本方案描述了三种获取和使用5至8日龄鸡胚及其绒毛尿囊膜（CAM）作为体内模型的方法 用于研究增强超声成像及微泡介导药物递送的模型。
本文内容
摘要
摘要
鸡胚及其富含血管的尿囊绒毛膜（CAM）是研究生物医学过程、新型超声脉冲方案，以及用于造影增强超声成像和微泡介导药物递送的新型换能器的一种有价值的体内模型。采用该模型的原因在于鸡胚及CAM血管网络易于接近，且模型成本较低。获得鸡胚和CAM血管通路的关键步骤之一是将蛋内容物从蛋壳中取出。本方案描述了在孵化第5至 8天之间将蛋内容物从蛋壳中取出的三种方法，从而使胚胎可在蛋壳内正常发育至这些时间点。所描述的方法仅需简单的工具和设备，相较于体外（ex ovo）培养的胚胎（约50%），其孵化后胚胎存活率更高，分别为：5日龄90%、6日龄75%、7日龄50%、8日龄60%。本方案还介绍了如何将空化核（如微泡）注射到CAM血管系统中，如何将含有胚胎和CAM的膜与其他蛋内容物分离以进行光学透明研究，以及如何在多种短期超声实验中使用鸡胚和CAM模型。体内 鸡胚与CAM模型对于研究新型成像方案、超声造影剂、用于造影增强超声成像的超声脉冲方案，以及揭示超声介导药物递送的机制具有重要意义。
引言
Ex ovo 鸡胚及其富含血管的尿囊绒毛膜（chorioallantoic membrane, CAM）已被证实是研究多种生物学和生物医学过程（如胚胎发生、肿瘤学和药物递送）的合适模型1,2,3,4。超声技术已被用于胚胎心脏发育的成像4,5 ，也可在注射微泡等空化核后通过超声激活实现血管内药物递送6,7。与其他动物模型相比，鸡胚成本低廉，所需基础设施和设备较少，且受到的法规限制更为宽松8。打开蛋壳后，鸡胚及CAM血管易于接触，而哺乳动物胚胎和血管则难以实现类似操作。此外，鸡胚及CAM血管具有心跳和脉动性血流。CAM在血管解剖结构上与哺乳动物具有相似性，可用于药物筛选8,9,10。由于这些特性，CAM血管也被证实是研究超声造影成像（contrast enhanced ultrasound imaging, CEUS）的合适模型11,12,13,14,15,16。此外，该模型还可结合超高速相机，在超声场中光学观察超声造影剂的行为，以及声辐射力对药物推进、结合和外渗作用的影响7,17,18,19。尽管鸡胚和CAM不适合长期实验，但其在短期in vivo实验中具有显著优势。
为了在实验过程中提高鸡胚及绒毛尿囊膜（CAM）的可见性和可控性，将含有鸡胚和CAM的蛋内容物从蛋壳中取出至关重要。18既往涉及超声造影剂的鸡胚研究多采用5至6日龄的胚胎7,11,12,17,19 14至18日龄的胚胎13,14,15,16已有多种方法被详细描述，用于将蛋内容物从蛋壳中取出18,20,21然而，据我们所知，先前已发表的方法主要集中在孵化3天后（即Hamburger & 哈密顿（HH）第19-20期22），并继续培养 体外。这一点 体外 培养方法存在多种缺点，包括培养过程中死亡风险增加（约50%）1,18，抗生素的使用18,20，与之相比，总血管长度减少 在卵内 生长23由于在蛋壳内培养胚胎能够提供最接近自然的环境，因此将胚胎在蛋壳内孵育至实验当天是最简便的方法。因此，在孵化第5至第8天将蛋内容物从蛋壳中取出的操作方法，尤其适用于针对5至8日龄胚胎的实验研究。
在本实验方案中，我们描述了三种方法，用于在胚胎发育第5至8天（HH 26-3522）时将卵内容物从蛋壳中取出，同时允许胚胎在蛋壳内继续发育至实验当天。在8日龄胚胎的微小毛细血管中，CAM血管直径范围为10–15 µm24 ，而在6日龄和8日龄胚胎的较大血管中，直径可达115–136 µm24,25。所描述的三种方法仅需使用基本的实验室工具，且可降低实验开始前发生并发症的风险，从而减少不必要的成本和劳动。我们还详细说明了一种将含有胚胎和CAM的膜与卵黄囊分离的方法，从而使CAM在显微镜观察下具有光学透明性。由于含有胚胎和CAM的膜可以固定在例如带有声学膜的支架上，该装置也可实现声学透明26，当光路受到卵黄影响时，可实现显微成像与超声成像的联合应用。最后，我们描述了其他几种可用于超声或CEUS成像的超声装置设置方案。
方案
所有动物实验均依照荷兰《动物实验法》以及欧洲理事会（2010/63/EU）关于保护用于科学目的动物使用的法规进行。
1 . 胚胎制备方案
- 受精鸡卵的孵育
- 将新受精的鸡卵在15 °C下储存，最长可保存一周。
- 将受精卵垂直放置于37 °C、加湿的培养箱中，尖端朝下进行孵育。孵育过程中无需翻动卵。
注意：使用永久性标记笔在卵的顶部标明孵化开始日期。
- 制备不超过5天（120小时）龄的胚胎（HH 26-28期）22
- 工作区域的准备
- 将加热板预热至 37 °C。
- 放置一个金属蛋托（图1A，B），金属称量舟架（图1C，D，以及一个装有 PBS 并置于加热板上的 10 mL 锥形瓶。
- 将超声耦合剂均匀铺满一层（厚度约10 mm）于称量皿（85 mm × 85 mm × 25 mm）中，然后将装有耦合剂的称量皿放入预热的金属称量皿支架内。
注意：在称量皿中加入超声耦合剂可抬高胚胎和尿囊膜。这有利于胚胎和尿囊膜的注射或成像操作，但在取出胚胎和尿囊膜时并非必需。 - 准备几段胶带（长约3 cm），将其中一端部分折叠回自身，使其不再具有黏性。
- 从蛋壳中取出内容物
- 取一枚孵化5天的受精卵，转移至预热的金属蛋托中（图1A，B）。确保保持鸡蛋的同一方向（即日期朝上）。
注意：保持鸡蛋的方向一致非常重要，以确保气室、胚胎和尿囊绒毛膜（CAM）始终位于鸡蛋的顶部相同位置。 - 使用镊子的尖头背面（或类似工具）； 图1E在卵子顶端（写有日期的位置）轻轻按压，形成一个小凹痕图2A).
