使用扩展显微镜技术对足细胞蛋白nephrin、actin和podocin进行成像

摘要

本方法通过扩增显微技术实现荧光标记细胞蛋白的可视化，可在常规显微镜下达到70 nm的分辨率。

摘要

由肾小球内皮细胞、肾小球基底膜和足细胞组成的肾小球滤过屏障若发生破坏，会导致白蛋白尿。足细胞足突中含有与细胞骨架衔接蛋白（如足蛋白）结合的肌动蛋白束。这些衔接蛋白（如足蛋白）将肾小球裂孔隔膜的核心结构蛋白（如肾病蛋白）与肌动蛋白细胞骨架连接起来。研究这些及其他足细胞蛋白的定位与功能，对于理解肾小球滤过屏障在健康与疾病状态中的作用至关重要。本方案使研究者能够在普通显微镜上通过超分辨率成像技术可视化细胞内的肌动蛋白、足蛋白和肾病蛋白。首先，采用常规免疫荧光技术对细胞进行染色。随后，将样品中所有蛋白质共价锚定至一种可膨胀的水凝胶中。通过蛋白酶K消化，结构蛋白被切断，从而在最后一步实现凝胶的各向同性膨胀。将样品在水中透析，可使样品膨胀4至4.5倍，随后可通过常规荧光显微镜进行成像，达到约70 nm的潜在分辨率。

引言

白蛋白尿是心血管风险的替代参数，由肾小球滤过屏障的破坏引起¹。肾小球滤过屏障由有孔内皮细胞、肾小球基底膜以及由足细胞形成的裂孔隔膜组成。足细胞的初级和次级足突环绕包裹肾小球毛细血管壁²。足突的精细结构由皮质肌动蛋白束维持，后者还作为多种裂孔隔膜蛋白及其他衔接蛋白的锚定位点²。裂孔隔膜的核心蛋白称为nephrin，可通过同源相互作用与相邻足细胞上的nephrin分子结合。通过多种衔接蛋白，nephrin与肌动蛋白细胞骨架相连^2,3。编码nephrin的基因NPHS1发生突变可导致芬兰型肾病综合征⁴。

nephrin 的一个相互作用蛋白是 podocin，一种 stomatin 家族的发夹样蛋白³。Podocin 将 nephrin 招募至脂筏，并将其与肌动蛋白细胞骨架相连⁵。Podocin 由 NPHS2 基因编码。NPHS2 基因的突变会导致激素抵抗性肾病综合征⁶。

为了可视....

方案

1. 细胞的传代与接种

1. 将无菌的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）（含10%胎牛血清，FCS）、无菌磷酸盐缓冲液（PBS）和无菌胰蛋白酶预热至37 °C。启动超净工作台。
2. 使用无菌镊子向6孔板的每个孔中各放入一片无菌玻璃盖玻片（10 mm），完成6孔板的准备。
3. 将含有Cos7细胞的10 cm细胞培养皿置于超净工作台内。在超净工作台内，使用真空装置吸除细胞培养液。
4. 一手持倾斜的细胞培养皿，沿培养皿侧壁加入10 mL无菌PBS，避免直接冲落细胞。随后将培养皿平放，使PBS充分冲洗整个培养皿表面。
5. 吸除PBS，向培养皿中央加入1 mL胰蛋白酶，于37 °C孵育5分钟。
6. 加入含10% FCS的10 mL DMEM终止胰蛋白酶消化反应，并使用移液器反复吹打细胞悬液，以机械方式使细胞充分解离。
7. 使用细胞计数板分析每毫升的细胞数量。
8. 在6孔板的每孔中加入2 mL培养基，接种68,000个细胞至玻璃盖玻片上。通过轻柔地水平和垂直晃动6孔板，使细胞均匀分布。
   注意：细胞应呈分散状态。
9. 将细胞置于37 °C、5% CO₂的培养箱中过夜孵育。

2. 细胞转染

1. 准备两个无菌的 1.5 mL 离心管（一个用于稀释 DNA（A），另一个用于稀释阳离子脂....

