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方法文章

使用扩展显微镜技术对足细胞蛋白nephrin、actin和podocin进行成像

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⸱

DOI：

10.3791/62079

⸱

2021年4月23日

 ,  ,  , 
1Department of Nephrology, Medical Faculty, Heinrich-Heine-University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方法通过扩增显微技术实现荧光标记细胞蛋白的可视化，可在常规显微镜下达到70 nm的分辨率。

摘要

由肾小球内皮细胞、肾小球基底膜和足细胞组成的肾小球滤过屏障若发生破坏，会导致白蛋白尿。足细胞足突中含有与细胞骨架衔接蛋白（如足蛋白）结合的肌动蛋白束。这些衔接蛋白（如足蛋白）将肾小球裂孔隔膜的核心结构蛋白（如肾病蛋白）与肌动蛋白细胞骨架连接起来。研究这些及其他足细胞蛋白的定位与功能，对于理解肾小球滤过屏障在健康与疾病状态中的作用至关重要。本方案使研究者能够在普通显微镜上通过超分辨率成像技术可视化细胞内的肌动蛋白、足蛋白和肾病蛋白。首先，采用常规免疫荧光技术对细胞进行染色。随后，将样品中所有蛋白质共价锚定至一种可膨胀的水凝胶中。通过蛋白酶K消化，结构蛋白被切断，从而在最后一步实现凝胶的各向同性膨胀。将样品在水中透析，可使样品膨胀4至4.5倍，随后可通过常规荧光显微镜进行成像，达到约70 nm的潜在分辨率。

引言

白蛋白尿是心血管风险的替代参数，由肾小球滤过屏障的破坏引起1。肾小球滤过屏障由有孔内皮细胞、肾小球基底膜以及由足细胞形成的裂孔隔膜组成。足细胞的初级和次级足突环绕包裹肾小球毛细血管壁2。足突的精细结构由皮质肌动蛋白束维持，后者还作为多种裂孔隔膜蛋白及其他衔接蛋白的锚定位点2。裂孔隔膜的核心蛋白称为nephrin，可通过同源相互作用与相邻足细胞上的nephrin分子结合。通过多种衔接蛋白，nephrin与肌动蛋白细胞骨架相连2,3。编码nephrin的基因NPHS1发生突变可导致芬兰型肾病综合征4。

nephrin 的一个相互作用蛋白是 podocin，一种 stomatin 家族的发夹样蛋白3。Podocin 将 nephrin 招募至脂筏，并将其与肌动蛋白细胞骨架相连5。Podocin 由 NPHS2 基因编码。NPHS2 基因的突变会导致激素抵抗性肾病综合征6。

为了可视化和共定位肌动蛋白衔接蛋白，可采用免疫荧光技术。然而，由于光的衍射极限，传统荧光显微镜的分辨率被限制在200–350 nm7。新兴的显微技术，例如受激辐射损耗显微技术（stimulated emission depletion, STED）8、光激活定位显微技术（photo-activated localization microscopy, PALM）9、随机光学重建显微技术（stochastic optical reconstruction microscopy, STORM 或 dSTORM）以及基态耗尽后单分子返回成像技术（ground state deletion microscopy followed by individual molecule return, GSDIM）9,10,11，可实现约10 nm的分辨率。然而，这些超分辨率技术需要极为昂贵的显微镜设备和经过良好培训的专业人员，因此在许多实验室中尚不可及。

膨胀显微技术（ExM）是一种新颖且简便的技术，能够在传统显微镜上实现超分辨率成像，有望广泛应用于大量科研机构12。在蛋白保留膨胀显微技术（proExM）中，将待测样本（细胞或组织）固定并用荧光染料标记13。样本中的蛋白质随后通过小分子（6-((丙烯酰)氨基)己酸琥珀酰亚胺酯，AcX）共价锚定到可膨胀的水凝胶中13。通过蛋白酶K（ProK）的酶解消化，蛋白质和荧光染料在凝胶膨胀后仍保持其相对位置不变13。凝胶溶胀后，样本可横向膨胀达4.5倍（体积膨胀90倍），从而在传统显微镜上实现约60–70 nm的有效横向分辨率（300 nm/4.5）。对该技术的进一步改进甚至可实现10倍的膨胀（体积膨胀1,000倍），使传统显微镜的分辨率达到20–30 nm14,15,16。