- 使用镊子的尖头背面在卵的侧面约三分之二处向下压出第二个凹痕（图2B).
注意：避免压痕过大而形成孔洞。若不慎产生孔洞，须用胶带封住孔洞，切勿再次压出新的凹痕。 - 使用较大的镊子（图1E），从鸡蛋顶部有标记日期的凹陷区域取下一小块蛋壳，确保蛋壳顶部的气室与外界空气接触，但不要过深地穿透蛋壳。
注意：在制作顶部凹痕时，如果穿透蛋壳过深，可能会损伤胚胎和绒毛尿囊膜（CAM），导致胚胎在脱离蛋壳的过程中无法存活。顶部的小孔必须确保蛋内外的空气相通，这一点至关重要。如果未实现空气流通，在后续操作步骤中会产生真空，导致大量气泡被困在绒毛尿囊膜下方，从而使胚胎和绒毛尿囊膜失去实验价值。为确定蛋内气室的位置，可使用光源进行观察，因为气室的位置并不总是在正顶部，有时可能偏向侧面。 - 使用5 mL注射器和19 G针头，从鸡蛋侧面距蛋底2/3处的第二个凹陷位置刺入蛋壳，抽出约2 mL蛋清图2C).
注意：确保针头朝下指向蛋的底部，以避免损伤胚胎和绒毛尿囊膜（CAM）。此步骤可在蛋的顶部形成一个较大的气室，便于后续移除蛋内容物。如果在步骤1.2.2.3中不慎戳出孔洞而非压出凹痕，可用针头刺穿胶带以排出蛋清，随后用另一块胶带重新封住穿刺处。 - 取出针头，并用胶带密封侧面的缝隙（图 2D).
注意：为防止蛋清从蛋壳中漏出，在拔出针头前可用手指堵住顶部的小孔。如果贴上胶带后蛋清仍持续渗出，应先用纸巾擦去蛋清，确保胶带能够牢固粘贴。 - 将蛋清加入称量舟中，排空注射器。
- 使用大号镊子（图1E）以扩大卵顶部的小开口（图2E）。通过顶部的开口观察蛋内时，可见胚胎和尿囊绒毛膜（CAM）。在尽可能多地移除蛋壳的同时，持续定位胚胎和尿囊绒毛膜（CAM）。图2F) .
注意：持续移动鸡蛋以最大程度地观察蛋壳内胚胎和尿囊绒毛膜（CAM）的位置。确保蛋壳开口的边缘不低于CAM，同时不要穿透内膜，并避免产生锋利的边缘。 - 创建开口后，将鸡蛋旋转180°，并将其重新放入蛋架中，使之前在顶部形成的开口现在朝向底部。胚胎将上浮，从底部不可见图2G）耗时约1-2分钟。确保整个胚胎和绒毛尿囊膜（包括所有血管）均已消失，仅剩卵黄可见后，再进行下一步操作（图 2H).
注意：若2分钟后仍能从底部看到胚胎，将蛋顺时针旋转1-2分钟，有助于胚胎和尿囊绒毛膜（CAM）上浮。 - 从侧面开口处移除胶带。观察蛋的内部是否已从底部开口向外凸出。若是，则进行下一步。若否，使用注射器上的针头再次刺破侧面的开口，以释放蛋内的真空。操作时务必使针头朝上，避免刺破卵黄囊。重复此步骤，直至蛋内容物从底部开口凸出。
- 将蛋的底部靠近金属称量舟支架中的称量舟时（图1C,D），使用小镊子的一个尖端，在开口的整个宽度范围内轻轻但迅速地在膜上划出一道水平划痕图1F）并将卵内容物轻轻倒入称量舟中（图 2I).
注意：如果卵内容物未排出，使用注射器上的针头再次穿刺侧面开口，针头朝上。 - 如果胚胎侧向放置在称量舟中，通常会自行上浮。若未发生此情况，可用一小片纸巾重新调整胚胎位置。将纸巾的一端放在胚胎上，将纸巾拖至另一端，然后使用塑料巴斯德吸管滴加数滴约30 µL的PBS（37 °C），使纸巾释放胚胎。
- 通过观察确认胚胎是否存活，检查是否有心跳、绒毛尿囊膜（CAM）血管是否完整且无出血，以及卵黄是否无泄漏。若上述任一情况异常，应丢弃该胚胎和CAM，因其不具备存活能力。
- 确保胚胎和绒毛尿囊膜（CAM）保持在37 °C，且不干燥，因为干燥会导致CAM血管退化，最终导致胚胎死亡。为防止此情况，需定期在胚胎和CAM上滴加约30 µL的37 °C PBS。
- 取一枚孵化5天的受精卵，转移至预热的金属蛋托中（图1A，B）。确保保持鸡蛋的同一方向（即日期朝上）。
- 工作区域的准备
- 准备6至7日龄（144–168小时）胚胎（HH 28–32期）22
- 工作区域的准备
- 按照第1.2.1节所述准备载物台。
- 从蛋壳中取出内容物
- 实验开始前2小时，取一枚孵化6至7天的鸡蛋，在孵化箱内将鸡蛋旋转180°，使蛋的顶部朝向底部。1小时后，将鸡蛋转回原始位置，继续孵育1小时。
注意：在实验开始前 2 小时预先旋转鸡蛋，将更便于取出蛋内容物。 - 旋转后，从培养箱中取出鸡蛋。
- 执行步骤 1.2.2.2 至步骤 1.2.2.4。
- 使用5 mL注射器和19 G针头，从鸡蛋侧面距蛋底约2/3处的第二个凹陷处刺入蛋壳，向下朝向蛋的底部，抽出5–6 mL蛋清。
注意：使用我们所用的5 mL注射器时，最多可抽取6 mL液体，因此仅需穿刺一次。 - 取出针头，并用胶带封住侧面的缝隙（图 2D).
