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方法文章

三维与四维可视化及分析方法在脊椎动物体轴伸长与分节研究中的应用

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DOI：

10.3791/62086

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2021年2月28日

 ,  ,  , 
1Instituto Gulbenkian de Ciência, 2Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa, 3NOVA School of Science and Technology

本文内容

摘要

本文介绍了用于可视化和分析小鼠胚胎在体轴伸长和体节形成过程中三维和四维图像数据的计算工具与方法，这些图像数据通过整体光学投影断层成像技术、活体成像以及基于多光子显微镜的全胚免疫荧光染色获得。

摘要

体节发生是脊椎动物胚胎发育的一个标志性过程。多年来，研究人员利用多种技术，包括离体和体外方法，在多种生物体中对这一过程进行了研究。然而，大多数研究仍然依赖于二维（2D）成像数据的分析，这限制了对涉及复杂三维空间中高度动态相互作用的发育过程（如轴向延伸和体节发生）的准确评估。本文介绍了一系列技术，可实现小鼠胚胎的活体成像数据采集、数据集处理、三维（3D）和四维（4D）可视化与分析，用于研究参与这些发育过程的细胞（例如神经中胚层前体细胞）。我们还提供了小鼠胚胎光学投影断层成像和整体免疫荧光显微镜技术的逐步操作方案（从样品制备到图像采集），并展示了一个用于处理和可视化三维图像数据的分析流程。我们拓展了部分技术的应用，并重点介绍了多种现有软件（如 Fiji/ImageJ、Drishti、Amira 和 Imaris）的特定功能，这些功能可用于提升我们对轴向延伸和体节形成（例如三维重建）的理解。综上所述，本文所述技术强调了三维数据可视化与分析在发育生物学中的重要性，可能有助于其他研究人员更好地在脊椎动物轴向延伸与体节分节的研究背景下处理三维和四维图像数据。最后，本研究还采用了新型工具，以促进脊椎动物胚胎发育的教学。

引言

脊椎动物体轴的形成是胚胎发育过程中一个高度复杂且动态的过程。在原肠胚形成结束时（小鼠约在胚胎第8.0天），一群被称为神经中胚层前体细胞（neuromesodermal progenitors, NMPs）的外胚层前体细胞成为头尾方向体轴延伸的关键驱动因素，在颈、躯干和尾部形成过程中生成神经管和轴旁中胚层组织1,2,3,4。有趣的是，这些NMPs在外胚层尾部所处的位置似乎在决定其分化为中胚层或神经外胚层的过程中起着关键作用5。尽管目前我们尚缺乏NMPs精确的分子特征标记，但通常认为这些细胞共同表达T（Brachyury）和Sox25,6。调控NMP命运决定（即向神经或中胚层方向分化）的确切机制才刚刚开始被明确界定。Tbx6在原条区域的表达是NMP命运决定的早期标志，因为该基因参与中胚层的诱导与特化6,7。有趣的是，早期中胚层细胞似乎高表达Epha18，而Wnt/β-catenin信号通路以及Msgn1也被证实对轴旁中胚层的分化和体节形成具有重要作用9,10。对NMPs在单细胞水平上进行完整的时空分析，必将有助于深入理解调控中胚层特化的分子机制。

体节（脊椎的前体）的形成是脊椎动物的一个关键特征。在体轴伸长过程中，轴旁中胚层会分节形成一系列左右对称的重复单元，称为体节。不同物种之间体节的数量以及新体节形成所需的时间各不相同11,12。体节发生过程涉及周期性的信号振荡（称为"分节时钟"），这种振荡可通过前体节中胚层中Notch、Wnt和Fgf信号通路多个基因（如Lfng）的周期性表达来观察11,12。目前的体节发生模型还假设存在一个"成熟波前"，即由Fgf、Wnt和视黄酸信号构成的复杂信号梯度，用于确定每个新体节后边界的位置。因此，"分节时钟"与"成熟波前"之间的协调相互作用对于这些脊椎前体结构的形成至关重要，因为这些关键形态发生过程的扰动可能导致胚胎致死或先天性畸形（如脊柱侧弯）13,14,15。

