动针对下一代以上皮屏障为靶点的治疗药物的筛选工作。这一方法有望拓展至临床应用，为实现个体化治疗铺平道路。

尽管本方案中的上皮单层细胞是由人正常肠道类器官制备的，但该方案也可适用于其他类器官模型，并可进行优化。上皮类器官单层细胞在含有Wnt的肠道类器官扩增培养基中培养，以支持干细胞增殖，并模拟肠道隐窝的细胞组成。通过调控Wnt、Notch和表皮生长因子（EGF）信号通路，可使肠道类器官富集为不同类型的肠道上皮细胞，例如肠吸收细胞、潘氏细胞、杯状细胞和肠内分泌细胞。本研究中，在扩增培养基中建立单层细胞后，进一步诱导其向更成熟的肠道上皮细胞分化，如先前研究所述20,21,22,23,24,25。在筛选实验中，可根据目标化合物的作用机制、靶细胞类型及实验条件，将单层细胞诱导为特定的细胞组成，以便通过相关的功能性指标检测该化合物的作用效果。

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方案

1. 培养用试剂的配制

注意：所有步骤均须在生物安全柜内进行，并遵循细胞培养操作的标准规范。使用生物安全柜前，需先用紫外线照射10分钟。每次使用前后，均应用浸有70%乙醇的纸巾清洁生物安全柜表面。为促进细胞外基质（ECM）形成三维液滴，提前将96孔、24孔和6孔培养板预热，并置于37 °C培养箱中备用。

  1. 基础培养基的制备
    1. 在500 mL的Advanced Dulbecco's Modified Eagle Medium与Ham's Nutrient Mixture F-12（Ad-DF）培养基瓶中，加入5 mL 200 mM谷氨酰胺、5 mL 1 M 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）以及5 mL青霉素/链霉素（pen/strep）溶液（10,000 U/mL或10,000 µg/mL），配制基础培养基（BM）。该培养基可在4 °C冰箱中保存至少4周。
  2. Wnt来源
    1. 按照先前描述的方法制备Wnt3a条件培养基（Wnt3aCM）26。
      注：最近已开发出一种支持人肠道类器官扩增的下一代替代性Wnt（NGS-Wnt）27。
  3. 肠道类器官基础培养基的制备
    注：所有生长因子和试剂均应按照制造商的建议使用。建议分装成小份并避免反复冻融；功能性生长因子对成功培养类器官至关重要。
    1. 通过在BM中添加1 µM A83-01、2.5 mM N-乙酰半胱氨酸、2x B27补充剂、100 ng/mL人表皮生长因子（hEGF）、10 nM胃泌素、200 ng/mL hNoggin以及100 µg/mL用于原代细胞的抗菌配方（见材料表），配制浓缩的2倍肠道类器官基础培养基（2x IBM）。
    2. 将2x IBM分装后于-20 °C冷冻，可保存长达4个月。使用时可在4 °C过夜解冻，或在室温（RT）下数小时解冻。
    3. 配制肠道类器官扩增培养基（IEM）时，在2x IBM中加入50% Wnt3aCM或50% BM加0.5 nM NGS-Wnt、250 ng/mL人R-spondin-3（hRspo3）、10 mM烟酰胺以及10 µM SB202190。
  4. 肠道类器官分化培养基的制备
    1. 通过在2x IBM中加入50% BM、250 ng/mL hRspo3以及1.5 µM Wnt通路抑制剂（IWP-2），配制肠上皮细胞分化培养基（eDM）。eDM可在4 °C保存最多10天。
    2. 通过在2x IBM中加入40% BM和10% Wnt3aCM，或50% BM加0.1 nM NGS-Wnt、250 ng/mL hRspo3、10 µM DAPT以及100 nM PD0325901，配制联合分化培养基（cDM）。cDM可在4 °C保存最多10天。
  5. 细胞外基质（ECM）的操作
    注：请按照制造商的建议制备细胞外基质（ECM）（见材料表）。
    1. 将ECM在冰上过夜解冻；使用预冷至-20 °C的5 mL移液器，将ECM从原瓶转移至15 mL锥形管中。ECM分装后仅可于-20 °C再冷冻一次。解冻后，ECM可在4 °C冰箱中保存最多7天。使用前需在冰上孵育至少30分钟。
      ​注：使用前应充分混匀ECM，并确保其保持低温状态，以便于隐窝或类器官的包埋。