已通过扩展显微技术（ExM）对小鼠和人类肾脏的肾小球结构进行了可视化17。本文中，我们提供了一种详细的proExM实验方案，利用常规荧光显微镜对细胞内F-肌动蛋白及肌动蛋白连接蛋白podocin进行超分辨率成像。

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方案

1. 细胞的传代与接种

  1. 将无菌的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）（含10%胎牛血清，FCS）、无菌磷酸盐缓冲液（PBS）和无菌胰蛋白酶预热至37 °C。启动超净工作台。
  2. 使用无菌镊子向6孔板的每个孔中各放入一片无菌玻璃盖玻片（10 mm），完成6孔板的准备。
  3. 将含有Cos7细胞的10 cm细胞培养皿置于超净工作台内。在超净工作台内，使用真空装置吸除细胞培养液。
  4. 一手持倾斜的细胞培养皿，沿培养皿侧壁加入10 mL无菌PBS，避免直接冲落细胞。随后将培养皿平放，使PBS充分冲洗整个培养皿表面。
  5. 吸除PBS，向培养皿中央加入1 mL胰蛋白酶，于37 °C孵育5分钟。
  6. 加入含10% FCS的10 mL DMEM终止胰蛋白酶消化反应，并使用移液器反复吹打细胞悬液，以机械方式使细胞充分解离。
  7. 使用细胞计数板分析每毫升的细胞数量。
  8. 在6孔板的每孔中加入2 mL培养基，接种68,000个细胞至玻璃盖玻片上。通过轻柔地水平和垂直晃动6孔板，使细胞均匀分布。
    注意：细胞应呈分散状态。
  9. 将细胞置于37 °C、5% CO2的培养箱中过夜孵育。

2. 细胞转染

  1. 准备两个无菌的 1.5 mL 离心管（一个用于稀释 DNA（A），另一个用于稀释阳离子脂质转染试剂（B））。将每孔 0.75 µg 的肾病蛋白（nephrin）和 0.75 µg 的足细胞裂孔膜蛋白（podocin）cDNA 表达质粒加入一个 1.5 mL 管中，并用每孔 100 µL 低血清培养基稀释。向第二个 1.5 mL 管中每孔加入 3 µL 阳离子脂质转染试剂，并用 100 µL 低血清培养基稀释。将两个反应体系在室温下孵育 5 分钟。
  2. 将两个反应液（A 和 B）混合形成 DNA-脂质复合物，并在室温下孵育 20 分钟。小心地将每孔 200 µL 的 DNA-脂质复合物加入各孔中。
  3. 将转染后的细胞在 37 °C、5% CO2 条件下孵育 48 小时，期间不更换培养基。