- 将蛋清加入称量皿中的超声耦合剂，排空注射器。
- 使用大号镊子（图1E）以扩大卵顶部的小开口（图2E尽量将开口开得大一些，但需确保蛋壳开口的边缘不低于绒毛尿囊膜（CAM）。此外，切勿穿透内膜，并尽量避免产生锋利的边缘。
- 用注射器吸取比步骤1.3.2.4中抽出体积多约1 mL的37 °C PBS。
- 从侧边缝隙处取下胶带，将装有填充物的注射器插入缝隙，并将内容物注入蛋壳内。确保针头朝下，指向蛋的底部。
注意：由于蛋清的黏度较高 （约160 cP）27 相较于PBS（约1 cP），用PBS替代蛋清可在将蛋内容物从蛋壳中取出时，降低对胚胎和尿囊绒毛膜的张力和应力。 - 取出针头，并用一小片胶带迅速封闭缝隙（图 2D).
- 将鸡蛋旋转180°，并将其重新放回蛋托中，使原先位于顶部的开口朝下。顺时针旋转鸡蛋，直至整个胚胎和尿囊绒毛膜（包括所有血管）均不可见，仅可见蛋黄。
- 执行步骤 1.2.2.10 至步骤 1.2.2.14。
- 实验开始前2小时，取一枚孵化6至7天的鸡蛋，在孵化箱内将鸡蛋旋转180°，使蛋的顶部朝向底部。1小时后，将鸡蛋转回原始位置，继续孵育1小时。
- 工作区域的准备
- 制备8天（192小时）龄胚胎（HH 32-35期）22
- 工作区域准备
- 将加热板预热至 37 °C。
- 放置一个金属称量舟托架（图1C，D以及一个装有 PBS 的 10 mL 锥形瓶置于加热板上。
- 取一个尺寸为 170 x 110 x 70 mm 或类似的浅容器，并向容器中加入 1 L 37 °C 的 PBS。
- 将称量皿（85 × 85 × 25 mm）放入直径为90 mm的培养皿中。将培养皿和称量皿置于容器底部，并确保其完全浸没。
- 从蛋壳中取出内容物
- 实验前2小时，取一枚孵化8天的鸡蛋，在孵化箱内将鸡蛋旋转180°，使蛋的顶部朝向底部。1小时后，将鸡蛋转回原始位置，继续孵育1小时。
注意：在实验开始前2小时预先旋转鸡蛋，将更便于取出蛋内容物。 - 从孵化箱中取出一枚孵化8天的鸡蛋。
- 将卵水平握住，使用大镊子尖端的背部（图1E向下按压卵壳约一半深度，形成一个小凹痕。以约10 mm的间距，围绕卵壳以360°环形连续制作多个小凹痕。
注意：在此过程中，压痕之间可能会开始出现微小裂纹。 - 在蛋壳周围制作好小凹痕后，使用大镊子尖锐的尾部，在两个小凹痕之间敲击蛋壳，从而形成一个较大的孔。
- 将鸡蛋完全浸没于37 °C的PBS中，保持浸没状态5 min。5 min后，将鸡蛋保持在容器内称量舟的附近。将两个拇指顶部放入大孔中，轻轻打开鸡蛋。鸡蛋将沿小凹痕处裂开。
- 当裂缝完全环绕蛋壳形成后，轻轻尝试将两片蛋壳分开，并持续轻柔地来回移动两片蛋壳，直至蛋内物质与蛋壳完全分离。随后，将蛋内物质轻轻放入称量舟中。
注意：通过来回移动两片蛋壳，可使更多 PBS 流入蛋壳内，有助于将蛋内容物与蛋壳分离。有时会有少量蛋清粘附在蛋壳内壁上，此时需使用镊子将蛋清从蛋壳上分离。 - 缓慢将含有称量舟和卵内容物的培养皿从PBS中提起。离开PBS后，轻轻倾斜称量舟以去除多余的PBS。
- 将装有卵内容物的称量舟放入金属称量舟支架中，并转移至所需的实验装置。
- 实验前2小时，取一枚孵化8天的鸡蛋，在孵化箱内将鸡蛋旋转180°，使蛋的顶部朝向底部。1小时后，将鸡蛋转回原始位置，继续孵育1小时。
- 工作区域准备
2. 选定的应用
- 向CAM血管中注射微泡和/或其他溶液
- 准备注射装置
- 使用微熔器从玻璃毛细管中拉制玻璃针（图3A），或直接购买已拉制好的玻璃毛细管针。
- 若玻璃毛细管针尖端未斜面处理，可折断针尖一小部分。用矿物油填充玻璃针，并将其安装至显微注射系统中。确保玻璃针内的矿物油中无气泡。
注意：矿物油的使用遵循我们所用注射系统制造商的说明。 - 将已拉制的玻璃毛细管针尽可能排空至显微注射系统允许的程度，然后部分重新填充空气。
注意：少量空气可防止矿物油与待注射溶液混合。 - 取10 µL所需溶液（本方案中为微泡），滴加至一片蜡膜上（图3B）。若需多种溶液，可在移液前进行混合7。
注意：在用微泡填充针头前，将微泡液滴静置于蜡膜上约1分钟，使微泡上浮至液滴顶部并浓缩。对于定制的F型超声造影剂28，此浓缩步骤可使待注射微泡浓度提高约30%。注射后鸡胚血液中的微泡浓度在5日龄胚胎中为32 × 103 微泡/µL，在6日龄胚胎中为19 × 103 微泡/µL。 - 将玻璃针尖端插入蜡膜上的液滴中，以填充微泡和/或其他溶液。吸取微泡时，确保针尖位于液滴顶部，以吸取富含微泡的溶液。
注意：注射微泡前，将玻璃针针尖升至最高点并静置约2分钟，以确保微泡在针尖处富集。
- 准备注射装置
- 向CAM血管中注射
- 注射前，在体视显微镜下观察CAM，选择最佳注射血管。始终将物质注入胚胎的静脉中。静脉是血液流向胚胎的血管。由于血液含氧量较高，静脉颜色较动脉浅29。此外，除前、后卵黄静脉（即分支较少的静脉，图6A、B中以星号标示）外，静脉通常位于动脉上方，而这两条静脉周围无动脉。
注意：注入分支血管可减少注射过程中对血流的阻塞。良好的注射位点已在图6A、B中用箭头标示。必须将物质注入静脉，以确保注射物随血流流向胚胎。此外，若注入动脉，拔出玻璃针时将导致大出血，从而导致胚胎死亡。 - 调整玻璃针与胚胎的位置，使玻璃针尖端与选定静脉处于同一焦平面且位于同一直线上。尽量使针头与选定静脉平行并保持水平。针尖应接触血管壁。
注意：尽可能使玻璃针保持水平，可降低穿透整个血管的风险。 - 定位后，缓慢推进玻璃针并穿透血管壁。穿透过程中，CAM会因玻璃针移动而被推开。继续推进玻璃针直至穿透血管壁。