2. 类器官培养

  1. 从冻存类器官建立培养
    注意：让基础培养基（BM）升至室温（RT），并在开始解冻一支含有冻存类器官的冻存管前，提前准备好一管12 mL、预热至37 °C的BM。
    1. 将类器官冻存管在37 °C水浴中轻轻振荡，快速解冻，直至仅剩少量冰晶。立即向冻存管中逐滴加入500 µL预热的BM，并上下吹打数次，以稀释冻存液并轻柔混匀内容物。
    2. 使用P1000移液器将类器官转移至15 mL锥形管中，同时在轻柔混匀管底的情况下逐滴加入另外1 mL预热的BM。上下吹打数次，以稀释冻存液并轻柔混匀内容物。
    3. 向含有类器官的15 mL锥形管中逐滴加入最多12 mL预热的BM，并使用10 mL无菌移液管上下吹打，轻柔重悬类器官。
    4. 将类器官悬液在85 × g、8 °C条件下离心5分钟。小心弃去上清液，避免扰动沉淀，将类器官重悬于体积分数为30%的IEM中，IEM中需添加10 µM Y27632或其他Rho相关卷曲螺旋形成蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂（ROCK抑制剂）。将管子置于冰上。
    5. 向含有类器官的15 mL锥形管中加入体积分数为70%的ECM。保持锥形管在冰上，混匀类器官悬液，并接种5 µL悬液以检查密度（图1A）。若密度合适，则继续铺板；若密度过高，则按30–70%体积比加入更多IEM/ECM溶液。
    6. 在预热的24孔板的每个孔中，使用移液器分别加入5个10 µL的液滴，共50 µL类器官悬液（图1B）。将培养板倒置，置于生物安全柜中静置5分钟。随后将倒置的培养板转移至37 °C培养箱中，继续孵育30分钟。
    7. 向每孔中加入500 µL含10 µM ROCK抑制剂的IEM，并将培养板转移至培养箱中。定期观察一个液滴以监测生长情况，并每2–3天更换一次IEM：吸除旧培养基，加入500 µL新鲜IEM。
    8. 当类器官从解冻中充分恢复并生长至适合传代的大小时，进行传代操作（图1C），具体方法见第2.2节。
  2. 肠道类器官传代
    ​注意：使用前将ECM在冰上预冷至少30分钟，并将IEM在室温下放置至少1小时。
    1. 利用一个培养孔中的培养基，使用1250 µL低吸附滤芯吸头将类器官球体打散，并将孔内内容物转移至已标记的15 mL锥形管中。用1 mL BM清洗该孔，并将洗液转移至同一15 mL锥形管中。
    2. 对所有其他孔重复步骤2.2.1和2.2.2（最多可将半块板或600 µL的ECM液滴清洗后加入一个15 mL锥形管中）。
    3. 加入BM至总体积达12 mL，并使用10 mL移液管上下吹打10次。在8 °C、85 × g条件下离心5分钟。
    4. 在去除BM前，先在显微镜下检查，确认所有类器官是否已沉淀至15 mL锥形管底部（图1D）。若类器官沉淀上方无ECM覆盖，或ECM层干净，或仅含有少量碎片、单细胞或极少数类器官（与沉淀中的类器官相比），则吸除上清液，并使用P200移液器非常小心地吸出覆盖在类器官沉淀上的ECM。
      注意：由于离心力较低，类器官可能被困在ECM中而无法形成紧密沉淀。若ECM中含有类器官，请将管子在8 °C、450 × g条件下再次离心5分钟，并按步骤2.2.4所述小心去除上清液。若有多个15 mL锥形管，可在完成步骤2.2.4后合并。
    5. 向每个沉淀（体积为50–200 µL，取决于类器官培养状态和密度）中加入1 mL BM，并轻柔重悬。上下吹打至少5次以剪切类器官，避免产生泡沫。在显微镜下检查类器官是否已被破坏（图2A）。若类器官已破碎，则进入步骤2.2.7；若未破碎，则再吹打5次。此次操作中，用移液器吸头接触塑料管壁，施加更大的机械力以破坏类器官。
      ​注意：囊状（图1C）和出芽状（图1E）类器官可通过安装在低吸附1250 µL滤芯吸头上的200 µL或10 µL塑料移液吸头进行机械剪切（图1F），具体选择取决于破坏类器官所需的体积。当处理含有类器官的ECM体积超过200 µL时（如6孔板的一个孔或24孔板的四个孔），建议使用细口玻璃移液管（图1F）。
    6. 再次在显微镜下检查类器官是否已被破坏。若已破坏，则进行下一步；若未破坏，则继续上下吹打最多20次，并定期在显微镜下观察。若类器官仍未被破坏，向悬液中加入体积分数为25%的细胞解离试剂1（见材料表），在37 °C水浴中孵育2分钟，然后上下吹打最多20次，并定期在显微镜下观察，确保类器官未被消化成单个细胞。
    7. 向15 mL锥形管中加入最多12 mL BM，通过上下吹打清洗类器官沉淀。在8 °C、85 × g条件下离心5分钟。弃去上清液，并通过向类器官沉淀中加入IEM和ECM，将最终浓度调整为体积分数70%的ECM。
    8. 使用传代所收集的IEM/ECM体积的两倍量开始重悬类器官沉淀，并接种5 µL悬液以检查密度。若密度合适，则继续铺板（图2B）；若密度过高，则加入更多IEM/ECM溶液。向预热的6孔板每孔中加入200 µL悬液，每孔形成多个10 µL的独立液滴。
    9. 将培养板倒置，置于生物安全柜中静置5分钟。随后将倒置的培养板转移至37 °C培养箱中，继续孵育30分钟。向每孔中加入2 mL含10 µM ROCK抑制剂的IEM，并将培养板转移至培养箱中。
    10. 定期观察一个液滴以监测生长情况，并每2–3天更换一次IEM：吸除旧培养基，加入2 mL新鲜IEM。
  3. 为上皮单层培养准备而进行的肠道类器官传代
    1. 在为单层培养收获细胞前3天，按照第2.2节所述的相同传代流程进行类器官传代 ，仅有一个例外：在步骤2.2.7中，将类器官重悬于初始IEM/ECM体积的1–1.5倍中，以便在收获用于单层培养时获得更高的密度和扩增潜力（图3A）。

