Method Article

研究脊椎动物轴向伸长和分割的三维和四维可视化分析方法

DOI:

10.3791/62086

⸱

February 28th, 2021

 ,  ,  , 
1Instituto Gulbenkian de Ciência, 2Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa, 3NOVA School of Science and Technology

In This Article

Summary

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在这里，我们描述了计算工具和方法，这些工具和方法允许在轴向伸长和分割的背景下可视化和分析小鼠胚胎的三维和四维图像数据，通过toto光学投影断层扫描以及通过使用多光子显微镜进行实时成像和全贴装免疫荧光染色获得。

Abstract

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体细胞发生是脊椎动物胚胎发育的标志。多年来，研究人员一直在使用包括离体和体外方法在内的各种技术在各种生物体中研究这一过程。然而，大多数研究仍然依赖于对二维（2D）成像数据的分析，这限制了对发育过程的正确评估，例如轴向延伸和涉及复杂3D空间中高度动态相互作用的发生。在这里，我们描述了允许小鼠实时成像采集，数据集处理，可视化和分析3D和4D的技术，以研究参与这些发育过程的细胞（例如，神经中胚层祖细胞）。我们还为小鼠胚胎中的光学投影断层扫描和全挂载免疫荧光显微镜（从样品制备到图像采集）提供分步方案，并展示了我们开发的用于处理和可视化3D图像数据的管道。我们扩展了其中一些技术的使用，并突出了不同可用软件（例如，Fiji/ImageJ，Drishti，Amira和Imaris）的特定功能，这些功能可用于提高我们当前对轴向延伸和somite形成（例如，3D重建）的理解。总而言之，这里描述的技术强调了3D数据可视化和分析在发育生物学中的重要性，并可能有助于其他研究人员在脊椎动物轴向延伸和分割的背景下更好地处理3D和4D图像数据。最后，这项工作还采用了新的工具来促进脊椎动物胚胎发育的教学。

Introduction

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脊椎动物身体轴的形成是胚胎发育过程中发生的高度复杂和动态的过程。在原肠胚形成结束时[在小鼠中，在胚胎日（E）8.0左右]，一组称为神经中层祖细胞（NMPs）的上胚层祖细胞成为头到尾序列中轴向延伸的关键驱动因素，在颈部，躯干和尾巴形成过程中产生神经管和旁轴中皮组织1，2，3，4.有趣的是，这些NMP在尾部外胚层中占据的位置似乎在分化成中胚层或神经外胚层5的决定中起着关键作用。虽然我们目前缺乏NMP的精确分子指纹，但这些细胞通常被认为共表达T（Brachyury）和Sox25，6。调节NMP命运决策的确切机制（即，它们是否采用神经或中皮途径）才刚刚开始被精确定义。 Tbx6 在原始条纹区域的表达是NMP命运决定的早期标志物，因为该基因参与中胚层6，7的诱导和规范。有趣的是，早期的中胚层细胞似乎表达高水平的Epha18，Wnt / β-ca....

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Protocol

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涉及动物的实验遵循葡萄牙（Portaria 1005/92）和欧洲（指令2010/63 / EU）关于住房，畜牧业和福利的立法。该项目由"塞内加尔古尔本基安研究所"伦理委员会和葡萄牙国家实体"食品和兽医协会"（许可证编号:014308）审查和批准。

1. 3D和4D成像的样品制备

注意:在这里，我们提供了有关如何解剖和制备小鼠E8.25至E10.5胚胎以进行活体成像（1.1），E7.5至E11.5胚胎用于整个安装免疫荧光显微镜（1.2）和胎儿以进行光学投影断层扫描（1.3）的详细说明。

  1. 用于实时成像的样品制备
    1. 小鼠胚胎解剖和准备活体成像（例如，LuVeLu报告 基因23）。
      1. 在预热的M2培养基（37°C）中解剖E8.25和E10.5之间的小鼠胚胎。使用干净的镊子轻轻取出卵黄囊，并用新鲜的M2培养基洗涤胚胎一次，以除去解剖过程中产生的血液和碎屑。
        注意:重要的是要避免以任何方式损坏胚胎，否则在活体成像过程中将无法正常发育。
      2. 在现场成像过程中，在加热室（37°C），65%O2 和5%CO2 环境（N2 平衡）中，在低葡萄糖DMEM培养基中补充了10%HyClone定义的胎牛血清，2mM L-谷氨酰胺和1%青霉素 - 链霉素，将胚胎孵....

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Results

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本文显示的活体和免疫荧光成像的代表性结果均采用双光子系统获得，其中20×1.0 NA水物镜，激发激光调谐至960nm，GaAsP光电探测器（如Dias等人（2020）43中所述。光学投影断层扫描是使用定制的OPenT扫描仪完成的（如Gualda等人（2013）28中所述）。

实时成像（4D 分析）
对小鼠胚胎中轴向延伸期间LuVeLu报告活性的代表性分析，根据所述方案获得"用于活体成像的样品制备"（步骤1.1 ;"3D成像的样品制备"部分），"实时成像数据集预处理"（步骤3;"图像数据集预处理"部分）和"使用Imaris进行3D可视化和分析"（步骤4.4;"3D渲染、可视化和分析"）可以在 图1 和 视频1中观察到。

3D 可视化和分析
使用免疫荧光测定检测潜在.......

