这是一种用于筛选癌症转移抑制因子或驱动因子的有效方法。将携带表达文库的细胞注入鸡胚尿囊膜血管系统，以形成转移性克隆。对侵袭能力降低或增强的克隆进行分离、扩增，并重新注射以确认其表型，最后通过高通量测序进行分析。
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摘要
摘要
近期癌症研究的进展揭示了癌症转移过程的高度复杂性。已发现多个基因或基因网络会根据癌症类型、组织以及个体患者的特征，差异性地调控癌症转移级联过程中的基因及其产物。这些基因和基因网络可能成为基因治疗和个体化医疗策略中的重要靶点。开发快速筛选平台对于识别这些遗传靶标至关重要。
鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）是一种富含胶原、高度血管化的膜状结构，位于蛋壳下方，可支持发育中胚胎的气体交换。由于CAM所处的位置及其丰富的血管化特征，我们将其开发为一种活体人源癌症转移模型，该模型可实现高效的人癌细胞异种移植，并能够对癌细胞与富含胶原的基质及脉管系统之间的相互作用进行实时成像。
利用该模型，我们设计了一个定量筛选平台，用于鉴定癌症转移的新驱动因子或抑制因子。我们将携带完整人类基因组shRNA基因文库的头颈部HEp3癌细胞以低密度注射到绒毛尿囊膜（CAM）血管系统中。细胞增殖后形成单个肿瘤细胞克隆。那些无法侵入CAM组织的克隆表现为紧凑的克隆表型，肉眼可见，可被切除并用于鉴定细胞中转导的shRNA。通过分析单个克隆的图像评估其侵袭能力。经过多轮筛选以降低假阳性率。单个分离的癌细胞克隆或新构建的表达目的基因的克隆则进一步进行原发性肿瘤形成实验或癌细胞血管共选项分析。综上所述，我们提出了一种快速筛选平台，可用于抗转移靶点的鉴定以及对动态且复杂的生物学事件级联过程进行活体分析。
引言
转移是癌症患者死亡的主要原因1,2,3。转移性癌细胞在转移级联反应的五个步骤中，根据癌症类型的不同而利用不同的信号通路：局部侵袭、内渗、在循环系统中存活、外渗以及在远端转移部位形成克隆扩增。目前对这一转移过程的理解表明，其中存在两个瓶颈步骤：其一是癌细胞从原发肿瘤向特定方向侵袭，其二是远端转移病灶的建立4,5,6。这两个步骤均要求癌细胞与初始侵袭部位或远端转移病灶形成部位的胶原和血管系统发生主动相互作用。因此，转移性癌细胞必须能够黏附于细胞、重塑胶原纤维，并沿血管壁进行定向侵袭7。建立能够快速识别抗转移治疗靶点的筛选模型，以阻止癌细胞完成这些步骤，具有极高的重要性。体外筛选模型无法完全模拟复杂的活体组织环境，而小鼠模型则成本高昂且耗时。因此，迫切需要能够提供复杂活体组织环境并实现靶点快速识别的活体筛选平台。
近十年来，鸡胚已被确立为研究人类癌症转移的一种稳健且经济高效的模型8,9,10,11,12。鸡胚的绒毛尿囊膜（CAM）组织薄而半透明，非常适合对原发性肿瘤和/或转移灶中细胞及细胞集落的行为进行活体显微成像12。将多种人类癌细胞系微量注射至CAM组织后，仅需数天即可启动原发性肿瘤的生长并发生转移。癌细胞可通过多种方式接种于CAM组织，包括静脉注射、CAM内注射或胶原基质移植，这种灵活性使研究人员能够针对癌症进展的特定阶段开展研究，例如转移灶的形成、癌细胞从原发肿瘤向外侵袭或血管生成。