3. 上皮单层细胞的制备

  1. 在多种可选的24孔和96孔膜插件培养板上培养上皮单层细胞表1）。两种规格均使用高通量系统（HTS）膜插件，因其包含带膜插件的集成托盘和接收板。对于24孔板规格，也可使用带有可单独拆卸膜插件的板。
    注意：不同类型的膜（聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）或聚碳酸酯）和孔径（0.4-8.0 µm）可根据实验需求选择使用。当使用带有PET膜的插入式培养小室时，单层细胞仅能通过明场进行成像。若研究荧光标记底物的动态转运或通透性，可考虑使用避光膜，以防止荧光信号从顶端腔室泄漏至基底外侧腔室。本实验方案采用24孔膜插入式培养小室；针对96孔膜插入式培养小室的相应调整方法见第5节。根据类器官的密度、形态和大小（图3A6孔板中的6个孔（如第2.3节所述接种）足以接种一整块24孔板的膜插件。
  2. 用细胞外基质包被膜插件
    注意：如果对细胞数量是否充足存在疑虑，可在计数细胞后进行插入物包被。这是为了防止不必要的包被以及昂贵的膜插入物的浪费。
    1. 将膜插件放入生物安全柜中的支撑板内。在冰浴条件下，用 DPBS（含 Ca）将 ECM 稀释 40 倍2+ 和 Mg2+，和移液 150 µL 将稀释后的ECM加入每个插入物的顶室中。将培养板置于 37 °C 至少 1 h。
  3. 细胞接种前的准备
    1. 将细胞解离试剂 2 的分装样品在水浴中预热（37 °C）。为6孔板的每个孔准备2 mL试剂。
    2. 将含有类器官的培养板（按第2.3节制备）从培养箱转移至生物安全柜中。按照步骤2.2.1–2.2.4所述处理类器官。切勿将多个管中的样品合并至同一管中。
    3. 将最多来自6孔板3个孔的类器官加入至离心管中，用不含Ca²⁺的DPBS补至12 mL2+ 和 Mg2+），使用10 mL移液管上下吹打10次。在85 × g 5 分钟 8 °C，吸走上清液，注意不要扰动类器官沉淀。
    4. 向用作起始材料的6孔板每孔加入2 mL预热的细胞解离试剂2，重悬细胞。将培养板斜置或水平放置，在水浴中37 °C孵育5 min 37 °C，以防止类器官沉降至管底。
    5. 使用5 mL无菌塑料移液管或P1000移液器，上下吹打10次，具体选择取决于细胞解离试剂的总体积。在显微镜下观察类器官悬液，检查是否已形成由单细胞和部分由2-4个细胞组成的细胞团混合的悬液。图3B）。如有需要，可重复步骤 3.3.4–3.3.5 继续消化（不要增加细胞解离试剂的体积），直至混合物外观与 图3B.
      ​注意：避免将类器官完全消化成单细胞。需保留一些小的细胞团（即由2-4个细胞组成的细胞群）。
    6. 通过加入最多 12 mL 的终止液来停止细胞解离 骨髓，包括 10 µM ROCK抑制剂 加入细胞悬液中。在450 × g下离心 × g 5 分钟 8 °C，吸除上清液，注意不要扰动细胞沉淀。当处理多个15 mL锥形管中的相同类器官培养物时，将细胞沉淀合并，并重悬于12 mL基质胶（BM）中。