3. 细胞结构的免疫标记

  1. 配制固定液（4% (w/v) 多聚甲醛溶于 PBS 中，每孔 1 mL）、通透液（0.5% (w/v) Triton X-100 溶于 PBS 中，每孔 1 mL）和封闭液（5% (v/v) 牛血清白蛋白溶于 PBS 中，每孔 1 mL）。
  2. 使用真空装置移除培养基。每孔加入 2 mL PBS 以去除残留培养基，然后彻底吸弃 PBS。
    注意：为避免 PBS 冲洗导致细胞脱落，请确保不要将 PBS 直接滴加到玻璃盖玻片上。
  3. 用 PBS 中溶解的 4% (w/v) 多聚甲醛（PFA）在室温下固定细胞 10 分钟。
    注意：也可选择使用 3% (v/v) 乙二醛-乙醇进行固定18。
  4. 弃去 PFA，用 PBS（每次 2 mL）清洗细胞两次，注意避免将 PBS 直接滴加到玻璃盖玻片上。随后在室温下用含 0.5% (w/v) Triton X-100 的 PBS 对固定后的细胞进行通透处理，持续 10 分钟。
  5. 移除通透液，并按照步骤 3.2 的方法用 PBS 洗涤两次。
  6. 加入 1 mL 含 5% (v/v) BSA 的 PBS，在室温下封闭细胞 1 小时。然后加入 200 µL 一抗（抗足细胞蛋白抗体，按 1:200 比例溶于含 1% (v/v) BSA 的 PBS 中），于 4 °C 孵育过夜。
    注意：也可选择在室温下孵育一抗 1 小时。
  7. 移除一抗，按照步骤 3.2 的方法用 PBS 洗涤三次。加入二抗（山羊抗兔 Alexa 488，按 1:1000 比例溶于含 1% (v/v) BSA 的 PBS 中），在室温下孵育 1 小时，并使用盒子将样品避光保存。
  8. 弃去二抗，用 PBS 洗涤三次。
  9. 移除 PBS，加入 200 µL 抗肾病蛋白抗体（按 1:100 比例溶于含 1% (v/v) BSA 的 PBS 中），在室温下孵育 1 小时。用 PBS 洗涤三次。使用盒子将样品避光保存。
  10. 移除 PBS，加入二抗驴抗豚鼠 633（1:200 稀释），在室温下孵育 1 小时。用 PBS 洗涤三次。使用盒子将样品避光保存。