结果

该proExM方案的概念与时间安排如图1所示。第5天，对转染的细胞进行固定，并使用靶向目标蛋白的荧光抗体进行染色（图1A、B）。第6天，用AcX处理，使所有蛋白质（包括荧光染料）上形成氨基基团（图1A、B）¹²。在水凝胶聚合过程中，这些氨基基团与水凝胶发生共价结合（第6天）。凝胶聚合完成后，使用蛋白酶K进行均质化（消化），从而破坏细胞的结构蛋白（第6天，图1A、B）。荧光标记的抗体在消化后基本保持完整。由于结构蛋白被破坏，水凝胶经水透析后，细胞在水凝胶内于第7天发生各向同性膨胀（图1A、B）。样品.......

讨论

本方法可使研究者观察细胞蛋白，例如足蛋白（podocin）、肾小球裂孔膜蛋白（nephrin）以及细胞骨架成分，如F-肌动蛋白（F-actin）。在本实验方案中，转染的Cos7细胞被用作研究裂孔膜蛋白与F-actin相互作用的模型。遗憾的是，永生化足细胞系无法表达足量的内源性裂孔膜蛋白¹⁹。

通过该方法，可使用常规荧光显微镜以纳米级分辨率对细胞蛋白进行可视化。实验方案中最关键的步骤包括：1）利用AcX将蛋白质胺基团充分锚定至水凝胶中，2）水凝胶的充分聚合，3）消化反应的最佳时机，以及4）兼容性荧光染料的选择。

细胞蛋白与水凝胶的锚定对于该方法至关重要，以在扩增过程中保持蛋白在水凝胶中的位置。AcX 是一种小分子，可结合细胞和组织内蛋白质的氨基基团。AcX 与蛋白质形成碳-碳双键，从而在聚合步骤中将蛋白质整合到水凝胶中²⁰。AcX 还可整合抗体，因此可在 AcX 处理前进行免疫荧光抗体标记。锚定不足可能导致细胞破裂和形变。由于固定剂会.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
丙烯酰胺 >99%	Sigma-Aldrich	A3553-100G
6-((丙烯酰基)氨基)己酸琥珀酰亚胺酯，丙烯酰基-X，SE	invitrogen	A-20770	可保存长达4个月
APS	Sigma-Aldrich	A3678-25G
Deckglä丝（盖玻片）	Engelbrecht	K12432	24x32毫米 #1.0
金刚石切割器	VWR	201-0392	用于切割盖玻片
盐酸胍	Sigma-Aldrich	G3272-100G	8M 储备液可在室温下保存
马毛画笔	Leon Hardy	3 (770)
"Menzel" Deckglä丝（盖玻片）	赛默飞世尔科技	15654786	24x24mm #1.5
N,N`-亚甲基双丙烯酰胺	Sigma-Aldrich	M7256-25G
物体äger UniMark	Marienfeld	703010
蛋白酶K	New England Biolabs	P8107S
丙烯酸钠	Sigma-Aldrich	408220	检测纯度
碳酸氢钠	Sigma-Aldrich	S5761
染色缸			在该校的工坊中制作
TEMED	ROTH	2367.1
6孔玻璃底培养板	Cellvis	P06-1.5H-N
<强>抗体
肌动蛋白-ExM 546	chrometra	不可用	1:40
兔源抗足细胞裂孔膜蛋白抗体	Sigma	P-0372-200UL	1:200
驴抗豚鼠CF633	Sigma	SAB4600129-50UL	1:200
山羊抗兔 488	Life Technologies	A11034	1:1000
豚鼠抗肾病蛋白	Origene	BP5030	1:100
<强>软件
FIJI
Visiview
<强>显微镜
AXIO Observer Z1	蔡司	不可用