    7. 将细胞悬液通过滤器过滤 40 µm 用BM预润湿的滤网过滤，并将滤过液收集至50 mL锥形管中。用10 mL BM洗涤滤网，将滤过液收集至同一50 mL锥形管中。
    8. 将过滤后的细胞悬液转移至两个新的15 mL圆锥形离心管中。在450 × g下离心 × g 5 分钟 8 °C，吸除上清液，注意不要扰动细胞沉淀。将细胞重悬于4 mL添加了补充剂的IEM中 10 µM 每块用作起始材料的全培养板加入ROCK抑制剂。
    9. 将少量细胞悬液与台盼蓝按1:1比例混合用于计数。计数未被染成蓝色的活细胞（图3C），并计算活细胞总数。对于小的细胞团块，应计数其中的每一个单个细胞。
    10. 制备含有3个细胞的细胞悬液 × 106 每毫升添加补充剂的IEM中的活细胞数 10 µM ROCK抑制剂
  4. 在聚酯膜插件上接种细胞
    1. 小心吸取 ECM 包被插件中的 DPBS（步骤 3.2.1），同时保持培养板水平放置。用移液器 800 µL 在每个基底外侧区室中加入含ROCK抑制剂的IEM。用移液器 150 µL 将步骤 3.3.10 中制备的细胞悬液以滴加方式加入至顶端室中经 ECM 包被的膜上。每块培养板务必至少设置一个 "空白" 仅含骨髓的孔
    2. 待细胞沉降至膜上后，按照第4.1节所述方法测定跨上皮电阻（TEER），并使用显微镜观察膜插件。将培养板置于培养箱中 37 °C 和5% CO2每天测量TEER，并定期获取图像以监测单层细胞的形成（图 4A- D).
  5. 更新单层膜
    ​注意：每2-3天更换一次培养基，更换时需遵循以下顺序，以维持细胞上方的正向静水压，防止细胞从膜上脱落。更换培养基时，应确保在吸除旧培养基后可见的单层细胞未被移液器尖端损伤。
    1. 移去含有膜插件的孔板基底外侧室中的培养基，然后小心吸去膜插件顶端室中的培养基。
    2. 添加 150 µL 向每个顶腔室逐滴加入新鲜的 IEM，然后添加 800 µL 向每个基底外侧区室加入新鲜的 IEM。
  6. 富集单层培养中目标肠道上皮细胞类型
    1. 让单层细胞在 IEM 中生长至汇合，对应的 TEER 值约为 100 Ω·cm² （如步骤 4.1.1.4 中计算所得）。在显微镜下观察，以确定单层细胞是否已完全形成（图 4D）以及无孔洞（如所见） 图4B，C).
    2. 小心地从膜插件的基底外侧和顶端隔室中移除IEM，并替换为第1.4节中制备的eDM或cDM。在特定分化培养基中继续培养单层细胞3-4天，以获得富集了目标特定细胞类型的类器官细胞。每2-3天更换一次培养基，具体操作如第3.4节所述。
    3. 每日测量TEER，并根据需要定期采集图像（图 5A- C).
      注意：表明类器官培养中已形成完整且富集的单层细胞的TEER值因培养体系而异；通常TEER值可上升至600，并可进一步升高至1000 Ω·cm2 （按步骤4.1.1.4计算）在分化培养基中培养3天后达到稳定，并可维持3-5天。

