一种使用多柱板适配器的经济且通用的高通量蛋白质纯化系统

摘要

多列柱适配器可将层析柱与多孔收集板连接，用于并行亲和或离子交换纯化，提供一种经济高效的高通量蛋白质纯化方法。该方法可在重力或真空条件下使用，通过价格适中的仪器即可获得毫克级蛋白质。

摘要

蛋白质纯化对于研究蛋白质的结构与功能至关重要，通常需结合生物物理技术使用。它也是开发新型治疗手段的关键环节。功能蛋白质组学的发展时代正推动着对高通量蛋白质纯化技术及改进方法的需求。有研究假设，多柱板适配器（MCPA）能够将多种不同树脂的层析柱与多孔板连接，实现并行纯化。该方法提供了一种经济且灵活的蛋白质纯化方式，可在重力或真空条件下使用，其速度可与自动化系统相媲美。MCPA可通过一种经济高效且节省时间的方法回收毫克级蛋白产量，适用于后续的表征与分析。MCPA已成功应用于SH3结构域的高通量亲和纯化。此外，通过MCPA实现离子交换层析，在Ni-NTA亲和层析后进一步纯化蛋白质，表明该系统可适配于其他类型的纯化方法。由于其采用多柱设计，可在同一次纯化过程中对各个参数进行独立定制，这是当前基于板式的方法无法实现的。

引言

为了对蛋白质进行表征和分析，尤其是对于核磁共振（NMR）等生物物理方法而言，获得毫克级纯化蛋白质的蛋白质纯化技术至关重要。蛋白质纯化在其他研究领域也处于核心地位，例如药物发现过程和蛋白质-蛋白质相互作用研究；然而，获得足量高纯度蛋白质常常成为这些技术的瓶颈^1,2,3。蛋白质纯化的主要方法是色谱法，该方法包含多种基于蛋白质及其标签各自特性的分离技术。在亲和色谱中，目标蛋白质携带一个额外的蛋白质或肽序列作为标签，该标签可特异性结合色谱树脂上的特定基质⁴。最常用的亲和色谱方法是利用带组氨酸标签（His-tag）的蛋白质进行的固定化金属离子亲和色谱（IMAC），而另一种广泛应用的方法是根据蛋白质电荷差异进行分离的离子交换色谱。为了获得最高纯度，通常联合使用亲和色谱与离子交换色谱，但这一过程通常需要昂贵的高通量实验设备。

功能蛋白质组学的不断发展推动了对高通量蛋白质纯化技术的需求，其目标不再是针对特定分析纯化单一蛋白质，而是同时纯化大量蛋白质以进行综合分析和全基因组范围的研究⁵。固定化金属亲和层析（IMAC）是目前最广泛使用的高通量蛋白质纯化方法之一⁶

方案

1. 变性 Ni-NTA 层析

1. 配制缓冲液
   注意：所有缓冲液的详细信息见表1。
   1. 配制500 mL的0.5 M NaOH，确保先加入Milli-Q水，然后将NaOH缓慢加入置于搅拌器上的烧杯中。使用0.22 µm滤膜过滤。
   2. 配制100 mL的0.1 M硫酸镍，并使用0.22 µm滤膜过滤。
   3. 配制50 mL的2 M咪唑，并使用0.22 µm滤膜过滤。
   4. 配制并用0.22 µm滤膜过滤1.5 L的变性缓冲液（pH 8.0），其组成为5.3 mM Tris-HCl、4.7 mM Tris碱（Tris (羟甲基)氨基甲烷)、13.7 mM NaH₂PO₄、86.3 mM Na₂HPO₄和6 M盐酸胍。
   5. 使用2 M咪唑储备液，在变性缓冲液（见1.1.4）中溶解10 mM咪唑，配制并用0.22 µm滤膜过滤500 mL的裂解缓冲液溶液。
   6. 使用2 M咪唑储备液，在变性缓冲液（见1.1.4）中溶解10 mM咪唑，配制并用0.22 µm滤膜过滤500 mL的洗涤缓冲液溶液。
   7. 配制并用0.22 µm滤膜过滤500 mL的100 mM EDTA缓....

结果

例如，MCPA 已成功在变性条件下通过 Ni-NTA 纯化了 14 种 AbpSH3 突变体图2A可以看到一个约25 kDa的小分子污染物，但蛋白质仍保持较高的纯度。该污染物被认为是YodA，一种在共纯化过程中常见的蛋白质。 E. coli¹¹. 图2B 展示了在天然条件下纯化11种不同SH3结构域的结果。在变性条件下出现的小杂质在天然条件下被去除。这表明MCPA可用于比较由天然或变性缓冲液组成的纯化效果，如表1所列。

通过MCPA离子交换层析纯化裂解液的代表性数据如图3所示。结果表明，AbpSH3可在425 mM至700 mM之间较晚洗脱，从而与大部分杂质蛋白分离。洗脱蛋白所需的盐浓度反映了蛋白与树脂之间静电相互作用的强度。大多数细菌蛋白的等电点（pI）较低；然而目标蛋白带有较强负电荷，似乎具有更低的等电点。通过该方法获.......

讨论

该方法稳健且易于使用，对于经验相对较少的蛋白质生物化学研究人员而言较为适用，但仍需注意一些事项。

关于集菌板过度填充的注意事项

48孔收集板每孔仅能容纳5 mL，而96孔板每孔仅能容纳2 mL。在添加缓冲液和将样品通过层析柱时，必须牢记这一点，以防孔过载。特别是将较大体积的样品转移至层析柱进行纯化时需格外小心。若上清液体积过多，应将其分批加入，每批体积以能够完全通过层析柱为宜，并在加入下一批前让前一批完全流过，以避免过载和样品损失。每次加入上清液后，应使用小型塑料接种环轻轻混匀层析柱中的树脂，以提高蛋白与珠粒结合的几率，然后再启动泵。为准确追踪板的方向从而明确各孔内容物，请确保在开始纯化前，标记为“A1”的角落始终位于板的左上角。

洗脱蛋白质

在离子交换层析和亲和层析的洗脱步骤中，应使用真空泵的最低档位将洗脱缓冲液抽过层析柱。与重力流速相比，这种方法.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2 mL/孔 收集板	Agilent technologies	201240-100
5 mL/孔 收集板	Agilent technologies	201238-100
12 mL 层析柱	Bio-Rad	7311550
96 孔长滴板	Agilent technologies	200919-100	配有 0.25 µm 滤膜，需移除
96 孔板密封垫/封板膜	Agilent technologies	201158-100	应可穿刺
His60 Ni Superflow 树脂	Takara Bio	635660
HiTrap Q HP 阴离子交换柱	GE Healthcare (Cytiva)	17115301
Lvis 板式读数仪	BMG LABTECH		与 FLUOstar Omega 板式读数仪兼容
雄性鲁尔接头塞	Cole-Parmer	EW-45503-70
PlatePrep 96 孔真空 manifold 起始套装	Sigma-Aldrich	575650-U
储液收集板	Agilent technologies	201244-100
The Repeater Plus	Eppendorf	2226020	配有 5 mL 和 50 mL 注射器
VACUSAFE 真空系统	INTEGRA	158 320	VACUSAFE 真空系统的真空范围为 300 mBar 至 600 mBar，并配有 4 L 废液收集瓶