尽管近年来成像技术、生物图像分析方法及软件取得了显著进展，大多数关于体轴伸长和体节发生的研究仍依赖于单一或孤立的二维图像数据（如组织切片），这无法实现组织的完整多维可视化，并且难以清晰区分病理性畸形（即由突变引起） 与 胚胎发育过程中发生的正常形态学变异16三维成像技术已揭示出以往通过标准二维方法未能识别的新型形态发生运动17,18,19,20，凸显了全组织成像在解析脊椎动物体节发生和轴向延伸机制方面的强大能力。

小鼠胚胎的3D和4D显微成像，尤其是活体成像，在技术上具有挑战性，在样本制备、图像采集和数据预处理过程中需要关键步骤，以实现 准确且有意义的时空分析。本文中，我们描述了一种用于小鼠胚胎活体成像和整体免疫荧光染色的详细方案，可用于研究轴向延伸和体节形成过程中的神经中胚层前体细胞（NMPs）和中胚层细胞。此外，我们还介绍了一种针对较晚期胚胎和胎儿的光学投影层析成像（OPT）方案，可实现对体节发生过程中可能出现的病理异常（如骨骼融合和脊柱侧弯）进行完整的三维可视化与定量分析13,21,22。最后，我们展示了3D成像重建技术在脊椎动物体节形成和轴向伸长研究与教学中的强大应用价值。

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方案

涉及动物的实验遵循葡萄牙（Portaria 1005/92）和欧洲（Directive 2010/63/EU）关于饲养环境、饲养管理及动物福利的法律法规。本项目已通过“Instituto Gulbenkian de Ciência”伦理委员会以及葡萄牙国家主管机构“Direcção Geral de Alimentação e Veterinária”审查并获批准（许可证编号：014308）。

1. 用于3D和4D成像的样品制备

注意：本文详细介绍了如何解剖并制备用于活体成像的小鼠 E8.25 至 E10.5 胚胎（1.1）、用于整体免疫荧光显微镜观察的 E7.5 至 E11.5 胚胎（1.2），以及用于光学投影断层扫描的胎鼠（1.3）。