4. 上皮单层细胞检测的读数结果

  1. 跨上皮电阻（TEER）的测量
    ​注意：跨上皮电阻（TEER）测量被广泛接受为一种用于分析生理屏障生物模型（如上皮单层）中紧密连接动态变化和屏障功能完整性的方法。28, 29分化后由于紧密连接处细胞间相互作用增强，可使用手动TEER仪测量TEER的升高 或自动TEER测量机器人。
    1. 使用手动TEER测量仪测量TEER
      1. 用70%乙醇清洁电极，并在生物安全柜内使其自然晾干。将电极放入含有BM的离心管中。将电极连接至手动TEER测量仪。打开 功能 切换至测量模式 欧姆（Ohms）Ω). 转动 功率 打开。
      2. 将短电极置于插入物的顶端区室，长电极则置于基底外侧区室（图6A）。避免接触单层细胞。
      3. 测量空白孔的电阻（R空白），然后测量剩余的样本（R样本) 的方式操作。在不同条件的样品之间，用 BM 清洗电极。先用去离子水清洗电极，再用 70% 乙醇清洗，然后使其自然风干。
      4. 计算TEER（Ω·cm2): [R样本 (Ω) - R空白 (Ω)] × 膜面积（cm2) (表1 和 图6B).
    2. 使用自动TEER测量机器人测量TEER材料表)
      1. 使用高通量筛选系统对含有膜插件的96孔和24孔HTS板进行自动TEER测量时，应针对两种类型的膜插件（24孔和96孔HTS膜插件）分别使用不同的电极。采用自动TEER测量机器人进行TEER测定时，需遵循制造商提供的操作说明。
  2. 上皮屏障完整性和通透性的测定
    注意：本方案通过检测从顶端到基底外侧腔室的 Lucifer Yellow 渗透性来评估单层细胞的完整性。本节描述了孵育 1 小时后对基底外侧腔室中荧光信号的测定，以评估单层细胞的通透性，从而反映屏障完整性。该检测为终点法测定，在测试化合物对屏障完整性影响时尤为有用。
    1. 将 Lucifer Yellow 置于冰上解冻，并使 BM 平衡至室温。针对一个 24 孔板的膜插件，配制 5 mL 工作液 60 µM BM 中的 Lucifer Yellow
      ​注意：Lucifer Yellow 对光敏感。请在避光的 1.5 mL 无菌离心管中配制稀释液，并在生物安全柜关闭照明的条件下进行所有操作步骤。
    2. 小心地从膜插件的基底外侧和顶侧区室中移除培养基，具体操作如步骤 3.5.1 所述。如有需要，可用移液器吸头刮擦一个未经处理的单层细胞，作为屏障受损后 Lucifer Yellow 渗漏的阳性对照。
    3. 添加 150 µL 骨髓（BM）的 60 µM 每孔顶端加入 Lucifer Yellow， 800 µL 向每个基底外侧室加入不含 Lucifer Yellow 的 BM。将培养板置于摇床上 37 °C，50 转/分钟，60 分钟。
    4. 同时，用BM缓冲液配制荧光素黄的标准曲线，起始溶液为步骤4.2.1中配制的工作液。每步按1:3稀释，直至浓度达到3 nM。设阴性对照（仅含BM缓冲液）。
    5. 转移 100 µL 每个标准品设置三个复孔，加入96孔透明板中。孵育60分钟后，移除膜插件并转移 100 µL 从 将每个基底外侧孔（步骤4.2.3）设三个复孔转移至96孔透明板中。使用酶标仪在激发波长430 nm、发射波长530 nm条件下测定荧光值。
    6. 在扣除阴性对照值（仅BM）后，利用标准曲线数值计算基底外侧室中 Lucifer Yellow 的浓度（最终接收端浓度（µM)).
