利用快速定量的鸡胚尿囊膜活体模型发现转移调控因子

摘要

这是一种用于筛选癌症转移抑制因子或驱动因子的有效方法。将携带表达文库的细胞注入鸡胚尿囊膜血管系统，以形成转移性克隆。对侵袭能力降低或增强的克隆进行分离、扩增，并重新注射以确认其表型，最后通过高通量测序进行分析。

摘要

近期癌症研究的进展揭示了癌症转移过程的高度复杂性。已发现多个基因或基因网络会根据癌症类型、组织以及个体患者的特征，差异性地调控癌症转移级联过程中的基因及其产物。这些基因和基因网络可能成为基因治疗和个体化医疗策略中的重要靶点。开发快速筛选平台对于识别这些遗传靶标至关重要。

鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）是一种富含胶原、高度血管化的膜状结构，位于蛋壳下方，可支持发育中胚胎的气体交换。由于CAM所处的位置及其丰富的血管化特征，我们将其开发为一种活体人源癌症转移模型，该模型可实现高效的人癌细胞异种移植，并能够对癌细胞与富含胶原的基质及脉管系统之间的相互作用进行实时成像。

利用该模型，我们设计了一个定量筛选平台，用于鉴定癌症转移的新驱动因子或抑制因子。我们将携带完整人类基因组shRNA基因文库的头颈部HEp3癌细胞以低密度注射到绒毛尿囊膜（CAM）血管系统中。细胞增殖后形成单个肿瘤细胞克隆。那些无法侵入CAM组织的克隆表现为紧凑的克隆表型，肉眼可见，可被切除并用于鉴定细胞中转导的shRNA。通过分析单个克隆的图像评估其侵袭能力。经过多轮筛选以降低假阳性率。单个分离的癌细胞克隆或新构建的表达目的基因的克隆则进一步进行原发性肿瘤形成实验或癌细胞血管共选项分析。综上所述，我们提出了一种快速筛选平台，可用于抗转移靶点的鉴定以及对动态且复杂的生物学事件级联过程进行活体分析。

引言

转移是癌症患者死亡的主要原因^1,2,3。转移性癌细胞在转移级联反应的五个步骤中，根据癌症类型的不同而利用不同的信号通路：局部侵袭、内渗、在循环系统中存活、外渗以及在远端转移部位形成克隆扩增。目前对这一转移过程的理解表明，其中存在两个瓶颈步骤：其一是癌细胞从原发肿瘤向特定方向侵袭，其二是远端转移病灶的建立^4,5,6。这两个步骤均要求癌细胞与初始侵袭部位或远端转移病灶形成部位的胶原和血管系统发生主动相互作用。因此，转移性癌细胞必须能够黏附于细胞、重塑胶原纤维，并沿血管壁进行定向侵袭⁷。建立能够快速识别抗转移治疗靶点的筛选模型，以阻止癌细胞完成这些步骤，具有极高的重要性。体外筛选模型无法完全模拟复杂的活体组织环境，而小鼠模型则成本高昂且耗时。因此，迫切需要能够提供复杂活体组织环境并实现靶点快速识别的活体筛选平台。

近十年来，鸡胚已被确立为研究人类癌症转移的一种稳健且经济高效的模型^8,

方案

所有实验均按照阿尔伯塔大学机构动物护理与使用委员会的规定和指南进行。许多研究机构认为禽类胚胎不属于活体动物，因此无需动物实验方案审批。然而，普遍观点认为禽类胚胎能够感受疼痛，因此必须尽可能人道地对待。在开展任何研究工作之前，必须联系当地的动物研究管理机构，以确保遵守相关规定。

1. 无壳蛋培养

1. 从当地供应商获取受精的鸡卵。本实验使用白来航鸡（White Leghorn）品种，但也可使用其他品种。
   注意：建议额外多获取10%的鸡蛋，以防部分胚胎在破壳过程中受损而无法用于本实验方案。
2. 将所需数量的鸡蛋转移至湿度为60%的摇动式孵化箱中。剩余鸡蛋可在12 °C条件下储存最多两周，且不会丧失活力。
3. 在加湿的摇动式孵化箱中孵育鸡蛋四天。
   注意：第1天指将鸡蛋转移至摇动式孵化箱的当天。
4. 准备用于无壳卵培养的称量皿和塑料盖。将每个称量皿的一个角剪去，以确保胚胎获得有效的空气供应（图1A）。
5. 在超净工作台内将准备好的称量皿按行排列（图1B）。
6. 在另一个称量皿中准备70%乙醇用于鸡蛋冲洗。
7. 将鸡蛋短暂浸入70%乙醇中，然后使用电动旋转工具，在鸡蛋最大纬向直径处平行地小心切割四道2–3 mm的切口（

结果

若大多数滞留在毛细血管中的细胞呈单个分布，且彼此之间相隔一定距离（约0.05–0.1 cm），则表明癌细胞注射成功，这样在孵育5–6天后形成的克隆不会发生重叠（图3A）。如果在多数毛细血管中可见癌细胞堆积，则表明注射未成功，此类胚胎应予以弃用（图2E）。大量注射后的癌细胞在注射后24小时内会死亡，导致部分胚胎看似完全排斥了癌细胞。癌细胞的存活率可能因本地鸡蛋供应商的不同而有所差异（即所需注射的细胞数量可能需要调整），我们强烈建议在正式开展实验前，先确定最佳注射条件（癌细胞浓度与注射持续时间）。我们推荐的细胞浓度范围为0.5 × 10⁶ 至 1.0 × 10⁶ 个细胞/mL。当达到最佳细胞浓度和注射时间后，注射后第5天的转导细胞应产生多种多样的克隆表型，其中大多数克隆应表现为侵袭性，即癌细胞在绒毛尿囊膜（CAM）组织中呈弥散分布（图3A）。应特别关注那些.......