  1. 活体成像样品制备
    1. 小鼠胚胎解剖及活体成像前处理（例如 LuVeLu 报告系统23）。
      1. 在预热的 M2 培养基（37 °C）中解剖 E8.25 至 E10.5 时期的小鼠胚胎。使用洁净的镊子轻轻去除卵黄囊，并用新鲜 M2 培养基清洗胚胎一次，以去除解剖过程中产生的血液和碎片。
        注意：必须避免对胚胎造成任何损伤，否则其在活体成像过程中将无法正常发育。
      2. 在活体成像过程中，将胚胎置于加热培养室（37 °C）中，在 65% O2 和 5% CO2 环境（以 N2 平衡）下，使用添加了 10% HyClone 定义型胎牛血清、2 mM L-谷氨酰胺和 1% 青霉素-链霉素的低糖 DMEM 培养基进行孵育。
        注意：该培养条件可支持胚胎发育约 10 小时。其他采用不同培养条件的方案9,10 可能支持更长时间的发育。
  2. 免疫荧光显微镜样品制备
    1. 小鼠胚胎解剖与固定程序
      1. 在冷（4 °C）磷酸盐缓冲液（PBS）或 M2 培养基中解剖 E7.5 至 E11.5 时期的小鼠胚胎。去除所有胚外膜（如 Reichert 膜或卵黄囊）后，用新鲜 PBS 清洗胚胎，以去除解剖过程中产生的血液和碎片。
      2. 在 4 °C 条件下，使用 PBS 配制的 4% 多聚甲醛（PFA）固定胚胎，固定时间见表 1。
        警告：PFA 应在通风橱内操作
        发育阶段推荐固定时间（4% PFA）
        E7.51小时30分钟
        E8.52小时
        E9.53小时
        E10.54小时
        E11.54小时
        表 1 - 不同发育阶段胚胎的固定时间
      3. 固定后，在 PBS 中至少清洗两次（每次 5–10 分钟），以彻底去除 PFA。此时，胚胎可直接进入免疫荧光染色流程（步骤 1.2.2），或进行脱水后保存以备后续使用（步骤 1.2.1.4）。
      4. 如需长期保存，可将胚胎置于 100% 甲醇中于 -20 °C 保存。
        1. 为提高组织保存质量，需逐步梯度脱水：以 PBS 稀释甲醇，每次增加 10% 浓度，在摇床上室温（RT）孵育 10 分钟，直至达到 100% 甲醇。更换一次 100% 甲醇（使用新鲜分装液）。
        2. 复苏冷冻胚胎时，采用反向甲醇/PBS 梯度重新水化：在摇床上室温（RT）每步 10 分钟，最后在 PBS 中清洗两次（每次 5–10 分钟），再进入免疫染色流程。
          警告：甲醇应在通风橱内操作。
    2. 整体免疫荧光染色
      注意：以下免疫荧光染色流程改编自 Osorno 等人24 所描述的方法。所有洗涤步骤均应在摇床上进行。封闭步骤后，所有孵育均在 4 °C 进行，以确保抗体的完整性与稳定性。
      1. 在含 0.1% Triton X-100 的 PBS（0.1% PBST）中清洗胚胎三次（每次 30 分钟），然后在 0.5% PBST 中清洗一次（1 小时，室温），以增强通透性。
      2. 为减少非特异性结合，在 PBS（pH 7.5）中加入 1 M 甘氨酸，室温孵育 30 分钟。
      3. 在 0.1% PBST 中清洗三次（每次 30 分钟），以彻底去除甘氨酸。
      4. 将胚胎 在封闭液中于 4 °C 孵育过夜。封闭液成分为：3% 血清（与二抗来源动物种属一致）、1% 牛血清白蛋白（BSA）和 0.1% Triton X-100，溶于 PBS 中。
      5. 将一抗用封闭液稀释（通常 T 和 Sox2 抗体为 1:200），于 4 °C 孵育 2 至 3 天。