本文描述了一种定量筛选平台，可用于评估癌细胞形成侵袭性转移病灶的能力。将已转导表达文库的癌细胞以低密度经静脉注射至鸡胚尿囊膜（CAM）血管系统中。转移性克隆形成持续4-5天后，对所形成的克隆的侵袭能力及其与血管系统的相互作用进行评估。对于未能侵袭的单个克隆，将其切除、扩增，并通过再次注射至CAM中，定量分析克隆致密性及癌细胞与血管接触情况，以确认其表型。通过高通量测序分析分离克隆的基因组DNA，可鉴定出导致单个转移性克隆突变表型的表达文库载体。该平台还可进一步用于验证基因与所观察表型之间的因果关系，或对所观察表型开展深入的机制研究。
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方案
所有实验均按照阿尔伯塔大学机构动物护理与使用委员会的规定和指南进行。许多研究机构认为禽类胚胎不属于活体动物，因此无需动物实验方案审批。然而，普遍观点认为禽类胚胎能够感受疼痛，因此必须尽可能人道地对待。在开展任何研究工作之前，必须联系当地的动物研究管理机构，以确保遵守相关规定。
1. 无壳蛋培养
- 从当地供应商获取受精的鸡卵。本实验使用白来航鸡（White Leghorn）品种，但也可使用其他品种。
注意：建议额外多获取10%的鸡蛋，以防部分胚胎在破壳过程中受损而无法用于本实验方案。 - 将所需数量的鸡蛋转移至湿度为60%的摇动式孵化箱中。剩余鸡蛋可在12 °C条件下储存最多两周，且不会丧失活力。
- 在加湿的摇动式孵化箱中孵育鸡蛋四天。
注意：第1天指将鸡蛋转移至摇动式孵化箱的当天。 - 准备用于无壳卵培养的称量皿和塑料盖。将每个称量皿的一个角剪去，以确保胚胎获得有效的空气供应（图1A）。
- 在超净工作台内将准备好的称量皿按行排列（图1B）。
- 在另一个称量皿中准备70%乙醇用于鸡蛋冲洗。
- 将鸡蛋短暂浸入70%乙醇中，然后使用电动旋转工具，在鸡蛋最大纬向直径处平行地小心切割四道2–3 mm的切口（图1C）。
- 将切割后的鸡蛋转移至称量皿中，并轻轻将鸡蛋压向皿底，直至蛋壳出现裂纹（图1D）。
- 将蛋壳两半分开，使胚胎滑入称量皿中。丢弃蛋壳，并用盖子盖上称量皿。
- 将胚胎转移至加湿的非摇动式孵化箱中（图1E）。
注意：含胚胎的称量皿应放入独立的塑料容器中（每容器12个胚胎）。这有助于提高胚胎存活率，并便于按实验需求组织胚胎。 - 继续孵育胚胎6天（直至第10天）。每天检查死亡或受污染的胚胎，并将其从孵化箱中移除。
注意：胚胎可能被空气中的霉菌孢子污染。霉菌污染最初表现为胚胎绒毛尿囊膜（CAM）表面出现白色斑点。一旦发现污染胚胎应立即移除，并每周用70%乙醇擦拭孵化箱内部以防止污染。根据我们的经验，污染率极低，约为1–3%。 - 在第10天上午使用这些胚胎进行癌细胞注射。
2. 注射用癌细胞的制备
注意：转移性克隆的筛选基于荧光癌细胞所建立的表型，这些细胞来源于带有绿色或红色荧光蛋白等荧光蛋白标记的表达文库或载体（参见图2A中的完整筛选流程）。不建议使用瞬时转染荧光蛋白的细胞或用细胞通透性荧光染料标记的细胞，因为癌细胞增殖会导致信号迅速衰减，且染色不均。
- 在注射时将癌细胞培养至60-70%汇合度。使用更高汇合度的癌细胞会降低其活力，导致转移性克隆形成效率低下。确保所用癌细胞无支原体污染，因为支原体污染可能导致鸡胚活力下降。
