一种使用多柱板适配器的经济且通用的高通量蛋白质纯化系统

摘要

多列柱适配器可将层析柱与多孔收集板连接，用于并行亲和或离子交换纯化，提供一种经济高效的高通量蛋白质纯化方法。该方法可在重力或真空条件下使用，通过价格适中的仪器即可获得毫克级蛋白质。

摘要

蛋白质纯化对于研究蛋白质的结构与功能至关重要，通常需结合生物物理技术使用。它也是开发新型治疗手段的关键环节。功能蛋白质组学的发展时代正推动着对高通量蛋白质纯化技术及改进方法的需求。有研究假设，多柱板适配器（MCPA）能够将多种不同树脂的层析柱与多孔板连接，实现并行纯化。该方法提供了一种经济且灵活的蛋白质纯化方式，可在重力或真空条件下使用，其速度可与自动化系统相媲美。MCPA可通过一种经济高效且节省时间的方法回收毫克级蛋白产量，适用于后续的表征与分析。MCPA已成功应用于SH3结构域的高通量亲和纯化。此外，通过MCPA实现离子交换层析，在Ni-NTA亲和层析后进一步纯化蛋白质，表明该系统可适配于其他类型的纯化方法。由于其采用多柱设计，可在同一次纯化过程中对各个参数进行独立定制，这是当前基于板式的方法无法实现的。

引言

为了对蛋白质进行表征和分析，尤其是对于核磁共振（NMR）等生物物理方法而言，获得毫克级纯化蛋白质的蛋白质纯化技术至关重要。蛋白质纯化在其他研究领域也处于核心地位，例如药物发现过程和蛋白质-蛋白质相互作用研究；然而，获得足量高纯度蛋白质常常成为这些技术的瓶颈^1,2,3。蛋白质纯化的主要方法是色谱法，该方法包含多种基于蛋白质及其标签各自特性的分离技术。在亲和色谱中，目标蛋白质携带一个额外的蛋白质或肽序列作为标签，该标签可特异性结合色谱树脂上的特定基质⁴。最常用的亲和色谱方法是利用带组氨酸标签（His-tag）的蛋白质进行的固定化金属离子亲和色谱（IMAC），而另一种广泛应用的方法是根据蛋白质电荷差异进行分离的离子交换色谱。为了获得最高纯度，通常联合使用亲和色谱与离子交换色谱，但这一过程通常需要昂贵的高通量实验设备。

功能蛋白质组学的不断发展推动了对高通量蛋白质纯化技术的需求，其目标不再是针对特定分析纯化单一蛋白质，而是同时纯化大量蛋白质以进行综合分析和全基因组范围的研究⁵。固定化金属亲和层析（IMAC）是目前最广泛使用的高通量蛋白质纯化方法之一^6,7，但其自动化系统价格昂贵，小型实验室难以负担⁸。目前已有的一些成本较低的基于微孔板的替代方案，利用了实验室常见的设备（如真空装置）。尽管这些方法在提高纯化速度方面取得了一定成效，但仅能在较小规模上实现高通量纯化，获得的蛋白质产量仅在微克级别。这些局限性意味着预装填的96孔滤板（例如原GE Healthcare，现属Cytiva公司生产的产品）无法直接用于后续的生物物理技术分析⁹。重力层析法是成本最低的纯化方法；然而，在同时处理多种蛋白质时，搭建多个层析柱操作不便，且容易引入误差。

已开发出一种多柱板适配器（MCPA），并已证实可成功且便捷地同时运行多个亲和层析柱，用于纯化带His标签的酵母SH3结构域¹⁰。MCPA提供了一种经济高效的高通量纯化方法，无需依赖昂贵的仪器设备。其灵活的设计可在重力或真空 manifold 条件下，通过多个亲和层析柱有效纯化毫克级蛋白。此外，每个独立层析柱的树脂类型、体积及其他参数均可调节，从而实现更快的优化。本研究证明，MCPA可将离子交换层析与亲和层析联用，以提高Abp1 SH3结构域的纯化效果。此外，利用这些方法可同时平行分离多达24种不同的蛋白质。