注意：若不慎完全穿透血管，应缓慢回撤针头以重新进入管腔。回到管腔内后，轻微上抬针头并沿血管向前移动，以重新定位。 - 穿透后，轻微回撤玻璃针，使针尖更好地置于血管管腔内，并横向移动玻璃针以确认其未粘附于血管壁。缓慢注入少量溶液，以确认针尖位于血管管腔内（图3C）。
- 确保注入的溶液沿血流方向流动。若未沿血流方向，轻微移动玻璃针并持续注入少量溶液，直至针头位置正确17。
- 注入所需剂量后，将玻璃针在血管内保留约15秒，以防止大出血。随后，轻微横向、上下及前后移动玻璃针数次，以实现平稳撤针。
注意：少量出血属正常现象。每次注射均应使用新的玻璃针，因玻璃针易被蛋清堵塞并变钝。
- 注射前，在体视显微镜下观察CAM，选择最佳注射血管。始终将物质注入胚胎的静脉中。静脉是血液流向胚胎的血管。由于血液含氧量较高，静脉颜色较动脉浅29。此外，除前、后卵黄静脉（即分支较少的静脉，图6A、B中以星号标示）外，静脉通常位于动脉上方，而这两条静脉周围无动脉。
- 胚胎和/或CAM血管的显微成像
- 准备带声学膜的支架
- 取一个细胞培养腔室，其由一个方形塑料支架和两片平行的50 µm厚声学透明聚碳酸酯膜组成26，后文简称带声学膜的支架。用盖子封闭两端端口。
- 使用手术刀从带声学膜的支架上去除两片膜中的一片。
注意：去除膜时，沿塑料支架上的胶线边缘切割。注意不要滑出边缘，以免损坏另一片膜。 - 在小玻璃烧杯中加热去离子水配制的2%琼脂糖溶液至80–95 °C，制备约15 mL。将溶解后的琼脂糖溶液置于流动冷水下冷却。
注意：若琼脂糖过热，会熔化声学膜，导致表面不平整。 - 当溶液冷却至约37 °C时，缓慢将溶液倒入带声学膜的支架中，直至完全充满。轻微倾斜支架，使琼脂糖层在塑料框架内均匀分布（图4A）。确保琼脂糖层平整，并在室温下静置凝固。
- 将胚胎和CAM从卵黄囊中取出并置于带声学膜的支架上
- 按第1.2、1.3或1.4节所述方法取出蛋内容物。
- 如有需要，按第2.1.2节所述方法向CAM注射微泡和/或其他溶液。
- 在1 L培养皿中加入约500 mL 37 °C PBS，并将含琼脂糖的带声学膜支架置于皿底。确保琼脂糖层朝上。
- 使用小剪刀在称量舟中的蛋内容物内，沿整个CAM周围快速剪开卵黄囊膜（又称卵黄膜）（图4B）。剪切时保持剪刀位置固定，旋转称量舟以提高精度和速度。
注意：从第一刀开始，卵黄即会开始泄漏，降低胚胎和CAM的可见度。尽量在6–7次剪切内完成环绕剪切，总时间不应超过20秒。可使用小镊子（图1F）夹住卵黄膜边缘，防止剪到CAM。 - 用汤匙从称量舟中舀起包含胚胎和CAM的剪下膜片。缓慢抬起汤匙，目视检查含胚胎和CAM的膜片是否仍附着于剩余卵黄囊膜。若仍附着，用剪刀再剪一刀。舀起过程中轻微倾斜汤匙以尽可能去除卵黄，但避免使其干燥。将含胚胎和CAM的膜片转移至1 L培养皿中，浸入37 °C PBS，并取出汤匙。
- 当含胚胎和CAM的膜片浸入37 °C PBS后，使用小镊子（图1F）夹住膜片一端，轻轻搅动膜片以去除残留卵黄。
- 去除所有卵黄后，使用小镊子移动含胚胎和CAM的膜片，并将其置于带声学膜的支架上方。
- 使用一根昆虫标本针将含胚胎和CAM的膜片在某一角固定。避免刺穿CAM中的血管，仅固定膜片。
- 使用第二根昆虫标本针将含胚胎和CAM的膜片在对角另一角固定。
- 缓慢将含胚胎和CAM的带声学膜支架从37 °C PBS中提起。轻微倾斜支架以去除大部分PBS。
- 使用小镊子（图1F）拉伸并均匀铺展含胚胎和CAM的膜片，覆盖于带声学膜的支架上，并固定膜片其余部分。确保含胚胎和CAM的膜片轻微拉伸，以保证其平整（图4C）。
- 将固定好膜片的带声学膜支架放入保持在37 °C的显微成像系统中。
- 在胚胎或CAM的兴趣区域上方放置盖玻片或声学与光学透明膜（根据所需物镜及是否使用超声而定）（图4D），以实现光学可视化。
- 准备带声学膜的支架
- 鸡胚和/或CAM血管的超声成像
- 从鸡胚和CAM血管侧面进行超声成像
- 按第1.2、1.3或1.4节所述方法取出蛋内容物。但不要使用标准称量舟，而应使用一侧具有声学透明壁的定制称量舟。
注意：标准称量舟经改造，切去一侧并用聚酯薄膜窗替代，使用环氧胶粘合。 - 将所需的超声换能器浸入37 °C水浴中，并调整至所需位置，保持适当的standoff距离。
- 将称量舟置于水浴中，使透明壁面向换能器。确保称量舟足够深，使其与换能器齐平，但避免水进入称量舟内（图5A）。
- 如需要，可在胚胎或CAM血管上方增加其他装置，如显微镜或激光器（图5A）。
- 按第1.2、1.3或1.4节所述方法取出蛋内容物。但不要使用标准称量舟，而应使用一侧具有声学透明壁的定制称量舟。
- 从胚胎和CAM血管顶部进行无声学干扰的超声成像
- 在2 L烧杯中加入37 °C PBS。将500 mL烧杯倒置放入2 L烧杯底部。避免500 mL烧杯内有空气。
注意：500 mL烧杯用于将含蛋内容物的称量舟抬高至更接近PBS表面。通过替换不同尺寸的物体，可调节换能器与蛋内容物之间的距离。 - 将装有500 mL烧杯的2 L烧杯置于37 °C水浴中。
- 按第1.2、1.3或1.4节所述方法取出蛋内容物。
- 用37 °C PBS润湿蛋内容物，并用透明保鲜膜覆盖胚胎。此操作可保持胚胎位置固定，防止其旋转或漂浮。
注意：用PBS润湿蛋内容物可降低其黏性，便于用透明保鲜膜覆盖。 - 将含蛋内容物的称量舟放入90 mm直径培养皿中，并缓慢将培养皿浸入PBS中（图5B）。
注意：在培养皿两侧使用两个夹子相对固定，可更方便地浸入培养皿。 - 调整超声换能器至所需standoff距离。