- 用1×PBS（pH 7.4）清洗细胞两次。吸除残留PBS后，加入0.5%胰蛋白酶-EDTA，于37 °C孵育2-5分钟，直至所有细胞从培养皿表面脱落。
- 将细胞悬液转移至15 mL锥形管中，在室温下以200 × g离心5分钟。
- 用10 mL PBS重悬细胞，并按步骤2.3再次离心，以去除胰蛋白酶及其他培养基成分（如抗生素）。
注意：癌细胞悬液中若存在胰蛋白酶或抗生素等细胞培养成分，可能导致鸡胚活力下降。 - 小心吸除上清液，用1 mL冰浴PBS重悬细胞。
- 使用血细胞计数板或任何其他可用的细胞计数设备对细胞进行计数。
注意：本筛选方案要求每个转移性克隆均由单个细胞启动。计数时应确保细胞已完全被胰蛋白酶消化，并以单细胞悬液形式存在（无细胞团块）。 - 用于静脉（IV）注射时，将细胞浓缩至0.5 × 106 至 1.0 × 106 个细胞/mL。使用冰浴的1×PBS进行稀释或重悬细胞浓缩液。预计每10个鸡胚需要约1 mL细胞悬液。
注意：细胞悬液所需浓度主要取决于实验操作者的经验水平。详情请参见下一节。
3. 癌细胞静脉注射以形成转移性克隆
注意：按照本方案，一天内最多可注射上百个胚胎。通常，分离转移性克隆（步骤5）所需时间比注射癌细胞更长，因此建议先进行初步实验，以估算完成所有步骤所需的时间。使用不同荧光标记的癌细胞有助于减少动物使用数量和每次实验所需时间。例如，对照细胞可用RFP（红色荧光蛋白）标记，而突变肿瘤细胞则可用GFP（绿色荧光蛋白）标记。在这种情况下，每次实验均自带对照，可校正胚胎间的个体差异。
- 按照图2B所示组装注射装置。首先将针头安装到注射器上，然后用一段长3-5 cm的软管延长注射器针头。
- 使用精细镊子折断硼硅酸盐针头的尖端（直径约20-60 µL）。
- 用癌细胞悬液（50-200 µL）填充注射器，并将硼硅酸盐针头插入软管中（图2B）。
- 检查硼硅酸盐针头是否发生细胞堵塞或存在气泡。为确保每个转移性克隆均由单个细胞启动，必须以单细胞悬液形式注射细胞。
注意：癌细胞在胰蛋白酶消化后1-2小时内易在PBS中发生聚集，因此应在注射前立即制备细胞悬液。如有必要，可使用用于注射的1 mL注射器（不带硼硅酸盐针头）定期重悬细胞。 - 若毛细管内出现细胞堵塞，应取下毛细管，重新悬浮细胞，并更换新的毛细管。使用推杆排出所有气泡。若未观察到细胞堵塞或气泡，则进入下一步。
- 移除培养皿盖，将胚胎转移至体视显微镜下。在CAM表面识别合适的静脉进行注射。静脉和动脉在CAM组织中形成复杂的网络结构（图2C）。静脉因携带富氧血液供给胚胎而呈现较亮的红色，可据此加以区分。
注意：对于常规胚胎操作、癌细胞注射及转移性克隆切除，建议使用配备0.8x和1.5x物镜以及10x目镜的荧光体视显微镜进行观察。根据操作者的经验水平，也可成功使用性能较低的显微镜。读者可联系作者获取更详细的建议。 - 选择理想的注射静脉，其直径通常仅比硼硅酸盐针头尖端宽10-20%，且位于胚胎与称量皿壁之间的中点位置。一般在静脉分叉点附近进行注射更为容易。
注意：虽然向较大静脉注射看似更容易，但会导致大量出血并降低胚胎存活率。 - 将针头尖端抵住血管壁，并沿血流方向施加轻柔压力。如有需要，可用另一只手持棉签辅助固定或稳定待注射的血管。
- 轻柔推动注射器推杆。当癌细胞悬液进入血流时，可通过观察血管出现"变清"的现象来判断注射是否成功。