方案

1. 变性 Ni-NTA 层析

1. 配制缓冲液
   注意：所有缓冲液的详细信息见表1。
   1. 配制500 mL的0.5 M NaOH，确保先加入Milli-Q水，然后将NaOH缓慢加入置于搅拌器上的烧杯中。使用0.22 µm滤膜过滤。
   2. 配制100 mL的0.1 M硫酸镍，并使用0.22 µm滤膜过滤。
   3. 配制50 mL的2 M咪唑，并使用0.22 µm滤膜过滤。
   4. 配制并用0.22 µm滤膜过滤1.5 L的变性缓冲液（pH 8.0），其组成为5.3 mM Tris-HCl、4.7 mM Tris碱（Tris (羟甲基)氨基甲烷)、13.7 mM NaH₂PO₄、86.3 mM Na₂HPO₄和6 M盐酸胍。
   5. 使用2 M咪唑储备液，在变性缓冲液（见1.1.4）中溶解10 mM咪唑，配制并用0.22 µm滤膜过滤500 mL的裂解缓冲液溶液。
   6. 使用2 M咪唑储备液，在变性缓冲液（见1.1.4）中溶解10 mM咪唑，配制并用0.22 µm滤膜过滤500 mL的洗涤缓冲液溶液。
   7. 配制并用0.22 µm滤膜过滤500 mL的100 mM EDTA缓冲液，用1 M NaOH调节pH至8。
   8. 配制并用0.22 µm滤膜过滤500 mL的洗脱缓冲液，由7 mL 99%冰乙酸加入6 M盐酸胍中制成。
      注意：若使用天然缓冲液，请根据表1进行调整。
2. 细胞裂解（变性法）
   1. 每1 g收获的含有过表达His标签蛋白的E. coli细胞沉淀中加入2 mL裂解缓冲液。涡旋数分钟直至细胞重新悬浮。将样品在4 °C下于摇床上孵育30分钟。
   2. 在18,000 × g条件下离心裂解后的沉淀30分钟。保留50 µL样品置于-20 °C冰箱中，以备后续SDS-PAGE凝胶分析。
   3. 小心倾倒上清液，确保不扰动沉淀。裂解液应呈清澈的淡黄色。若裂解液浑浊，需再次离心；如有条件，可考虑超声处理以降解核酸。
   4. 将上清液通过空柱（无树脂但带滤膜）过滤，并收集至开放收集板中。然后转移至离心管中，用于步骤1.3。
      注意：若使用天然缓冲液，则在步骤1.2.1后，将样品进行-80 °C下3次冻融循环，或通过超声或French Press处理以裂解细胞。
3. 准备真空纯化装置并平衡层析柱
   注意：24根层析柱的MCPA装置设置见图1。
   1. 确定所需层析柱数量以及所需的树脂类型和体积。经验法则：对于使用T7质粒表达His标签SH3结构域的100 mL自诱导培养物（约2 g沉淀），每根层析柱使用0.6 mL Ni-NTA树脂，从约6 mL裂解液中可获得约3 mg蛋白。
   2. 将所需数量的12 mL层析柱（无树脂但带滤膜）插入已预组装的MCPA（长滴板配穿孔密封垫）中。层析柱应紧密嵌入密封垫的穿孔中。
   3. 若使用少于24根层析柱，需用封闭的空柱封住空余孔位。
   4. 取一个开放收集板，将其放入真空 manifold 的底座中，并用 manifold 上盖封闭。
   5. 将装有层析柱的MCPA组件放置在真空 manifold 顶部。
   6. 将真空泵系统的管路连接至真空 manifold 底部的进气口/喷嘴。
   7. 确保Ni-NTA珠粒处于含20%乙醇的50%悬浮液中。在操作前轻轻摇动/混匀珠粒-乙醇溶液，使其均匀重悬。然后使用5 mL移液器向每根层析柱中加入1.2 mL的50%溶液。移液过程中确保珠粒保持充分混匀。
   8. 向所有24根层析柱加样后，开启真空泵，使20%乙醇流经层析柱并进入下方的收集板。
   9. 当所有20%乙醇完全流经各层析柱后关闭泵（Ni-NTA树脂可耐受缓冲液流过后短暂的干燥状态）。将开放收集板中的内容物倒入废液箱。
      警告：所有来自Ni-NTA珠粒的废弃物均属危险品，操作珠粒或处理废弃物时应佩戴手套、护目镜及其他个人防护装备。此外，所有硫酸镍废弃物应单独收集于专用容器中，以便后续专门处理。
      ​注意：若树脂为新树脂或最近再生过，可忽略后续步骤，直接进入下一节。