    7. 计算表观渗透系数（P应用程序）根据以下公式（图6C):
      figure-protocol-1
    8. 对于含有膜插件的24孔板，使用以下公式：
      figure-protocol-2
  3. 固定单层细胞及制备石蜡包埋块用于组织学分析
    注意：上皮单层细胞可用于组织学染色，以评估其细胞组成、极性以及特定蛋白（如连接蛋白、增殖或分化标志物）的表达情况。本节介绍用于组织学染色的石蜡包埋制块方法。
    1. 按照步骤 3.5.1 中所述，小心地从膜插件的基底外侧和顶端隔室中移除培养基。
    2. 用添加的方式洗涤单层细胞 150 µL DPBS（不含Ca）2+ 和 Mg2+) 加入每个顶室 800 µL 向每个基底外侧室加入等量试剂。再次小心吸出DPBS，先从基底外侧室，再从顶端室吸出。
      ​注意：从这一步开始，基底外侧室将保持为空。
    3. 在通风橱中，加入 150 µL 向每个顶端室加入4%多聚甲醛，在室温下孵育30分钟。
      ​注意：从这一步开始，所有本节操作均须在通风橱内进行，因为多聚甲醛具有毒性。
    4. 小心吸去膜插件顶端腔室中的固定液，并将其作为含卤素液体废物处理。
      注意：从本步骤开始，所有液体废液均须作为卤素液体废物处理。
    5. 用添加的方式洗涤单层细胞 200 µL DPBS（不含Ca）2+ 和 Mg2+向每个顶室加入 DPBS，并小心吸出。重复此步骤一次。
    6. 添加 200 µL 向每个顶室加入25%乙醇（EtOH），室温孵育15分钟。15分钟后，小心吸除膜插件顶室中的25% EtOH。随后依次用50%乙醇溶液和70%乙醇溶液重复操作。
    7. 添加 200 µL 向每个顶端室加入70% EtOH，并用封口膜包裹培养板。于 4 °C 直至进一步使用。
    8. 小心吸除70% EtOH，并使用手术刀小心地从插件上切割单层膜。从插件的基底外侧沿边缘进行切割。
    9. 按照标准流程制备石蜡包埋块。
      1. 当石蜡仍处于温热状态时，用镊子将单层膜从石蜡上取下，并置于预冷的表面上。
      2. 注意不要损坏单层细胞。使用单边刀片将单层细胞切成两半。
      3. 当包埋盒底部的石蜡开始凝固时，使用预热的镊子将两个单层部分并排置于石蜡中，直边朝下，保持垂直方向，以确保单层结构在切片中呈垂直状态。
    10. 当石蜡包埋块准备好后，使用切片机对包埋块进行切片，并制备载玻片 4 µm 按照标准程序制备厚切片。确保单层细胞在切面中呈垂直方向。
    11. 按照先前所述方法进行组织学染色7,9. 使用苏木精和伊红（H&E)、Ki67、黏蛋白-2（MUC2）和阿尔新蓝染色，分别用于显示一般形态、增殖细胞、黏液产生和杯状细胞（图6E).
      注意：也可使用其他分化标志物，例如用于潘氏细胞的溶菌酶。该标志物未在本文中展示 图6E 因为潘氏细胞存在于小肠上皮而非结肠上皮。
  4. 培养基上清中分泌蛋白的测定
    1. 测量回肠单层细胞顶部分泌物中的溶菌酶水平（参见 图6D) 使用下述列表中的试剂盒 材料表如需要，可检测不同细胞因子及其他目标蛋白的水平。
  5. 基因表达分析
    1. 使用定量逆转录-聚合酶链式反应（qRT-PCR）量化分化培养基对上皮细胞标志物基因表达的影响。
      1. 裂解单层细胞 350 µL 加入RNA裂解缓冲液，随后根据制造商说明书进行RNA提取。cDNA合成和qPCR操作步骤同前文所述。7,9，使用下表所列的cDNA合成试剂盒、预混液和寡核苷酸 材料表.