- 持续推动注射器推杆2-10秒，直至将所需体积的悬液注入静脉血流中。总体而言，单个胚胎的注射过程可能需要1-10分钟，具体时间取决于操作者的熟练程度。若注射部位出现大量出血或透明液体积聚，则应弃用该胚胎。
注意：容易对胚胎造成"过度注射"。应牢记的一般原则是：在培养4-5天后，转移性克隆之间不应相互接触。理想情况下，成功注射后约有5-10%的终末CAM静脉毛细血管中应有细胞滞留（图2D,E）。如步骤2所述，可使用不同浓度的细胞悬液（0.5 x 106 - 1.0 x 106 个细胞/mL）。较低浓度需要更长的注射时间，但可减少针头堵塞；较高浓度可缩短注射时间，但会增加针头堵塞的风险。建议尝试多种浓度，以确定最适合操作者使用的浓度。通常优先选择较高浓度（1.0 x 106 个细胞/mL），以缩短注射时间。 - 将针头从CAM中取出，并用棉签轻轻擦拭注射部位，去除残留血液或多余的癌细胞。
- 用盖子盖好称量皿中的胚胎，并将注射后的鸡胚放回培养箱中继续培养。
- 对下一个胚胎重复上述操作，直至所有胚胎均完成注射。
4. 转移性克隆生长期间的胚胎维持
- 肉眼观察胚胎。若发现任何已死亡，或被细菌或霉菌污染的胚胎，应将其从培养箱中移除，随后按照实验室废弃物处理规程进行高压灭菌并丢弃。
注意：建议每隔一天（注射癌细胞后的第1、3、5天）检查一次胚胎，以观察转移性克隆的生长情况。避免不必要的胚胎移动，以免造成胚胎损伤或死亡。 - 若细胞出现过度生长（转移性克隆相互重叠）或在CAM组织内分布不均（转移性克隆局限于CAM表面的小范围区域），则应将该胚胎从实验中剔除。在移除后立即通过-20 °C冷冻（或其他经批准的方法）对废弃胚胎实施安乐死。CAM组织内具有活力的转移性癌细胞数量在初期会下降（第1–2天），随后上升（第2–5天）。
注意：部分胚胎可能会"排斥"癌细胞，即所有癌细胞会从CAM组织中消失。此类胚胎应从实验中剔除。通常情况下，无需打开称量皿，即可通过透明盖在荧光体视显微镜下观察到癌细胞克隆。 - 确保转移性克隆在形态上均匀一致（注射后前1–3天）。在注射后第4–5天鉴定侵袭性或非侵袭性转移性克隆（详见第5节）。
5. 转移性克隆的分离
- 注射后第5天，从培养箱中取出胚胎，检查胚胎绒毛尿囊膜（CAM）上的转移灶分布情况。筛选出转移灶分布均匀且存在致密（或过度侵袭性）病灶的胚胎。
注意：鸡胚培养过程并非无菌操作，因此所有筛选步骤必须在高度洁净的条件下进行，以避免后续组织培养污染。污染情况较为罕见，只需在细胞注射和克隆分离过程中佩戴手套和口罩，并使用无菌器械，即可轻松避免。建议逐个检查胚胎，以减少其暴露于实验室环境温度的时间，并防止污染。 - 定位感兴趣的转移性克隆。紧凑型克隆可描述为大多数癌细胞位于CAM组织有限区域内的克隆（细胞呈现） "聚集在一起"）。侵袭性克隆可被定义为癌细胞侵入周围组织的克隆 "散射" 在CAM组织中（图3A，B).
注意： "紧密度" 转移灶的形成可能归因于癌细胞侵袭受到抑制、癌细胞增殖受到抑制，或两者兼有。应关注所有可能情况，并分离出接触性克隆集落。图3A，B可使用简单的荧光体视显微镜区分致密型和侵袭型转移性克隆表型。 - 在解剖显微镜下，用精细镊子轻轻向上提起含有目标转移克隆的CAM组织图 3C).