4. 扩展显微镜技术

  1. 准备
    1. 为制备凝胶腔的间隔物，使用金刚石刀将 #1.0 和 #1.5 玻璃盖玻片切割成 5 mm 宽的条状（每张载玻片各需四条）。将 #1.5 mm 盖玻片条放置在载玻片上，形成一个边长为 2.5 cm 的正方形，并将其放入染色盒中（图 2A1-C1）。用移液器吸取少量 ddH2O 滴加至正方形的四个角，使盖玻片条彼此粘附并固定于载玻片上（图 2A2-C2）。
      注意：避免 ddH2O 完全干燥，否则粘附力会丧失。如有需要，可补充滴加 ddH2O。等待约 20 分钟，确保 #1.5 mm 盖玻片稳定粘附后再进行步骤 4.1.2。
    2. 在每个 #1.5 mm 盖玻片条上放置四条 #1.0 mm 盖玻片条。通过在每条 #1.5 mm 盖玻片条上滴加一滴液体使其粘附（图 2A3-C3）。
      注意：凝胶厚度应至少为 0.15 mm，以便在后续实验流程中便于操作。然而，为避免细胞上方凝胶过厚，应使间隔物高度接近细胞基底。使用 #1.5 和 #1.0 盖玻片条作为间隔物时，总高度约为 0.3 mm。细胞附着于厚度为 0.12 mm 的盖玻片上。因此，该组合可确保凝胶足够厚以方便操作，同时避免细胞上方产生过多凝胶。
    3. 为制备凝胶腔盖片，用保鲜膜包裹一张 #1.5 盖玻片，确保保鲜膜表面无褶皱或污物（图 2A5-C5）。
  2. 锚定与聚合（凝胶化）
    1. 配制锚定缓冲液（见表 1）。进行锚定处理时，将每孔中的 PBS 替换为 250 µL 锚定缓冲液，直接加至玻璃盖玻片上，在室温下孵育 3 小时。使用盒子遮光，保持样品避光。
      ​注意：也可选择在室温下过夜孵育。每次实验均需新鲜配制锚定缓冲液，并等待 10–15 分钟使其充分溶解。6-((丙烯酰基)氨基)己酸琥珀酰亚胺酯（AcX）应每 4–5 个月更换一次，以确保有效的锚定效果。
    2. 移除锚定缓冲液，每孔用 1.5 mL PBS 洗涤一次。
    3. 为染色肌动蛋白纤维，解冻一种适用于扩展显微镜（ExM）的鬼笔环肽溶液，并将鬼笔环肽（每孔使用 5 µL 鬼笔环肽溶于 195 µL 含 1% (v/v) BSA 的 PBS 中）在室温下孵育 45 分钟。使用盒子遮光，保持样品避光。
    4. 在此期间，使用搅拌装置将丙烯酸钠溶解于 ddH2O 中。在冰上配制单体溶液（见表 1）。
      注意：溶解后的丙烯酸钠应为无色透明溶液。若溶液呈黄色，则需更换新的丙烯酸钠。
    5. 在冰上配制凝胶溶液（见表 1）。在将凝胶溶液加入凝胶腔之前，立即加入过硫酸铵（APS），并短暂涡旋混匀。
    6. 移除细胞上的鬼笔环肽，每孔用 1.5 mL PBS 在室温下洗涤两次。在孔中保留 1.5 mL PBS，以便后续从盖玻片上取下样品。
    7. 使用镊子和套管将带有细胞的盖玻片从 6 孔板中提起，并将其放入凝胶腔中。
      注意：细胞应朝上位于盖玻片顶部，盖玻片不应接触间隔物。
    8. 向凝胶溶液中加入 APS，并短暂涡旋混匀。用移液器吸取 200 µL 凝胶溶液加至样品上（图 2A4-C4）。小心闭合凝胶腔盖片，避免凝胶中产生气泡（图 2A5-C5）。
    9. 将凝胶腔置于湿润的染色盒中，在 37 °C 下孵育至少 1 小时，以完成凝胶的聚合。
  3. 均质化（消化）
    1. 从培养箱中取出染色盒。打开凝胶腔盖片时，将刀片插入盖片与间隔物之间，小心移除盖片。用刀片去除间隔物，并用刀片切除所有多余的凝胶。
    2. 将带有凝胶和盖玻片的载玻片放入盛有 PBS 的培养皿中。轻轻晃动，使脱离的盖玻片从凝胶上脱落。为便于将凝胶从培养皿中取出，可将载玻片置于凝胶下方，使凝胶附着于载玻片上。
    3. 将凝胶置于载玻片上后，使用刀片将其切成小块（将凝胶的四分之一再分为两到三块）。用画笔轻轻推动一块凝胶进入底部为玻璃的 6 孔板中的一个孔，并用画笔将其展开。使用画笔滴加少量 PBS 保持凝胶湿润，防止其脱水。
      注意：此时细胞面朝下。
    4. 使用倒置显微镜，采用低数值孔径物镜拍摄整体图像，以确定扩增后的扩增倍数。
    5. 配制消化缓冲液（见表 1）。将蛋白酶 K 稀释至消化缓冲液中，终浓度为 4 U/mL，得到消化溶液。
      注意：不含蛋白酶 K 的消化缓冲液可在 4 °C 下保存 1–2 周。
    6. 向每个孔中加入 500 µL 消化溶液，确保凝胶完全浸没于溶液中。在室温下避光孵育过夜。
      注意：也可选择在 37 °C 下孵育 1 小时。
  4. 扩增
    1. 用移液器吸除消化溶液并弃去。加入 1 mL ddH2O，在室温下孵育浸没的凝胶 10 分钟。
    2. 移除水溶液，加入 1 mL 新鲜 ddH2O。等待 10 分钟后，继续每 10 分钟更换一次水，直至达到扩增平台期。
      注意：样品最大可实现约 4.5 倍的扩增。凝胶将变得光学透明。
  5. 成像
    1. 移除凝胶中的水分后，立即开始显微成像。使用倒置显微镜，优先选用空气物镜（低倍率）寻找在扩增前状态（步骤 4.3.4）下已成像的细胞。
    2. 切换至 40x（油镜/水镜）和 63x 物镜以获得更高分辨率。使用目标波长激发，并通过相机采集图像。
  6. 验证
    1. 拍摄样品的整体图像。在样品中寻找并匹配步骤 4.3.4 中已成像的相同结构。选择信噪比最佳的通道进行验证（图 3 A-B）。
      注意：调整成像参数，使图像亮度与非扩增状态下的图像（步骤 4.3.4）相近。
    2. 使用 ImageJ 软件对扩增前后的图像进行旋转和平移叠加。利用 ImageJ 中的距离测量工具，测量清晰可辨结构之间的距离。至少测量 10 个不同的结构。
      注意：也可使用 Python 脚本进行距离测量，方法见文献14。
    3. 通过将扩增后测量值除以扩增前测量值得出扩增倍数。
    4. 为评估形变情况，使用更高数值孔径进行成像（图 4A-B）。对这些图像进行叠加，并使用 ImageJ 或文献15所述方法进行分析。
      注意：形变评估应作为常规操作，但并非每个样品都必须执行。