讨论

本文介绍了一种基于快速荧光显微镜的活体筛选方案，可用于基因筛选或药物候选物筛选等重要应用。通过鸡胚尿囊膜（CAM）模型，可对转导了特定基因文库或转染了单个表达载体的癌细胞进行快速筛选，并定量分析其目标表型。由于转导或转染方案因文库类型不同而存在显著差异，因此本方案未包含相关步骤。将表型相关的转移性克隆从尿囊膜上切除后进行扩增，并提取DNA用于高通量测序，以鉴定目标表达载体。通常，每种基因文库均配备有相应的引物序列及基因组DNA纯化推荐方法。我们建议遵循本地实验设施的指导原则，以获得最佳的高通量测序结果。

建议在筛选前确定文库和细胞系的最佳感染复数（M.O.I.）。理想情况下，每个细胞（即未来的转移性克隆）应仅含有一个基因表达载体，但根据我们的经验，这并不总是能够实现。我们建议遵循文库生产商提供的方案，并测试较宽范围的 M.O.I.（0.01–5），以尽可能接近 1。每个转移性克隆内若存在多个文库表达载体，可能会显著增加克隆表型分析的复杂性。我们还建议在实验中使用文库生产商提供的阴性对照（例如，表达荧光标记的乱序 shRNA 的载体）。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1 mL 一次性注射器	BD	BD309659
15 mL 圆锥形离心管	Corning	CLS430791-500EA
18 号 × 1 1/2 BD 精密针头	BD	BD305196	我们使用 1.2 mm × 40 mm 的针头，也可根据需要选用更短的针头
2.5% 胰蛋白酶溶液	多个供应商可提供
4T1 小鼠乳腺癌细胞	ATCC	CRL-2539
B16F10 小鼠黑色素瘤细胞系	ATCC	CRL-6475
台式离心机	多个供应商可提供		任何适用于细胞沉淀的 TC 兼容离心机均可使用
圆形盖玻片，22 mm	Fisher Scientific	12-545-101
胶原酶	Sigma	C0130-100MG
共聚焦显微镜			我们使用 Nikon A1r
棉签	多个供应商可提供		使用前必须灭菌
适用于所用细胞系的培养基	多个供应商可提供		我们使用 DMEM 加 10% FBS 培养基培养 HT1080、HEp3 和 B16 细胞系
孵蛋器	多个供应商可提供		所需具体型号取决于筛选规模。可选供应商包括美国佐治亚州萨凡纳的 MGF Company Inc. 或加利福尼亚州丘拉维斯塔的 Lyon Electric Company Inc.
1.5 mL 离心管	Sigma	T4816-250EA
受精白来航鸡蛋	任何本地供应商
精细镊子	多个供应商可提供		使用前必须灭菌
血细胞计数板	Millipore-Sigma	MDH-4N1-50PK
HT1080 人纤维肉瘤细胞系	ATCC	CCL-121
图像分析软件			我们使用 Nikon Elements
与荧光素或罗丹明偶联的植物凝集素 Lens Culinaris 凝集素（LCA）	Vector Laboratories	RL-1042, FL-1041	根据显微镜灵敏度将原液（5 mg/mL）稀释 50–100 倍。所用荧光颜色必须与用于筛选的细胞系颜色不同
MDA-MB-468 人乳腺癌细胞	ATCC	HTB-132
PBS（1×）	多个供应商可提供
塑料称重皿	Simport	CA11006-614	尺寸为 78×78×25 mm；多个其他供应商可提供
小型手术剪刀	多个供应商可提供		使用前必须灭菌
硼硅酸钠玻璃毛细管，外径 1.0 mm，内径 0.58 mm，长度 10 cm	Sutter Instrument	BF100-58-10
方形培养皿（用作称重皿的盖子）	VWR	CA25378-115	尺寸为 100×100×15 mm；多个其他供应商可提供
体视荧光显微镜			我们使用 Zeiss Lumar v12
Tygon R-3603 实验室管路	Cole-Parmer	AAC00001	内径 1/32 英寸，外径 3/32 英寸，壁厚 1/32 英寸
U-118 MG 人胶质母细胞瘤细胞	ATCC	HTB-15
U-87 MG 人胶质母细胞瘤细胞	ATCC	HTB-14
垂直移液管拉制仪	多个供应商可提供		我们使用 David Kopf Instruments（美国加利福尼亚州图洪加），型号 720