- 使用手术剪剪下含有转移灶的CAM组织。
- 将含有转移性克隆的CAM组织转移至一个空的、无菌的1.5 mL离心管（置于冰上），并盖紧管盖。
注意：分离的菌落可在冰上保存长达3小时，而不会丧失活性。 - 重复切割操作，直至将所有目标菌落分别收集到不同的离心管中。为避免动物遭受痛苦，每次胚胎取材时切取的菌落数量不得超过2-3个。菌落切割完成后，立即通过-20 °C冷冻或其他经批准的方法对胚胎实施安乐死。
- 在微量离心管中用无菌18号针头轻轻切碎CAM组织 针头。每个菌落使用单独的针头。
- 加入100 µL 1x胶原酶溶液，于37 °C孵育30分钟。
- 离心细胞和CAM组织，300 x g g 在室温下持续5分钟。
- 吸除胶原酶溶液，并将细胞重悬于目标细胞系所用的完全培养基中。
注意：通常情况下，CAM 组织在胶原酶处理后不会完全解离，癌细胞会首先在 CAM 组织碎片内部增殖，之后才迁移至组织培养皿上。 - 再次以 300 x g 在室温下持续5分钟。
- 将细胞和CAM组织碎片重悬于1 mL完全培养基中（含筛选因子，如有），然后转移至12孔板中的单个孔内。
注意：鸡绒毛尿囊膜成纤维细胞在组织培养中可能持续存在多代，从而抑制克隆扩增。若在筛选因子存在下扩增转移性克隆（例如，用于使癌细胞发出荧光的载体同时编码哺乳动物抗生素抗性基因），可显著加快克隆扩增速度。在筛选前应进行杀灭曲线实验，以确保使用适当浓度的抗生素。 - 在接下来的1至3周内，每天监测癌细胞的生长情况和污染状况。
- 当细胞融合度达到70-80%时，将细胞转移至更大体积的培养皿中。
注意：建议将细胞扩增至每个克隆至少可冻存两支 cryogenic vial。大量维持组织培养既费时又不必要。 - 当癌细胞数量达到足够时，立即进行测序或下一轮筛选。通常，细胞数量达到 1 x 106 癌细胞的数量足以满足现代高通量测序技术的需求。
- 进行克隆重注射，并对集落致密性或癌细胞-血管接触进行成像与量化图 2A）或者，可进行高通量测序，或重复菌落筛选。
注意：为减少假阳性结果，建议至少进行两轮筛选。已有两种方法被成功应用：1）扩增每个克隆并 individually 重新注射，以确认克隆表型；2）将所有扩增后的克隆按1:1比例混合，作为混合物重新注射，并重复筛选循环。
6. 将荧光标记的凝集素注入CAM血管系统。
- 确定需要注射的静脉。建议使用与肿瘤细胞注射相同的注射位点进行凝集素注射。
- 用1×PBS将荧光凝集素储备液（5 mg/mL）稀释50–100倍，并将其装入与癌细胞注射相同的注射装置中。
注意：为实现血管可视化，所需注射的凝集素体积（通常为20–100 μL）取决于显微镜的灵敏度，应在正式筛选前通过实验确定。 - 采用与肿瘤细胞注射相同的技术进行凝集素注射（参见步骤3.6.–3.10.）。
- 凝集素注射后，将胚胎放入培养箱中恢复5分钟。每次仅注射一个胚胎，并在成像前立即进行注射。
注意：发育12天或以上的胚胎通常能够很好地耐受凝集素注射，可在次日再次注射凝集素以进行连续成像。较年轻的胚胎更为敏感，可能出现血液凝固现象。
7. 癌细胞与血管接触的可视化
- 在成像前约6小时，将温控显微镜培养箱设置为37 °C。这有助于稳定显微镜温度，并在成像过程中尽量减少XYZ方向的漂移。
注意：本实验使用了一种专用的鸡胚成像室9,10,11,12,13。从癌细胞注射开始，直至克隆筛选、克隆重注射以及集落致密性评估的所有步骤，均可使用普通的荧光解剖显微镜完成。而对癌细胞与血管接触进行成像和定量分析，则必须使用配备成像室的共聚焦显微镜。胚胎在无需加热的情况下通常可耐受长达1小时的成像，且一般可承受至少两次连续的成像过程而不会影响其存活能力。 - 确保已安装所需的物镜（推荐使用20x或25x水浸物镜）。