   10. 使用20 mL注射器或配有50 mL注射器的重复加样器，向每根层析柱加入3倍树脂体积（1.8 mL）的100 mM EDTA缓冲液。然后开启真空泵，使EDTA缓冲液流经层析柱，流完后关闭泵。
       ​注意：此洗涤步骤应去除镍的蓝色，若未完全去除，则重复此步骤直至所有层析柱失去蓝色。关闭泵后，将收集板内容物倒入废液箱。
   11. 向每根层析柱加入3倍树脂体积（1.8 mL）的0.5 M NaOH缓冲液，然后开启泵使缓冲液流经各层析柱。清空收集板。
   12. 向每根层析柱加入4倍树脂体积（2.4 mL）的100 mM硫酸镍。开启真空泵，再次使溶液流经层析柱。
   13. 向每根层析柱加入10倍树脂体积（约6000 µL）的Milli-Q水，并使其流经层析柱。关闭泵，将收集板内容物倒入废液箱。
   14. 每次用4倍树脂体积（2.4 mL）的洗涤缓冲液中的10 mM咪唑（变性或天然）洗涤层析柱两次，以去除过量镍并完成平衡。清空收集板。
       ​注意：若某些层析柱流速明显变慢，应拆下层析柱，检查是否可用大号注射器推动空气通过MCPA。若未堵塞，则更换为带有新滤膜的层析柱。
   15. 若将在MCPA上纯化多个不同样品/蛋白，则将开放收集板更换为48孔（每孔5 mL）收集板。然而，若所有层析柱均运行相同蛋白样品，则可继续使用开放收集板。
4. 上样、洗涤与洗脱
   1. 关闭真空，将裂解液加入层析柱中（裂解液量可变，通常为1至12 mL或更多，可能需要分批上样）。使用细塑料搅拌棒轻轻混匀层析柱中的珠粒与裂解液，以最大化结合效率。
   2. 每根层析柱轻轻混匀数分钟后，开启真空泵，使裂解液流经层析柱。若同时运行多个蛋白样品，使用48孔收集板，并在每孔流过4 mL后及时更换为另一块48孔板（因这些板每孔仅可容纳4 mL溶液）。持续运行裂解液直至所有样品均通过层析柱。将含有穿流液的收集板冷冻保存。
      注意：层析柱可能出现"堵塞"现象，导致裂解液流速显著减慢。此情况易于识别，因邻近层析柱仍保持正常流速。若发生堵塞，建议将裂解液-树脂混合物转移至带有新滤膜的层析柱中。
   3. 将收集板更换为干净的开放收集板，然后向每根层析柱加入9倍树脂体积（5.4 mL）的10 mM咪唑洗涤缓冲液，开启真空使洗涤液流经层析柱。重复此步骤4–5次。为避免溢出，需定期清空废液板。
      1. 随后将收集板更换为干净的合适收集板（单一蛋白使用开放板，多个蛋白使用96孔板，并确保A1孔位于左上角）。
   4. 使用配有12.5 mL注射器的重复加样器，向每根层析柱加入约1倍树脂体积（0.75 mL）的变性洗脱缓冲液。
   5. 为避免蛋白起泡，将真空泵调至最低档开启。轻轻抬起MCPA检查收集板中是否仍有液滴残留。
      ​注意：除使用真空或重力洗脱外，另一种方法是将10 mL注射器推杆轻轻插入层析柱顶部，将洗脱缓冲液缓慢推过层析柱。对每根层析柱均进行此操作，移除推杆时需小心，避免扰动柱底珠粒。当洗脱缓冲液完全推出后，从最后一个使用过的层析柱上轻轻移除注射器推杆，并短暂开启真空泵以去除柱中残留的最后几滴液体。
      1. 若使用96孔收集板，则检查收集板，确保从每根层析柱经长滴板流出的液体仅进入一个孔，未流入邻近孔中。
   6. 进行下一次洗脱时，重复上述两步操作，并将洗脱液收集至新的多孔板（不同样品）或开放收集板（相同样品）中。
   7. 可选步骤：取每份洗脱液50 µL用于纯度和浓度分析。
   8. 向每根层析柱加入2 mL 20%乙醇，并用真空泵使其流过。再向每根层析柱加入2 mL 20%乙醇，使用新的细塑料搅拌棒混匀乙醇与珠粒，然后转移至50 mL离心管中，4 °C保存。清洗层析柱，检查水流是否能自由通过每根柱子，之后彻底清洁并妥善存放以备后续使用。
      ​注意：部分层析柱的滤膜最终会堵塞，导致流速过慢，此类层析柱应予以更换或清洗滤膜。因此，建议定期测试滤膜性能：取出树脂后向层析柱注满水，观察其是否能快速流过。滤膜可通过将封闭层析柱注满变性洗脱缓冲液并过夜震荡的方式进行清洗。