- 在2 L烧杯中加入37 °C PBS。将500 mL烧杯倒置放入2 L烧杯底部。避免500 mL烧杯内有空气。
- 使用可移动换能器对鸡胚和CAM血管进行超声成像
- 按第1.2、1.3或1.4节所述方法取出蛋内容物。
- 在小玻璃烧杯中加热去离子水配制的2%琼脂糖溶液至80–95 °C，制备琼脂糖溶液。将溶解后的琼脂糖溶液置于流动冷水下冷却。
- 将琼脂糖溶液倒入平底容器中，制成约1 mm厚的琼脂糖垫。完全冷却凝固后，使用手术刀将其切割至所需尺寸。
注意：可调整琼脂糖垫厚度，以获得超声换能器正常工作所需的焦距。 - 将琼脂糖垫置于胚胎和CAM上方（图5C）。在琼脂糖垫顶部滴加数滴约30 µL的37 °C PBS，以在琼脂糖垫与换能器之间形成一层薄PBS层。
注意：使用PBS可防止换能器粘附于琼脂糖垫。例如，在使用电机机械移动二维换能器进行三维扫描时（图9B）11，此方法尤为有利。若无需移动换能器，PBS也可替换为超声耦合凝胶。 - 调整至所需的超声换能器位置。
- 从鸡胚和CAM血管侧面进行超声成像
结果
在此方案中，我们描述了三种在孵化第5至8天（HH 26-35）将蛋内容物从蛋壳中取出的方法22). 图6 显示从蛋壳中取出后置于称量舟中的蛋内容物。5日龄胚胎及尿囊绒毛膜（CAM）图6A) 采用1.2节所述方法取出。6天和7天的胚胎及CAM（图 6B, C) 采用1.3节所述方法取出。8日龄胚胎及CAM（图6D) 采用1.4节所述方法取出。未观察到出血或对胚胎及绒毛尿囊膜（CAM）造成损伤，表明这些方法可在不损害胚胎或CAM血管的情况下安全地将蛋内容物从蛋壳中取出。若操作得当，针对5日龄胚胎的方法在所有操作中可使90%的胚胎保持存活且CAM完整。存活率基于成功从蛋壳中完整提取的受精蛋总数。采用第二种方法处理孵化6天和7天的鸡蛋时，6日龄胚胎的存活率及CAM完整性约为75%，7日龄约为50%。采用第三种方法处理8日龄胚胎时，胚胎存活且CAM完整的概率约为60%。5日龄与8日龄胚胎之间可观察到发育阶段的差异，这与Hamburger和Hamilton的分期标准一致。22胚胎的大小和CAM血管的复杂性在发育过程中均逐渐增加（图6A- D). 图 6C 显示在卵内容物上方有一薄层琼脂糖，可利用所示的超声成像装置对胚胎和尿囊膜（CAM）进行成像 图5C取出蛋内容物后，胚胎的心跳可用肉眼观察到。这些胚胎的心率 体外孵化 胚胎与 在卵内 胚胎在第5天为183次/分钟（bpm），至第8天增至约208 bpm30. 保持湿润并置于 37 °C在实验性超声设置中，胚胎将维持此心率约5小时。
在前述三种方法的操作过程中可能会出现多种并发症。图7A 显示尿囊膜（CAM）下方存在 trapped air，这会使胚胎不适合进行超声成像，同时气泡的压力也可能损伤胚胎和/或尿囊膜。该问题通常发生在将蛋内容物从蛋壳中取出时，蛋壳内部的气室未能与外界空气连通所致。图7B 显示在图像右上方卵黄囊处有少量卵黄泄漏。这种情况可能在取出蛋内容物时发生，原因包括蛋壳的锋利边缘损伤卵黄囊，或镊子刺破卵黄囊。卵黄泄漏会影响胚胎及尿囊膜血管的可视性。图7C 显示一个尿囊膜下方 trapped air bubble 的胚胎，这种情况有时在胚胎发育过程中自然发生。另一种可能出现的并发症是血管损伤，这种损伤可能在取出蛋内容物时或注射操作过程中造成（图7D）。此外，胚胎和血管也可能随着时间推移而干燥（图7E），这通常是因为未向蛋内容物滴加 PBS 所致。胚胎干燥可导致大量毛细血管阻塞（图7F），从而影响胚胎的存活能力。此类严重的毛细血管阻塞也可能在胚胎发育过程中发生，或与胚胎心率不稳定有关。
在不损伤蛋壳的情况下取出蛋内容物后，可对胚胎注射例如微泡等超声造影剂（图3C）。图8 显示注射后微泡在血管腔内循环的情况。这些微泡随血流移动，并可在血液循环中持续存在数小时（补充视频 1）。微泡在循环系统中的存在使得开展多种类型的超声造影（CEUS）及药物递送实验成为可能7,11,12。鸡胚尿囊膜（CAM）是研究新型超声造影检测方法的理想模型，本文展示了三个示例。图9A 显示了6日龄鸡胚在注射微泡前后以B模式和CEUS模式采集的高频超声次谐波成像结果。实验中向CAM血管内注射5 µL超声造影剂，并使用配备MS250探头的临床前动物超声成像系统进行成像（发射频率30 MHz，接收频率15 MHz，输出功率10%）。在注射微泡前，B模式图像中已可在胚胎心脏内观察到一定对比信号（图9A-I）。这一现象源于鸟类红细胞含有细胞核，从而增强了超声成像中血液的对比度5,31。加入微泡后，胚胎在B模式和CEUS成像中的对比度和可见度均得到提升。图9B 展示了6日龄胚胎及其周围血管的光学图像与高频三维次谐波成像结果。实验中向CAM注射5 µL超声造影剂，并使用配备MS550s探头的临床前动物超声成像系统进行成像（发射频率40 MHz，峰值负压约300 kPa）。结果表明，结合造影剂的CEUS成像可用于生成高频三维次谐波图像，并实现胚胎外血管的可视化。图9C 展示了6日龄胚胎CAM微血管的光学图像与使用定制探头采集的超谐波血管内超声（IVUS）图像（发射频率26 MHz，接收频率39 MHz和65 MHz）。向CAM血管注射了4 ± 1 µL超声造影剂。光学图像与IVUS图像来自同一胚胎的相同感兴趣区域，显示了对应的血管网络结构。