- 在成像室盖板的底面涂抹一层薄薄的真空脂，以确保与盖玻片之间形成严密密封。
- 轻柔地将盖玻片放入盖板中，并擦去多余的真空脂。
- 从培养箱中取出已注射凝集素的胚胎，如有需要，剪除称量皿边缘。
- 将胚胎置于成像室内，缓慢放下盖板，使盖玻片直接覆盖在CAM（尿囊膜）上目标转移性集落所在区域。缓慢降低盖板，直至盖玻片刚好接触CAM表面。拧紧螺丝以固定盖板，确保盖板水平，且盖玻片未对CAM施加向下的压力。
- 从多个胚胎（5–10个）的对照组和实验组中，随机选取多个集落（10–20个）进行成像。
注意：建议对每个视野采集随机的三维图像堆栈（Z轴步进1–5 µm；总范围50–100 µm；25x物镜）。 - 如显微镜采集软件支持，请使用视野拼接功能。由于用于定量分析的图像无需达到出版质量，建议使用快速采集模式（如共振扫描）。使用25x物镜，进行3 × 3拼接，Z轴步进5–10 µm，总范围100 µm。每种实验条件至少成像100个细胞（约20个集落）。
8. 癌细胞与血管接触的定量分析
- 使用必要的软件将3D文件作为Z-stack打开。
注意：必须使用专业软件来获取和分析高分辨率图像，以量化癌细胞与血管的接触。目前有多种可进行3D图像分析的软件包可供使用。详见材料表中的详细信息。 - 如果在图像采集过程中发生了明显的XY方向移动，请使用ImageJ的StackReg插件（http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg）对Z-stack进行对齐。
- 定位目标细胞。
- 在Z方向上滚动浏览XYZ图像，找出目标细胞与血管接触长度最大的光学切片（图2E）。
- 使用"手动长度测量功能"测量癌细胞与血管的接触长度。
- 将测量结果输入用于统计分析的数据分析软件包中。
注意：可采用癌细胞与血管接触的长度，或特定癌细胞克隆中与脉管系统接触的细胞百分比（或两者同时使用），来衡量癌细胞与血管的黏附能力。 - 继续分析下一个目标细胞。
- 对突变克隆和对照组数据集进行比较，分析其统计学显著性。
9. 菌落致密度定量分析
- 使用与步骤2相同的技术，将扩增后的克隆细胞重新注入。
- 注射后第五天，对每个克隆的10–50个随机转移性集落进行成像。
注意：转移性集落致密性定量无需高质量图像。单色体视显微镜（10倍放大）图像即可满足要求。应注意图像亮度（应能看清集落内的大部分细胞）和对比度（单个或两个细胞之间的差异）。 - 对集落图像进行数字分离（见图2C、D），然后使用独立的集落致密性定量模块或盲法评分进行集落致密性定量13。
- 继续处理下一个感兴趣的集落。
- 对突变克隆组与对照组（即乱序shRNA）的数据集进行统计学显著性分析。
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结果
若大多数滞留在毛细血管中的细胞呈单个分布，且彼此之间相隔一定距离（约0.05–0.1 cm），则表明癌细胞注射成功，这样在孵育5–6天后形成的克隆不会发生重叠（图3A）。如果在多数毛细血管中可见癌细胞堆积，则表明注射未成功，此类胚胎应予以弃用（图2E）。大量注射后的癌细胞在注射后24小时内会死亡，导致部分胚胎看似完全排斥了癌细胞。癌细胞的存活率可能因本地鸡蛋供应商的不同而有所差异（即所需注射的细胞数量可能需要调整），我们强烈建议在正式开展实验前，先确定最佳注射条件（癌细胞浓度与注射持续时间）。我们推荐的细胞浓度范围为0.5 × 106 至 1.0 × 106 个细胞/mL。当达到最佳细胞浓度和注射时间后，注射后第5天的转导细胞应产生多种多样的克隆表型，其中大多数克隆应表现为侵袭性，即癌细胞在绒毛尿囊膜（CAM）组织中呈弥散分布（图3A）。应特别关注那些...