2. 离子交换——单一蛋白质纯化

1. 配制缓冲液
   注意：所有缓冲液的详细信息见表1
   1. 配制2 L低盐缓冲液：10 mM Tris pH 8.1（5 mM Tris酸，5 mM Tris碱）。使用0.22 µm滤膜过滤溶液。
   2. 配制0.5 L高盐缓冲液：10 mM Tris pH 8.1，4 M NaCl。称取116.9 g NaCl，用上述10 mM Tris pH 8.1缓冲液定容至0.5 L。使用0.22 µm滤膜过滤溶液。
2. 配制盐浓度梯度：0–1 M NaCl
   注意：盐浓度范围可根据每种蛋白质进行调整。
   1. 在支架中放置24个50 mL带标签的离心管
   2. 使用上述配制的缓冲液，配制24份14 mL的NaCl梯度溶液，浓度范围为0–1000 µM。首先加入所需体积的4 M NaCl 10 mM Tris溶液。可根据蛋白质情况以25 mM或50 mM递增。
   3. 然后向每支管中加入所需体积的10 mM Tris缓冲液。反复倒置混匀各管。
3. 样品准备
   1. 获取需通过离子交换纯化的样品。可选：取50 µL样品留作后续分析。
      注意：样品应始终保持低温；这些样品可能是裂解液，也可能是Ni-NTA纯化后的产物。在变性缓冲液中经Ni-NTA纯化的样品需进行透析或缓冲液置换至10 mM Tris缓冲液中。在天然缓冲液中经Ni-NTA纯化的样品可用10 mM Tris缓冲液稀释以降低盐浓度，使蛋白质能够结合离子交换树脂。
   2. 将样品在18,000 × g下离心10分钟。
   3. 小心将上清液倒入称量舟中，避免扰动沉淀。
   4. 用20 mL注射器小心吸取上清液，并连接0.22 µm滤器。
   5. 缓慢将上清液通过滤器排入新的50 mL离心管中。
   6. 如需稀释，用上述配制的10 mM Tris缓冲液稀释上清液（本实验中上清液按1:2稀释）。暂存于4 °C。
4. 准备真空纯化装置及平衡装置
   注意：本方案中，每一样品仅使用一根柱子进行离子交换纯化。如需进行多次纯化，请参见下一部分。
   1. 确定所需树脂类型及体积。经验上，对于最多20 mg部分纯化的His标签SH3结构域，每根柱子使用0.4 mL Q-Sepharose Fast Flow树脂（见步骤2.4.8）。
   2. 将24根开口空柱（底部无滤膜）插入预组装的MCPA中。柱子应紧密嵌入密封垫上已打孔的位置。
   3. 除第一个位置（纯化起始位置）外，在其余每个空柱中插入一个10 mL注射器推杆。
   4. 将一根带滤膜的开口柱底部穿过一个已穿孔的5 mL注射器推杆橡胶垫圈，使柱末端形成橡胶环。该橡胶环可确保此柱插入上方各空柱时形成良好密封。目前，先将此柱插入MCPA上的第一个空柱中。
   5. 取一个开口收集板，放入真空 manifold 底座中，并盖上 manifold 上盖。
   6. 将已组装的MCPA（含柱子）放置于真空 manifold 顶部。
   7. 将真空泵系统的管路连接至真空 manifold 底部的进气口/喷嘴。
   8. 剪取蓝色枪头底部约2 cm，用于吸取800 µL Q-Sepharose珠粒（或其他离子交换树脂），吸取前需充分混匀50/50珠粒-乙醇溶液以避免分层。将800 µL珠粒加入第一个位置的开口柱（带滤膜）中，待珠粒沉降至柱底后，开启适量真空使20%乙醇流过。
   9. 用2 × 2 mL 10 mM Tris缓冲液洗涤含Sepharose珠粒的柱子。在Tris缓冲液即将流尽前关闭真空，防止树脂干燥。流出液可弃去。
      注意：若树脂曾使用过，需在步骤2.4.9前用5倍柱体积的4 M NaCl洗涤，再用5倍柱体积的10 mM Tris洗涤以再生树脂。
5. 上样、洗涤与洗脱
   1. 将所有待纯化的样品（见第3部分）转移至第一个位置的Q-Sepharose柱中，用小型塑料环搅拌样品与珠粒约2分钟，然后开启真空泵。
      ​注意：若上清液体积过多（>12 mL），需注意避免柱子过载。待样品流尽后再加入下一批，并在流过前充分混匀。
   2. 保存或冷冻穿流液以备后续分析。
   3. 将另一块开口收集板放入真空 manifold 中，然后用2 × 2 mL 10 mM Tris缓冲液洗涤每个Sepharose柱，并分别收集。
   4. 插入一块96孔收集板，确保A1孔位于左上角。
   5. 为收集第一份洗脱组分，从下一个柱位移除注射器推杆，将Q-Sepharose柱移至该位置，并将注射器推杆插入前一位置。然后向Q-Sepharose柱中加入1 mL第一种盐浓度溶液。开启泵，收集洗脱液。当液体接近珠粒层时关闭泵，避免珠粒干燥。
   6. 为收集下一份洗脱组分，从下一个柱位移除注射器推杆，将Q-Sepharose柱移至该位置，并将注射器推杆插入前一位置。
   7. 向柱中加入1 mL下一盐浓度溶液，重复该过程，直至所有浓度均被使用，并在24个独立孔中收集到24份洗脱液。检查无液体流入邻近孔中。
   8. 用2 mL 4 M NaCl 10 mM Tris缓冲液洗涤柱子。让溶液流过。
   9. 用2 mL 20%乙醇洗涤。让乙醇流至接近珠粒层上方时停止，密封柱子以备储存。
   10. 保存96孔收集板，并通过紫外光谱和SDS-PAGE进行分析。