鸡胚及CAM血管也可用于研究超声介导的药物递送，本文展示了一个示例。由于卵黄在成像过程中会阻碍光路，因此有必要去除卵黄囊，以便对鸡胚和CAM血管中的药物递送进行光学观察。本研究中，按照2.2节所述方法，将含有鸡胚和CAM的膜与卵黄囊分离，以制备用于显微成像的样本图4C）。在这些胚胎中，心率稳定在约80 bpm，当保持在特定条件下时，胚胎可存活长达2小时 37 °C7. 图10 展示了在CAM血管内皮细胞中进行的超声联合微泡介导的药物递送研究。使用α靶向血管壁的脂质包覆微泡vβ3-抗体并用荧光染料DiI染色7，被注射到CAM血管中（图10A, C）。CAM 血管内皮细胞的细胞核用 Hoechst 33342 染色（图10B）并使用模型药物碘化丙啶（PI）来观察声致穿孔现象7。这两种染料与微泡同时注射。在超声处理（1 MHz，200 kPa 峰值负压，单次脉冲1000个周期）后，可观察到靠近靶向微泡的细胞核出现PI摄取现象图10D这表明，超声诱导的靶向微泡振荡能够在内皮细胞膜上形成孔隙。
图 1．胚胎制备设备。（A-B）金属蛋托的俯视图和侧视图，（C-D）金属称量舟托架的俯视图和侧视图。（E-F）用于将蛋内容物从蛋壳中取出的镊子。比例尺单位为 cm。请点击此处查看该图的放大版本。
图 2．胚胎取出操作流程。（A）蛋顶部的小凹陷，由黑色圆圈标示。（B）位于蛋下方约 2/3 处的小凹陷，由黑色圆圈标示。（C）抽出约 2 mL 蛋清。（D）侧面用胶带封住的缝隙。（E）扩大蛋顶部的小开口。（F）去除部分蛋壳后，胚胎变得可见。（G–H）将蛋旋转 180° 后，胚胎上浮并逐渐不可见（箭头指示胚胎移动方向）。1–2 分钟后，从底部无法看到胚胎。（I）刮除膜后，蛋内容物落入称量舟中。请点击此处查看该图的高清版本。
图 3．将微泡注入 CAM 血管。（A）玻璃毛细移液针。比例尺单位为 cm。（B） 注射前吸取用的碘化丙啶（PI）溶液（左侧液滴）和微泡（右侧液滴）。右上角可见黑色轮廓标示的注射针 （C） 微泡注射。毛细针尖置于静脉管腔内（左图）。微泡（箭头所示白色云状物）被注入并随血流扩散（右图）。比例尺代表 1 mm。请点击此处查看该图的高清版本。
图 4．从卵黄囊中取出胚胎及绒毛尿囊膜（CAM），并放置于带有声学膜的支架上。（A） 带有琼脂糖层的声学膜支架。（B） 切割前置于称量舟中的鸡胚胎及CAM血管结构。虚线表示围绕CAM的切割线。（C） 已从卵黄分离并固定在声学膜上的鸡胚胎及CAM。（D） 固定好的鸡胚胎，其上覆盖带有声学和光学透明膜的支架（蓝色），该支架置于CAM上方。支架内可注入去离子水，以便使用浸水物镜。所有比例尺均为 1 cm。请点击此处查看该图的高清版本。
图 5．鸡胚及绒毛尿囊膜（CAM）超声成像的不同装置示意图。（A） 侧面超声成像装置。将鸡胚置于定制的称量舟中，称量舟一侧为声学透明壁，并将整个装置放入37 °C水浴中。超声换能器置于左侧（a）声学透明壁旁，激光器（b）用于上方的光声成像。（B） 顶部超声成像装置。鸡胚及绒毛尿囊膜浸没于盛有磷酸盐缓冲液（PBS）的烧杯中，烧杯置于37 °C水浴内。虚线轮廓显示外部为2 L玻璃烧杯（a），内部为500 mL玻璃烧杯（b）。（C） 配备可移动换能器的顶部超声成像装置。在鸡胚上方覆盖一层薄的琼脂糖垫（虚线所示），并在换能器与琼脂糖表面之间添加一层薄PBS作为耦合介质。请点击此处查看此图的放大版本。
图 6．离壳的卵内容物。(A) 孵育5天后从蛋壳中取出的卵内容物。图中标出了绒毛尿囊膜（CAM）、胚胎体（EB）、前部和后部卵黄静脉（*）以及合适的注射位点（箭头）。(B) 孵育6天后从蛋壳中取出的卵内容物。图中标出了前部和后部卵黄静脉（*）以及合适的注射位点（箭头）。(C) 孵育7天后从蛋壳中取出的卵内容物。顶部放置了一块琼脂糖凝胶，以便进行超声成像。琼脂糖凝胶的四个角用黑色圆圈标出。(D) 孵育8天后从蛋壳中取出的卵内容物。所有比例尺均为1 cm。请点击此处查看该图的高清版本。
图 7．鸡胚及绒毛尿囊膜（CAM）模型实验过程中可能出现的并发症。（A） 采用方法1.2（5日龄胚胎）或1.3（6至7日龄胚胎）将蛋内容物从蛋壳中取出时，绒毛尿囊膜下方 trapped 的气泡。（B） 右上角箭头所示的少量卵黄泄漏（6日龄胚胎）。（C） 绒毛尿囊膜下方 trapped 的空气，由黑色虚线圈标示（7日龄胚胎）。（D） 黑色箭头所示的出血现象（5日龄胚胎）。（E） 胚胎及绒毛尿囊膜干燥（5日龄胚胎）。（F） 大范围毛细血管阻塞（5日龄胚胎）。所有比例尺均为 1 cm。请点击此处查看该图的放大版本。
图 8. CAM 血管中的微泡。 血管壁以虚线标示，单个微泡以箭头指示。比例尺代表 20 µm。相应的显微镜录像见补充视频 1。请点击此处查看该图的放大版本。
图 9。鸡胚及尿囊膜血管的对比增强超声成像。(A) 6日龄鸡胚（顶部覆盖琼脂糖块）的B模式（I, III）和实时次谐波（II, IV）图像的最大强度投影（使用MS250探头的小动物临床前超声仪，发射频率30 MHz，接收频率15 MHz，输出功率10%）。上方图像（I, II）为注射5 µL超声对比剂前的结果，下方图像（III, IV）为注射后的结果。比例尺为1 mm。本图经Daeichin等201511许可修改。(B) 6日龄鸡胚（顶部覆盖琼脂糖块）的光学图像（左）与三维次谐波成像（右）。向尿囊膜血管注射5 µL超声对比剂，并使用高频探头进行成像（使用MS550s探头的小动物临床前超声仪，发射频率40 MHz，峰值负压约300 kPa，在小动物临床前超声仪的3D模式下重建）。比例尺为5 mm。本图经Daeichin等201511许可修改。(C) 6日龄鸡胚尿囊膜微血管的光学图像（左）与超谐波血管内超声（IVUS）的平均强度投影（右）。向尿囊膜血管注射4 ± 1 µL对比剂，使用定制IVUS探头进行超谐波IVUS成像（发射频率35 MHz，峰值负压600 kPa）。两幅图像来自同一胚胎的相同兴趣区域。箭头指示两图中对应的血管。比例尺为1 mm。本图经Maresca等201412许可修改。请点击此处查看该图的放大版本。