      6. 加入二抗前，在 4 °C 条件下用 0.1% PBST 清洗胚胎三次（每次 30 分钟）。将二抗用封闭液稀释（1:1000），于 4 °C 孵育 2 天，避光。
      7. 在 4 °C 条件下用 0.1% PBST 清洗胚胎六次（每次 30 分钟）。
      8. 进行核复染时，将胚胎在 4',6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐（DAPI）中孵育，DAPI 用 PBST 稀释 1:500，于 4 °C 在摇床上避光孵育过夜。
      9. 最后，在 4 °C 条件下用 0.1% PBST 清洗胚胎三次（每次 30 分钟）。
    3. 组织透明化与载玻片制备
      1. 使用水杨酸甲酯或苯甲醇与苯甲酸苄酯混合液（BABB）进行组织透明化
        1. 在使用水杨酸甲酯或 BABB 进行透明化前，需通过甲醇/PBS 梯度系列 将胚胎完全脱水至 100% 甲醇，每次甲醇浓度递增 10%（在 4 °C 条件下每次孵育 10 分钟）。为实现完全脱水，更换一次 100% 甲醇（使用新鲜分装液），并额外等待 10 分钟。
        2. 通过将胚胎浸入水杨酸甲酯或 BABB 与甲醇的混合液中进行透明化处理，每步浓度递增 20%，每步孵育 20 分钟。当水杨酸甲酯或 BABB 溶液达到 100% 后，再更换两次新鲜溶液。
          警告：水杨酸甲酯和 BABB 均应在通风橱内操作。
          ​注意：为实现充分透明化，胚胎必须完全脱水。此外，透明化溶液系列中甲醇必须与水杨酸甲酯或 BABB 充分混合。
        3. 当胚胎完全透明后，应使用荧光体视显微镜优先单独操作，以降低组织损伤风险。
        4. 成像时，将胚胎置于 75 mm × 25 mm 凹面载玻片或 20 mm × 60 mm #1.5 盖玻片上。后者允许必要时双面成像，但更易碎且封片困难。使用牙签、细棉签、巴斯德移液管或其他类似工具转移胚胎至显微镜载玻片。
        5. 为避免压迫胚胎，使用 #1 盖玻片碎片（170 µm 厚）、硅胶或薄金属垫圈作为间隔物。然后滴加一滴封片介质，覆盖 #1 或 #0 20×20 mm 盖玻片并封片。
        6. 若使用玻璃或金属间隔物，建议用熔化的石蜡封片以更好固定样本——切勿使用指甲油封片，因其会溶于水杨酸甲酯或 BABB。为避免产生气泡，应从一侧放置盖玻片，然后缓慢轻柔地横向滑动；必要时可补充更多封片介质。
          注意：请观看视频以更好理解透明化胚胎的操作方法及其在显微镜载玻片上的封片过程。
      2. 使用 RapiClear 进行组织透明化
        1. 使用 RapiClear 时，无需进行胚胎脱水。完成步骤 1.2.2.9 后，将胚胎置于 75 mm × 25 mm 凹面载玻片中央，去除载玻片凹槽中的所有 PBST，并加入 200 µL 透明化溶液。
        2. 避光孵育 10 分钟后，当胚胎开始变透明时，更换透明化溶液，再避光孵育 20 分钟，然后从一侧开始缓慢轻柔地覆盖盖玻片。
          注意：胚胎完全透明所需时间可能从几分钟到过夜不等，具体取决于胚胎的发育阶段和大小。整个过程应在体视显微镜下进行。为更好理解透明化及载玻片制备过程，请观看视频方案。
  3. 光学投影断层成像（OPT）样品制备
    ​注意：以下流程改编自先前的方案19,25,26。本方案以 E18.5 小鼠胎儿的分析为例进行描述。
    1. 小鼠胎儿解剖与固定程序
      1. 在冷（4 °C）PBS 中解剖 E18.5 小鼠胎儿，去除所有胚外膜，然后用新鲜 PBS 多次清洗胎儿，以去除解剖过程中产生的血液和碎片。