3. 离子交换——24 种不同蛋白质的同步纯化

注意：有关配制缓冲液、一系列盐浓度溶液及样品准备的详细信息，请参见步骤 2.1-2.3

1. 准备纯化装置
   注意：纯化系统的设置方式在很大程度上取决于需要纯化的蛋白质数量以及将使用的盐浓度种类。若要同时纯化12至最多24个样品，每种用于洗脱的盐浓度均需配备一个收集板。若样品少于12个，可在同一多通道压力适配器（MCPA）内将层析柱移动几个位置后再更换收集板。在此情况下，无需将层析柱插入空柱中，可直接将其连接至MCPA密封垫上。以下方案适用于同时进行24个离子交换纯化。
   1. 将已组装的MCPA（直接连接24个带滤膜的空柱）放置于真空 manifold 顶部，该 manifold 内放置一个敞开的收集板，并按照上述单个纯化方法准备并清洗24个离子交换柱。在此纯化过程中，使用Eppendorf多通道移液器或注射器快速向各柱中加样较为方便。
2. 上样、洗涤与洗脱
   1. 在安装MCPA（已连接清洗后的纯化柱）之前，先将一个48孔收集板放入真空 manifold 底部。确保A1孔位于左上角。
   2. 将每个蛋白样品（每次最多5 mL）移入对应的层析柱中。使用细塑料环（每根柱使用一个新环，以避免交叉污染）搅拌约2分钟。然后开启真空泵，使上清液流过层析柱。
      注意：若上清液体积过多，需注意避免柱子过载。应待样品完全流过后再添加下一部分，并在每次流过前充分混匀。
   3. 将含有各蛋白流穿液的48孔收集板保存或冷冻，以备后续分析。
   4. 在真空 manifold 中放入另一个48孔收集板，然后用2 × 2 mL的10 mM Tris缓冲液洗涤每个Sepharose柱。
   5. 将第一个96孔收集板插入 manifold，确保A1孔位于左上角，然后向每根柱中加入1 mL第一种盐浓度的洗脱缓冲液，开启真空泵使液体流过柱子。取出收集板，用Parafilm封膜后于4 °C保存，用于后续分析。
   6. 对每一种后续用于洗脱的盐浓度重复上述步骤。确保每次洗脱均使用新的96孔收集板，并对每块收集板进行标记和妥善保存。
   7. 用2 mL的10 mM Tris、4 M NaCl缓冲液洗涤每根柱子。
   8. 用2 mL的20%乙醇洗涤每根柱子。让乙醇流下至液面刚好高于树脂珠时停止，密封柱子以备储存。
   9. 保存所有96孔收集板，并通过紫外光谱分析和SDS-PAGE进行检测。