5. 扩大至含有膜插件的96孔板

注意：使用含有膜插件的高通量筛选96孔板制备上皮单层细胞，以用于高通量药物筛选或多条件培养基实验。

  1. 在96孔板中制备单层细胞时的调整
    1. 按照本方案中针对含膜插件的24孔板所述的所有步骤操作，将体积和细胞数量调整为表1中列出的数值。对于在含膜插件的96孔板上制备单层细胞，操作步骤同第3节所述，但需注意以下差异。
      1. 以图3A所示类器官密度的6孔培养板约9个孔的细胞量，可接种一整块含膜插件的96孔板。在步骤3.2.1中，用67 µL以DPBS（含Ca2+和Mg2+）稀释40倍的ECM对膜进行预包被。
      2. 在第3.5节中，首先将整块膜插件板转移至另一块96孔板中，以便对顶腔和基底外侧腔室同时进行培养基更换。

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结果

图1A 显示了从冻存管中解冻后肠类器官的代表性明场图像。以高密度解冻类器官对于确保最佳复苏至关重要。将类器官以约10 µL的细胞外基质（ECM）液滴形式接种于24孔或6孔板中（图1B）。大多数正常的肠类器官具有囊状形态。在完成解冻后的恢复过程中，类器官会生长至更大尺寸，并在3–7天后根据具体类器官培养条件准备进行传代（图1C）。收获类器官并洗去ECM后（图1D），可通过机械剪切将类器官破碎为较小片段。根据类器官的形态（囊状 图1C，出芽状 图1E），可使用塑料或玻璃移液管进行破碎处理（图1F）。类器官在悬浮液中被破碎（图2A），此过程应定期在显微镜下监测。需注意避免...

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讨论

本方案描述了肠道类器官的一般操作与维持方法，以及由此类类器官衍生的上皮单层细胞的制备及其可能的应用。迄今为止，已成功从十二指肠、回肠以及来自正常组织和既往及活动性炎症肠道组织的不同结肠区域的类器官中制备出单层细胞（未发表数据）。患者来源的类器官单层细胞的应用，有助于以疾病特异性和患者特异性的方式研究屏障功能，以及研究患者对多种药物治疗的个体化反应。尽管细胞系能够形成包含肠吸收细胞和杯状样细胞的分化且具有极性的单层细胞，但这些细胞系中许多不同的酶和转运蛋白表达异常，导致其复杂性和生理相关性降低3,30。类器官培养在技术上比细胞培养更具挑战性且更耗时；然而，类器官更能代表体内 实际情况，而细胞系在复杂实验体系中反复表现出无法准确模拟组织反应的局限性。