      2. 在 4 °C 条件下，使用 PBS 配制的 4% PFA 固定胎儿，固定时间为 5 至 7 天。
      3. 在 PBS 中清洗一次（15 分钟），然后在去离子水或 PBS 中清洗三次（每次 30 分钟）。所有清洗均在摇床上进行。
      4. 通过在摇床上室温（RT）逐步增加甲醇浓度（每次递增 10%，以去离子水或 PBS 稀释）进行脱水处理，每步 25 分钟，直至达到 100% 甲醇。
      5. 更换 100% 甲醇溶液（使用新鲜分装液）三次（每次 20 分钟），以确保完全脱水。此后胚胎可于 -20 °C 保存，或在一天后直接进入漂白步骤（步骤 1.3.2）。
    2. 漂白处理
      1. 为去除天然色素，将胎儿分别置于摇床上孵育：先在 5% H2O2 甲醇溶液中孵育一天，随后在 10% H2O2 甲醇溶液中孵育最多 3 天，直至胚胎完全失去天然色素。
        ​警告：H2O2 应在通风橱内小心操作。含 H2O2 的漂白液与样本接触时会产生蒸气，因此装有胎儿的试管在整个漂白过程中应保持开放。某些漂白方案建议将 H2O2 与甲酰胺联用。若采用此替代方案，需格外小心，因将 H2O2 加入未稀释的甲酰胺中可能引发爆炸。
      2. 在去离子水中进行反向甲醇梯度（每次降低 10%）逐步重水化，每步在摇床上室温（RT）孵育 20 分钟，最后在去离子水中清洗三次（每次 30 分钟）。等待一天，更换去离子水后继续后续步骤。
        注意：漂白处理的代表性结果见补充图 1。
    3. 去矿化流程
      注意：去矿化步骤为可选，但建议用于胎儿或幼崽。
      1. 在 42 °C 条件下用 0.1 M EDTA 洗涤胎儿数小时进行去矿化处理 [另见 Cho 等人27]，随后用去离子水清洗五次（每次 20 分钟），以彻底去除 EDTA。所有操作均在摇床上进行。
    4. 透明化样品制备
      1. 将胎儿包埋于 1% 琼脂糖块中。制备方法：将熔化的琼脂糖注入 50 mL 塑料管或注射器中（通过切掉注射器出口端并用活塞封住另一端形成圆柱形空间），将胎儿垂直置于琼脂糖中，并在琼脂糖凝固过程中借助镊子保持其位于块中央的垂直位置。
      2. 将模具置于 4 °C（30 分钟）使琼脂糖完全凝胶化。若胎儿在块中位置不正确或出现气泡，可将琼脂糖块置于 50 °C 过夜熔化，次日重复操作。
      3. 将含胎儿的琼脂糖块从模具中取出，放入盛有去离子水的容器中。15 分钟后更换新鲜去离子水。
      4. 在使用 BABB 透明化前，需对样本进行脱水。为更好保持组织完整性，采用逐步梯度脱水：以去离子水或 PBS 稀释甲醇，每次浓度递增 10%，在摇床上室温（RT）每步孵育超过 45 分钟，直至达到 100% 甲醇。
      5. 更换 100% 甲醇（使用新鲜分装液），先每小时更换一次，共四次，次日再更换一次，以确保完全脱水。
    5. 透明化处理及 OPT 成像样品封片
      1. 在摇床上通过 BABB/甲醇系列溶液对胎儿进行透明化处理，每步 BABB 浓度递增 25%，每步 2.5 小时，直至达到 100% BABB。
      2. 每天更换一次新鲜 BABB 溶液，直至胎儿完全透明。此过程可能需要 3 至 5 天。在整个过程中，将含胎儿的琼脂糖块置于摇床上。胎儿可在 100% BABB 溶液中长期保存。
        ​注意：若胎儿未充分脱水，在首次加入 BABB 后会呈现轻微半透明（"乳白色"乳状）。若发生此情况，应退回纯甲醇步骤，并用新鲜甲醇额外清洗两次。在脱水和透明化过程中切勿冷藏样本，因温度变化可能导致水分冷凝。
      3. 将透明化后的琼脂糖块固定于 OPT 扫描仪的电机轴上，调节光学系统以获取完整胎儿图像，并开始采集完整的投影数据集19,28。