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讨论
本文介绍了一种基于快速荧光显微镜的活体筛选方案，可用于基因筛选或药物候选物筛选等重要应用。通过鸡胚尿囊膜（CAM）模型，可对转导了特定基因文库或转染了单个表达载体的癌细胞进行快速筛选，并定量分析其目标表型。由于转导或转染方案因文库类型不同而存在显著差异，因此本方案未包含相关步骤。将表型相关的转移性克隆从尿囊膜上切除后进行扩增，并提取DNA用于高通量测序，以鉴定目标表达载体。通常，每种基因文库均配备有相应的引物序列及基因组DNA纯化推荐方法。我们建议遵循本地实验设施的指导原则，以获得最佳的高通量测序结果。
建议在筛选前确定文库和细胞系的最佳感染复数（M.O.I.）。理想情况下，每个细胞（即未来的转移性克隆）应仅含有一个基因表达载体，但根据我们的经验，这并不总是能够实现。我们建议遵循文库生产商提供的方案，并测试较宽范围的 M.O.I.（0.01–5），以尽可能接近 1。每个转移性克隆内若存在多个文库表达载体，可能会显著增加克隆表型分析的复杂性。我们还建议在实验中使用文库生产商提供的阴性对照（例如，表达荧光标记的乱序 shRNA 的载体）。
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致谢
本工作获得了加拿大癌症协会研究所授予 JDL 和 KS 的研究基金（项目编号 #702849）的支持。Lewis 博士持有由阿尔伯塔癌症基金会资助的前列腺癌研究 Frank 和 Carla Sojonky 讲席。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1 mL 一次性注射器 | BD | BD309659 | |
| 15 mL 圆锥形离心管 | Corning | CLS430791-500EA | |
| 18 号 × 1 1/2 BD 精密针头 | BD | BD305196 | 我们使用 1.2 mm × 40 mm 的针头，也可根据需要选用更短的针头 |
| 2.5% 胰蛋白酶溶液 | 多个供应商可提供 | ||
| 4T1 小鼠乳腺癌细胞 | ATCC | CRL-2539 | |
| B16F10 小鼠黑色素瘤细胞系 | ATCC | CRL-6475 | |
| 台式离心机 | 多个供应商可提供 | 任何适用于细胞沉淀的 TC 兼容离心机均可使用 | |
| 圆形盖玻片，22 mm | Fisher Scientific | 12-545-101 | |
| 胶原酶 | Sigma | C0130-100MG | |
| 共聚焦显微镜 | 我们使用 Nikon A1r | ||
| 棉签 | 多个供应商可提供 | 使用前必须灭菌 | |
| 适用于所用细胞系的培养基 | 多个供应商可提供 | 我们使用 DMEM 加 10% FBS 培养基培养 HT1080、HEp3 和 B16 细胞系 | |
| 孵蛋器 | 多个供应商可提供 | 所需具体型号取决于筛选规模。可选供应商包括美国佐治亚州萨凡纳的 MGF Company Inc. 或加利福尼亚州丘拉维斯塔的 Lyon Electric Company Inc. | |
| 1.5 mL 离心管 | Sigma | T4816-250EA | |
| 受精白来航鸡蛋 | 任何本地供应商 | ||
| 精细镊子 | 多个供应商可提供 | 使用前必须灭菌 | |
| 血细胞计数板 | Millipore-Sigma | MDH-4N1-50PK | |
| HT1080 人纤维肉瘤细胞系 | ATCC | CCL-121 | |
| 图像分析软件 | 我们使用 Nikon Elements | ||
| 与荧光素或罗丹明偶联的植物凝集素 Lens Culinaris 凝集素（LCA） | Vector Laboratories | RL-1042, FL-1041 | 根据显微镜灵敏度将原液（5 mg/mL）稀释 50–100 倍。所用荧光颜色必须与用于筛选的细胞系颜色不同 |
| MDA-MB-468 人乳腺癌细胞 | ATCC | HTB-132 | |
| PBS（1×） | 多个供应商可提供 | ||
| 塑料称重皿 | Simport | CA11006-614 | 尺寸为 78×78×25 mm；多个其他供应商可提供 |
| 小型手术剪刀 | 多个供应商可提供 | 使用前必须灭菌 | |
| 硼硅酸钠玻璃毛细管，外径 1.0 mm，内径 0.58 mm，长度 10 cm | Sutter Instrument | BF100-58-10 | |
| 方形培养皿（用作称重皿的盖子） | VWR | CA25378-115 | 尺寸为 100×100×15 mm；多个其他供应商可提供 |
| 体视荧光显微镜 | 我们使用 Zeiss Lumar v12 | ||
| Tygon R-3603 实验室管路 | Cole-Parmer | AAC00001 | 内径 1/32 英寸，外径 3/32 英寸，壁厚 1/32 英寸 |
| U-118 MG 人胶质母细胞瘤细胞 | ATCC | HTB-15 | |
| U-87 MG 人胶质母细胞瘤细胞 | ATCC | HTB-14 | |
| 垂直移液管拉制仪 | 多个供应商可提供 | 我们使用 David Kopf Instruments（美国加利福尼亚州图洪加），型号 720 |
参考文献
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: The next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
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