尽管基于原代组织的模型能够较好地代表体内 situation，但其需要使用实验动物或获取人体组织材料，而这些资源存在来源有限和伦理限制的问题。此外，原代组织无法扩增或扩增能力有限，且在...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本工作由荷兰生命科学与健康领域（LSH）的 Topsector Life Sciences & Health - Topconsortium voor Kennis en Innovatie Health~Holland（LSH-TKI）公私合作伙伴关系（PPP）资助，项目编号 LSHM16021“类器官作为毒理学建模的新工具”授予 Hubrecht Organoid Technology（HUB），以及 HUB 对疾病建模与毒理学部门的内部资助。我们感谢萨宾·米登多普（Sabine Middendorp）实验室（乌得勒支大学医学中心威尔赫米娜儿童医院儿科胃肠病学部）和雨果·R·德容（Hugo R. de Jonge）与马塞尔·J·C·比弗尔茨（Marcel J.C. Bijvelds）实验室（鹿特丹伊拉斯姆斯医学中心胃肠病学与肝病学部）提供初始技术支持，以在膜插件上建立单层培养体系。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
100% 乙醇Fisher Emergo10644795
1250、300 和 20 µL 低吸附滤芯吸头Greiner bio-one732-1432 / 732-1434 / 732-2383
15 mL 锥形管Greiner bio-one188271
24 孔细胞培养板Greiner bio-one662160
24 孔 HTS Fluoroblok Transwell 板（避光）Corning351156
24 孔 HTS Transwell 板（表 1）Corning3378
带 Transwell 插件的 24 孔板Corning3470
40 µm 细胞筛PluriSelect43-50040-01
50 mL 锥形管Greiner bio-one227261
6 孔细胞培养板Greiner bio-one657160
96 孔黑色板透明底Greiner bio-one655090
96 孔快速热循环板Life Technologies Europe BV4346907
96 孔 HTS Fluoroblok Transwell 板Corning351162
96 孔 HTS Transwell 板（表 1）Corning7369
96 孔透明培养板Greiner bio-one655180
A83-01Bio-Techne Ltd2939
Accutase 细胞解离试剂Life Technologies Europe BVA11105-01细胞解离试剂 2
高级 DMEM/F-12Life Technologies Europe BV12634028
B27 添加剂Life Technologies Europe BV17504001
细胞培养显微镜（光学显微镜）Leica
CellTiter-GloPromegaG9683
离心机Eppendorf
CO2 培养箱PHCBI
DAPTSigma-AldrichD5942
DEPC 处理的 H2OLife Technologies Europe BV750024
含 Ca2+ 和 Mg2+ 的杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）Life Technologies Europe BV14040091
DPBS 粉剂，无钙，无镁Life Technologies Europe BV21600069
EnzChek 溶菌酶检测试剂盒Life Technologies Europe BVE22013
EVOM2 电表配 STX 电极WTI
胃泌素Bio-Techne Ltd3006
玻璃移液管Volac
GlutaMAXLife Technologies Europe BV35050038
hEGFPeprotechAF-100-15
HEPESLife Technologies Europe BV15630056
人 NogginPeprotech120-10C
人 Rspo3Bio-Techne Ltd3500-RS/CF
IWP-2Miltenyi Biotec130-105-335
Ki67 一抗SanbioBSH-7302-100
Ki67 二抗AgilentK400111-2
Kova International Glasstic 计数板（带计数网格）Fisher Emergo10298483
层流罩Thermo scientific
Lucifer Yellow CH 二锂盐Sigma-AldrichL0259
Matrigel，生长因子减少型（GFR）Corning356231细胞外基质（ECM）
MicroAmp 快速 8 管条，0.1 mLLife Technologies Europe BV4358293
MicroAmp 光学 8 管盖条Life Technologies Europe BV4323032
微量离心管Eppendorf0030 120 086
移液器（1000、200 和 20 µL）Gilson
切片机Leica
MUC2 一抗Santa Cruz Biotechnologysc-15334
MUC2 二抗VWRVWRKS/DPVR-HRP
多通道移液器（200 µL）Gilson
N-乙酰半胱氨酸Sigma-AldrichA9165
NGS WntU-Protein ExpressN001-0.5mg
烟酰胺Sigma-AldrichN0636
寡核苷酸 ALPI1/正向定制GGAGTTATCCTGCTCCCCAC
寡核苷酸 ALPI1/反向定制CTAGGAGGTGAAGGTCCAACG
寡核苷酸 LGR5/正向定制ACACGTACCCACAGAAGCTC
寡核苷酸 LGR5/反向定制GGAATGCAGGCCACTGAAAC
寡核苷酸 MUC2/正向定制AGGATCTGAAGAAGTGTGTCACTG
寡核苷酸 MUC2/反向定制TAATGGAACAGATGTTGAAGTGCT
寡核苷酸 TBP/正向定制ACGCCGAATATAATCCCAAGCG
寡核苷酸 TBP/反向定制AAATCAGTGCCGTGGTTCGTG
光学粘合盖片Life Technologies Europe BV4311971
PD0325901Stemcell Technologies72184
青霉素/链霉素Life Technologies Europe BV15140122
板式摇床Panasonic
PowerUp SYBR Green Master MixFisher EmergoA25776
PrimocinInvivoGenANT-PM-2原代细胞用抗菌制剂
Qubit RNA HS 检测试剂盒Life Technologies Europe BVQ32852
多通道移液器用试剂储液槽Sigma-AldrichCLS4870
REMS AutoSampler 配 24 探针或 96C 探针WTI
Richard-Allan Scientific Alcian Blue/PAS 特殊染色试剂盒Thermo scientific87023
无 RNase DNase 试剂盒Qiagen79254
RNeasy Mini 试剂盒Qiagen74106
SB202190Sigma-AldrichS7076
血清移液管Greiner bio-one606180 / 607180 / 760180
血清移液器（Pipet-Aid）Drummond
单刃剃刀片GEM Scientific
RT-PCR 用 Superscript 第一链合成系统Life Technologies Europe BV11904018
Tecan Spark 10M 酶标仪Tecan
台盼蓝溶液，0.4%Life Technologies Europe BV15250-061
TrypLE Express 酶（1x）Life Technologies Europe BV12605-010细胞解离试剂 1
水浴锅Grant
Y27632（ROCK 抑制剂）AbMoleM1817

参考文献

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