图 10．药物递送至 6 日龄胚胎中 CAM 血管内皮细胞。(A) 超声处理前，六个靶向 αvβ3 的微泡（白色箭头指示）黏附于血管壁的明场图像。(B) 超声处理前，内皮细胞核的荧光染色图像。(C) 超声处理前，靶向微泡的荧光图像（白色箭头指示）。(D) 超声处理后（1 MHz，200 kPa 峰值负压，单次脉冲持续 1000 个周期），模型药物碘化丙啶（PI）被靶向微泡下方的细胞核摄取。比例尺为 10 µm，适用于所有图像。本图经 Skachkov 等人 20147 许可修改。 请点击此处查看此图的放大版本。
补充文件
补充视频 1. 鸡胚尿囊膜血管中的微泡。 比例尺为 20 µm。请点击此处下载该视频。
讨论
本方案介绍了三种获取和使用5至8日龄鸡胚及其绒毛尿囊膜（CAM）作为体内 模型来研究对比增强超声成像和微泡介导药物递送的方法。取出5日龄（第1.2节）和6至7日龄（第1.3节）鸡胚时最关键的步骤是：1）在蛋壳顶部开一个小孔，穿透整个蛋壳进入气室，然后再抽取蛋清；2）在蛋壳上开一个大窗口时，需形成光滑的边缘。对于取出8日龄鸡胚的方法（第1.4节），最关键的步骤是：1）制作足够数量的压痕，以便沿蛋壳形成整齐的裂纹；2）保持蛋体浸没在PBS中。为确保所有方法中鸡胚的存活率，必须将蛋及其内容物维持在37 °C。此外，应避免将物质注射到CAM的动脉中。建议在实验过程中通过视觉监测鸡胚的心率，以确保其生命活力。为确认鸡胚确切的发育阶段，可参考Hamburger & Hamilton22 的分期标准。
必须防止对胚胎、绒毛尿囊膜（CAM）和卵黄囊造成损伤。此类损伤可能影响胚胎和CAM的存活能力、血流状况以及可视性。此外，卵黄囊受损会导致膜的刚性降低，从而使向CAM血管内注射成为不可能。5日龄胚胎的气室相对较小，因此为了能够打开蛋壳上足够大的孔以移除蛋内容物，需要先抽出2 mL的蛋清。这样可在蛋壳与胚胎之间创造更多空间。抽出蛋清后，需用胶带封闭针头穿刺的孔洞。如果仍有蛋清渗出，应再贴一块胶带。此外，在侧面的孔洞上贴胶带可在蛋内形成负压，从而在步骤1.2.2.8中打开大孔时，防止蛋内容物因自身重量而掉落。当蛋壳边缘过于锋利，或在将蛋内容物倒入称重皿时操作过于剧烈时，也可能造成胚胎或CAM的损伤，因此操作时应使蛋壳尽量贴近称重皿。在胚胎发育的第5至第6天期间，CAM开始附着于壳膜32。这种附着增加了在取出蛋内容物时损伤胚胎和CAM的风险。通过在向蛋内注射PBS后打开6至7日龄孵育的鸡蛋，或将8日龄孵育的鸡蛋置于盛有PBS的容器中再打开，可降低损伤风险。关于向CAM静脉注射：若首次注射失败，且损伤较轻微，可在同一静脉的上游位置进行第二次注射；也可选择另一条CAM静脉进行注射。将胚胎和CAM与卵黄分离后，胚胎和CAM的血管会变得光学透明。但由此导致胚胎失去了主要的营养来源33。这种营养缺失可能是观察到分离后胚胎心率下降至80 bpm（相比之下，仍与卵黄接触的6日龄胚胎心率约为190 bpm）30 以及分离操作后存活时间缩短至2小时的原因之一。另一个可能影响心率降低和存活时间缩短的因素是难以维持分离卵黄后的胚胎和CAM血管处于37 °C的环境。使用显微镜载物台培养箱可能有助于维持温度。此外，CAM从卵黄脱离后，组织可能发生机械性变化，因为膜张力会降低。膜张力的降低可能导致血管内壁剪切速率升高，从而引起心率下降。
鸡胚的 ex ovo 模型及CAM血管作为体内模型存在一些局限性，例如仅能进行短时间观察，限制了其在增强超声成像和微泡介导药物递送研究中的应用。由于第5天的血容量仅为100±23 µL，第6天为171±23 µL34，因此最大注射体积约为5 µL。在发育的后期阶段（第7天及以上），血管刚性增加，卵黄弹性下降，这可能导致在较老的胚胎中成功注射更加困难。一旦注射微泡，它们可在体内循环数小时，因为在此阶段鸡胚尚未发育完全的免疫系统35。因此，微泡不会像在人体中那样在约6分钟内被清除36,37 ，使得典型的超声分子成像研究中所需的5–10分钟等待未结合的靶向微泡被清除的步骤无法实现38 。为了实现微泡的靶向，需要使用能够结合禽类内皮细胞的合适配体，例如先前报道的针对血管生成标志物αvβ3的配体7。使用该模型时还需考虑其他因素，包括在较老的胚胎（> 8天）中将胚胎和CAM血管从卵黄分离的难度增加，以及与人类相比更低的红细胞压积（约20%）39 。后者可能影响微泡的振荡行为，因为已知在黏度更高的环境中微泡振荡会受到抑制40。CAM动脉的氧合程度低于CAM静脉41,42。当研究血氧饱和度的光声成像时，应考虑这一差异。
本文所述方法允许在超声成像或药物递送研究当天（通常为孵化第5至第8天）将鸡胚内容物从蛋壳中取出。这与现有方法不同，现有方法是在孵化3天后即将内容物取出蛋壳，并继续进行ex ovo 培养18,20,21。本方法的优势包括：孵化5天、6天、7天和8天的鸡蛋在取出后存活率分别达到90%、75%、50%和60%，相比之下，孵化3天后取出蛋壳并继续ex ovo培养的胚胎存活率约为50%1,18 ；培养过程中无需使用抗生素18,20 ；且无需大型无菌培养箱进行ex ovo培养。6至8天龄胚胎的存活率较低，原因是绒毛尿囊膜（CAM）开始附着于蛋壳21 ，导致在取出过程中CAM膜更容易破裂。本文还描述了将胚胎及CAM与卵黄分离的方法，从而使胚胎和CAM在光学上呈现透明状态。