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Discussion

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轴向伸长和分割是脊椎动物胚胎发育过程中发生的两个最复杂和最动态的过程。一段时间以来，使用3D和4D成像与单细胞跟踪已经应用于研究斑马鱼和鸡胚胎的这些过程，其可及性和培养条件有助于复杂的成像19，44，45，46，47，48，49.相比之下，小鼠胚胎的中后期器官发生阶段在如此详细的研究中仍然很少，尽管已经取得了一些进展，例如在活体成像50中。在本手稿中，我们为几种方法提供了特定的方案，这些方法可用于获取多维图像及其分析，以促进在颈部，躯干和尾巴形成过程中研究NMP及其中胚层衍生物。虽然这些方案是为小鼠胚胎设计的，但它们可以很容易地调.......

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Disclosures

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作者声明没有利益冲突。

Acknowledgements

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我们要感谢Olivier Pourquié和Alexander Aulehla提供的LuVeLu报告菌株，SunJin实验室提供的RapiClear测试样本，Hugo Pereira帮助使用BigStitcher，Nuno Granjeiro帮助建立实时成像设备，IGC动物设施以及Mallo实验室的过去和现在的成员在这项工作过程中提供了有用的评论和支持。

我们感谢IGC高级成像设施的技术支持，该设施由葡萄牙资金参考# PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122和ref# PTDC/BII-BTI/32375/2017提供支持，由里斯本区域业务计划（Lisboa 2020）共同资助，根据葡萄牙2020年伙伴关系协议，通过欧洲区域发展基金（FEDER）和Fundação para a Ciência e a Tecnologia（FCT，葡萄牙）。本手稿中描述的工作得到了LISBOA-01-0145-FEDER-030254（FCT，葡萄牙）和SCML-MC-60-2014（葡萄牙Santa Casa da Misericórdia）向M.M，研究基础设施Congento，项目LISBOA-01-0145-FEDER-022170以及博士奖学金PD / BD / 128426 / 2017到A.D.的支持。

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
琼脂糖 低胶凝温度SigmaA9414用于安装胚胎（例如用于 OPT）
Amira 软件Thermofisher-Commerial软件工具
抗短瓣（山羊多克隆）R 和 D 系统AF2085 RRID：AB_2200235用于免疫荧光
抗 Sox2（兔单克隆）Abcamab92494 RRID：AB_10585428用于免疫荧光
抗 Tbx6（山羊多克隆抗体）R 和 D 系统AF4744 RRID：AB_2200834用于免疫荧光
抗层粘连蛋白111（兔多克隆抗体）SigmaL9393 RRID：AB_477163用于免疫荧光
抗山羊 488（驴多克隆抗体）分子探针A11055 RRID：AB_2534102用于免疫荧光
抗兔 568（驴多克隆抗体）ThermoFisher 热飞世尔  科学A10042 RRID：AB_2534017用于免疫荧光
苯甲醇 （99+%）（任何）-用于清除胚胎（BABB 的成分）
甲酸苄酯 （99+%）（任何）用于清除胚胎（BABB 的成分）
牛血清白蛋白BiowestP6154用于免疫荧光
盖玻片 20x20 毫米 #0（任何）-100um 厚
的盖玻片 20x20 mm #1（any）-170um 厚
的盖玻片 20x60 mm #1.5（any）-用作"幻灯片"
DAPI（4'，6-二脒基-2-苯吲哚二盐酸盐）Life TechnologiesD3571用于免疫荧光
Drishti 软件（开源）-免费软件工具
EDTASigmaED2SS用于脱盐
斐济/ImageJ 软件（开源）-免费软件工具
GlycineNZYtechMB01401用于免疫荧光
惠更斯软件Scientific VolumeImaging-Commerial 软件工具
HyClone 定义的胎牛血清GE Healthcare#HYCLSH30070.03用于实时成像
过氧化氢溶液 30 %Milipore1085971000用于清除
Imaris 软件Bitplane / Oxford 仪器-商业软件工具
iSpacersSunJin Lab（各种）用作制备
L-谷氨酰胺Gibco#25030–024用于活体成像培养基
低葡萄糖 DMEMGibco11054020用于活体成像培养基
M2 培养基SigmaM7167解剖胚胎
甲醇VWRVWRC20847.307用于脱水和水化步骤
水杨酸甲酯SigmaM6752用于清除胚胎
多聚甲醛SigmaP6148用于固定胚胎的溶液
青霉素-链霉素Sigma#P0781用于活体成像介质
PBS（磷酸盐缓冲盐水溶液）BiowestL0615-500-RapiClear
SunJin 实验室RapiClear 1.52用于清除胚胎
Secure-Sea 杂交室SigmaC5474用作垫片准备工作
simLab 软件SimLabsoft-Commerial 软件工具
载玻片，凹陷凹玻璃 - 75x25 mm（任何）-用于安装厚胚胎。
Triton X-100SigmaT8787用于免疫荧光
苯-

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wilson, V., Olivera-Martinez, I., Storey, K. G. Stem cells, signals and vertebrate body axis extension. Development. 136 (12), 2133(2009).
  2. Dias, A., Aires, R. Axial Stem Cells and the Formation of the Vertebrate Body. Concepts and Applications of Stem Cell Biolog....

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