结果

例如，MCPA 已成功在变性条件下通过 Ni-NTA 纯化了 14 种 AbpSH3 突变体图2A可以看到一个约25 kDa的小分子污染物，但蛋白质仍保持较高的纯度。该污染物被认为是YodA，一种在共纯化过程中常见的蛋白质。 E. coli¹¹. 图2B 展示了在天然条件下纯化11种不同SH3结构域的结果。在变性条件下出现的小杂质在天然条件下被去除。这表明MCPA可用于比较由天然或变性缓冲液组成的纯化效果，如表1所列。

通过MCPA离子交换层析纯化裂解液的代表性数据如图3所示。结果表明，AbpSH3可在425 mM至700 mM之间较晚洗脱，从而与大部分杂质蛋白分离。洗脱蛋白所需的盐浓度反映了蛋白与树脂之间静电相互作用的强度。大多数细菌蛋白的等电点（pI）较低；然而目标蛋白带有较强负电荷，似乎具有更低的等电点。通过该方法获...

讨论

该方法稳健且易于使用，对于经验相对较少的蛋白质生物化学研究人员而言较为适用，但仍需注意一些事项。

关于集菌板过度填充的注意事项

48孔收集板每孔仅能容纳5 mL，而96孔板每孔仅能容纳2 mL。在添加缓冲液和将样品通过层析柱时，必须牢记这一点，以防孔过载。特别是将较大体积的样品转移至层析柱进行纯化时需格外小心。若上清液体积过多，应将其分批加入，每批体积以能够完全通过层析柱为宜，并在加入下一批前让前一批完全流过，以避免过载和样品损失。每次加入上清液后，应使用小型塑料接种环轻轻混匀层析柱中的树脂，以提高蛋白与珠粒结合的几率，然后再启动泵。为准确追踪板的方向从而明确各孔内容物，请确保在开始纯化前，标记为“A1”的角落始终位于板的左上角。

洗脱蛋白质

在离子交换层析和亲和层析的洗脱步骤中，应使用真空泵的最低档位将洗脱缓冲液抽过层析柱。与重力流速相比，这种方法...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2 mL/孔 收集板	Agilent technologies	201240-100
5 mL/孔 收集板	Agilent technologies	201238-100
12 mL 层析柱	Bio-Rad	7311550
96 孔长滴板	Agilent technologies	200919-100	配有 0.25 µm 滤膜，需移除
96 孔板密封垫/封板膜	Agilent technologies	201158-100	应可穿刺
His60 Ni Superflow 树脂	Takara Bio	635660
HiTrap Q HP 阴离子交换柱	GE Healthcare (Cytiva)	17115301
Lvis 板式读数仪	BMG LABTECH		与 FLUOstar Omega 板式读数仪兼容
雄性鲁尔接头塞	Cole-Parmer	EW-45503-70
PlatePrep 96 孔真空 manifold 起始套装	Sigma-Aldrich	575650-U
储液收集板	Agilent technologies	201244-100
The Repeater Plus	Eppendorf	2226020	配有 5 mL 和 50 mL 注射器
VACUSAFE 真空系统	INTEGRA	158 320	VACUSAFE 真空系统的真空范围为 300 mBar 至 600 mBar，并配有 4 L 废液收集瓶