通过将蛋内物质置于不同的实验装置中，鸡胚及其绒毛尿囊膜（CAM）可用于多种超声成像研究，包括二维和三维条件下的血管内超声（IVUS）、光声成像，以及使用或不使用超声造影剂的成像。研究重点可放在开发新型超声脉冲方案或测试新型换能器上。此外，该模型还可用于研究新型超声造影剂及其在血流条件下血管内的行为。由于微泡介导的药物递送机制尚未明确43，使用 体内 CAM 模型有助于通过研究微泡行为与细胞反应之间的关系来阐明其作用机制。最后，CAM 血管已被证实是研究异种移植肿瘤移植的合适体系。44这使得利用CAM血管作为模型成为可能，可用于通过超声成像研究肿瘤，以及通过对比增强超声（CEUS）研究肿瘤内部的血流情况。肿瘤通常移植于8至9日龄胚胎的CAM血管上。1,14,45，其中的胚胎 在孵化第3天从蛋壳中取出并继续发育 体外本方案中所述方法可用于胚胎的培养 在卵内 直到肿瘤发生的当天 嫁接
作者相信，本文将对希望利用鸡胚及其绒毛尿囊膜（CAM）作为对比剂应用和血流研究的体内 模型的研究人员有所帮助。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由荷兰科学研究组织（NWO）下属的应用与工程科学部门（TTW）（Vidi项目17543）资助。作者谨此感谢来自荷兰鹿特丹伊拉斯姆斯医学中心生物医学工程系的Robert Beurskens、Luxi Wei和Reza Pakdaman Zangabad，以及实验医学仪器系的Michiel Manten和Geert Springeling在技术方面提供的支持。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 琼脂糖 | Sigma-Aldrich | A9539 | |
| 止血钳（Kocher钳） | |||
| 保鲜膜 | |||
| 带声学膜的支架（CLINIcell 25 cm²） | MABIO，法国图尔宽 | CLINIcell25-50-T FER 00106 | |
| 去离子水 | |||
| 一次性塑料巴斯德吸管 | VWR | 612-1747 | |
| 鸡蛋 | 荷兰Drost Pluimveebedrijf Loenen BV | 新鲜受精卵 | |
| 15 °C 冰箱 | |||
| 玻璃毛细注射针 | Drummond | 1-000-1000 | 内径：0.0413 英寸 |
| 37 °C 加热板 | |||
| 37 °C 湿化培养箱 | |||
| 昆虫标本针 | |||
| 金属蛋托 | 由伊拉斯谟医学中心实验医学仪器部门定制。见图1 A、B | ||
| 金属称量舟支架 | 由伊拉斯谟医学中心实验医学仪器部门定制。见图1 C、D | ||
| 显微注射系统 | FUJIFILM VisualSonics | ||
| 矿物油 | Sigma-Aldrich | M8410-100ML | |
| 针头，19 G | VWR (TERUMO) | 613-5392 | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS），1× | ThermoFisher | 10010023 | |
| 培养皿，1 L | 玻璃材质 | ||
| 培养皿，90 mm 直径 | VWR | 391-0559 | |
| 临床前动物超声成像系统（Vevo 2100） | FUJIFILM VisualSonics | ||
| 探头（MS250） | FUJIFILM VisualSonics | 发射频率30 MHz，接收频率15 MHz | |
| 探头（MS550s） | FUJIFILM VisualSonics | 发射频率40 MHz | |
| 手术刀 | VWR (SWANN-MORTON) | 233-5363 | |
| 小型剪刀 | 精细科学工具（FST） | 14558-09 | |
| 注射器，5 mL | VWR (TERUMO) | 613-0973 | |
| 汤匙 | |||
| 胶带（Scotch Magic 胶带） | Scotch | ||
| 纸巾 | Tork | ||
| 大镊子 | VWR (USBECK Laborgeräte) | 232-0107 | 见图1E |
| 小镊子 | DUMONT Medical，瑞士 | 0103-5/45 | 见图1F |
| 超声造影剂（定制F型） | 制备方法见：Daeichin, V. 等. Microbubble Composition and Preparation for Imaging: In Vitro and In Vivo Evaluation. IEEE TRANSACTIONS ON ULTRASONICS. 64 (3), 555–567 (2017)。 | ||
| 超声造影剂（MicroMarker） | FUJIFILM VisualSonics, Inc. | ||
| 超声造影剂（Definity） | Lantheus Medical Imaging，美国 | ||
| 超声耦合凝胶 | Aquasonic | ||
| 石蜡膜（Parafilm） | Parafilm | ||
| 称量舟（85 × 85 × 24 mm） | VWR | 611-0094 |
参考文献
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