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结果

该proExM方案的概念与时间安排如图1所示。第5天，对转染的细胞进行固定，并使用靶向目标蛋白的荧光抗体进行染色（图1A、B）。第6天，用AcX处理，使所有蛋白质（包括荧光染料）上形成氨基基团（图1A、B）12。在水凝胶聚合过程中，这些氨基基团与水凝胶发生共价结合（第6天）。凝胶聚合完成后，使用蛋白酶K进行均质化（消化），从而破坏细胞的结构蛋白（第6天，图1A、B）。荧光标记的抗体在消化后基本保持完整。由于结构蛋白被破坏，水凝胶经水透析后，细胞在水凝胶内于第7天发生各向同性膨胀（图1A、B）。样品...

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讨论

本方法可使研究者观察细胞蛋白，例如足蛋白（podocin）、肾小球裂孔膜蛋白（nephrin）以及细胞骨架成分，如F-肌动蛋白（F-actin）。在本实验方案中，转染的Cos7细胞被用作研究裂孔膜蛋白与F-actin相互作用的模型。遗憾的是，永生化足细胞系无法表达足量的内源性裂孔膜蛋白19。

通过该方法，可使用常规荧光显微镜以纳米级分辨率对细胞蛋白进行可视化。实验方案中最关键的步骤包括：1）利用AcX将蛋白质胺基团充分锚定至水凝胶中，2）水凝胶的充分聚合，3）消化反应的最佳时机，以及4）兼容性荧光染料的选择。

细胞蛋白与水凝胶的锚定对于该方法至关重要，以在扩增过程中保持蛋白在水凝胶中的位置。AcX 是一种小分子，可结合细胞和组织内蛋白质的氨基基团。AcX 与蛋白质形成碳-碳双键，从而在聚合步骤中将蛋白质整合到水凝胶中20。AcX 还可整合抗体，因此可在 AcX 处理前进行免疫荧光抗体标记。锚定不足可能导致细胞破裂和形变。由于固定剂会...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者感谢 Blanka Duvnjak 和 Nikola Kuhr 提供出色的技术支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
丙烯酰胺 >99%Sigma-AldrichA3553-100G
6-((丙烯酰基)氨基)己酸琥珀酰亚胺酯，丙烯酰基-X，SEinvitrogenA-20770可保存长达4个月
APSSigma-AldrichA3678-25G
Deckglä丝（盖玻片）EngelbrechtK1243224x32毫米 #1.0
金刚石切割器VWR201-0392用于切割盖玻片
盐酸胍Sigma-AldrichG3272-100G8M 储备液可在室温下保存
马毛画笔Leon Hardy3 (770)
"Menzel" Deckglä丝（盖玻片）赛默飞世尔科技 1565478624x24mm #1.5
N,N`-亚甲基双丙烯酰胺Sigma-AldrichM7256-25G
物体äger UniMarkMarienfeld703010
蛋白酶KNew England BiolabsP8107S
丙烯酸钠Sigma-Aldrich408220检测纯度 
碳酸氢钠Sigma-AldrichS5761
染色缸在该校的工坊中制作
TEMEDROTH2367.1
6孔玻璃底培养板CellvisP06-1.5H-N
<强>抗体
肌动蛋白-ExM 546 chrometra不可用1:40
兔源抗足细胞裂孔膜蛋白抗体SigmaP-0372-200UL1:200
驴抗豚鼠CF633SigmaSAB4600129-50UL1:200
山羊抗兔 488Life TechnologiesA110341:1000
豚鼠抗肾病蛋白OrigeneBP50301:100
<强>软件
FIJI
Visiview
<强>显微镜
AXIO Observer Z1蔡司不可用

参考文献

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