2. 显微镜/图像采集

  1. 为了实现准确的三维和四维成像，应选择最符合实验目标的显微镜。表2提供了用于指导选择的一般性信息。
光学显微技术成像原理实验目标与注意事项
宽场成像利用荧光、反射光或透射光。适用于对胚胎进行快速、总体的观察（例如用于筛选、评估发育阶段和明显表型）。由于在高倍放大下，其景深相对于可观察厚度较小，因此无法对三维形态进行准确解释或分析。
共聚焦（激光扫描；CLSM）采用激光扫描照明，并通过针孔检测荧光信号。可对荧光标记样品进行光学切片成像，尤其适用于信号较强的样品。通过针孔成像可消除焦平面外的信号，从而实现对三维信息的精确区分。其采集速度比宽场成像慢几个数量级，但具有无与伦比的对比度和三维分辨能力。由于图像逐像素采集，难以实现高时间分辨率。适用于对固定的小鼠胚胎（至E9.5阶段）进行三维成像。由于深层组织存在光散射，若需穿透整个前体节中胚层或体节成像，则需进行组织透明化处理。需考虑光毒性和光漂白问题。光漂白在一定范围内可通过后期处理补偿，但活体样品中的光毒性效应无法补偿，且通常难以判断。当样品表达水平较低、需使用高激光功率时，该问题尤为明显。
双光子激发荧光（TPEFM）采用脉冲近红外（NIR）激光激发，而非可见光激光照明。TPEFM可对比CLSM更厚的样品进行光学切片。分辨率略低，但在深层组织中的对比度显著更优，因此非常适合小鼠胚胎的活体成像。尽管TPEFM通常被认为比传统CLSM光毒性更低，但其需要高激光功率，可能对细胞和组织产生不利影响。适用于对小鼠胚胎（至E11.5阶段）进行三维成像，但若需穿透整个前体节中胚层成像，仍需进行组织透明化处理。
共聚焦（转盘式）一种共聚焦形式，使用多个点状光源，而非单一激光。利用多个点状结构可比CLSM更快地生成光学切片（每秒可获取数帧，或每分钟获取数个层扫数据）。其采集速度几乎与宽场成像相当，同时具备合理的三维分辨能力。然而，仅能对小鼠胚胎最表层的组织进行成像。比CLSM具有更高的检测灵敏度，因此适用于荧光蛋白表达水平较低的胚胎。
光片/单平面（LSFM/SPIM）不同于宽场或点状照明，样品逐个正交平面被照明。在大多数配置中，可从多个角度进行成像。 同样需要荧光标记样品。光学切片的采集速度极快（每秒可获取多帧），且光毒性和光漂白效应显著降低。然而，若需多视角成像，后续数据集的预处理可能需要数小时至数天的计算时间。LSFM/SPIM对低表达水平的检测能力优于CLSM。适用于原肠胚形成期间小鼠胚胎的 in toto 三维成像。 样品通常需要以悬浮状态安装并维持（非常规制备方式）。
光学投影层析成像（OPT）光学切片并非直接检测获得，而是通过从不同角度获取的整个胚胎的宽场图像序列（即“投影”）计算得出。适用于对较晚期的小鼠胚胎/胎儿（>5 mm）进行三维成像，但样品必须为固定且透明化处理后的。其优势在于可同时对荧光和非荧光样品生成三维光学切片堆栈。数据集为各向同性（三个维度分辨率相同），非常适合解剖学分析。获取投影数据集仅需数分钟，随后进行15–30分钟的重建。
光学相干层析成像（OCT）利用近红外光穿透样品，基于光反射的干涉效应获取光学切片。OCT可轻松穿透活体组织进行成像（深度达数毫米，无需荧光对比），分辨率达数十微米。采集速度非常快（每秒可获取数个切片）。尽管可作为OPT的一种替代方案，但该技术尚未普及。
超分辨率（SR）、原子力（AFM）或近场成像（NSOM）SR通常基于单分子定位，而AFM/NSOM则在亚衍射分辨率（数纳米）下扫描表面。可在亚衍射水平（<200 nm分辨率）成像，通常用于检测单个分子或细胞表面分子。不适用于小鼠胚胎等大样品的形态学分析。采集过程通常较慢（每幅图像需数秒至数分钟）。

表2 - 指导研究人员根据特定实验目标选择更合适的成像技术/显微镜的通用信息。

3. 图像数据集预处理

注意：本文重点介绍图像数据集预处理中的一些关键步骤，即降噪（3.1）和去卷积（3.2），并提供可用于正确准备和预处理三维数据集时间序列（3.3）以及整体免疫荧光染色样本（3.4）的算法。最后，我们列出了一些参考文献，详细描述了OPT数据集预处理与重建的实验方案。

  1. 噪声降低
    1. 如果图像显示信噪比较低，可考虑采用经典方法，例如 "中位数" 过滤或 "各向异性扩散" 可在 Fiji/ImageJ 中获取29，或基于机器学习的更复杂方法，例如 "关怀"30 或 "Noise2Void"31.
      ​注意：这一点对于活体成像数据集尤为关键，因为光漂白和光损伤是主要关注问题，必须采用较低的曝光和较高的检测器增益。
  2. 去卷积
    1. 如果图像是在高分辨率条件下采集的（接近或达到奈奎斯特采样），建议在分析前对图像进行反卷积处理以恢复图像，从而提升数据集的质量。需注意，某些反卷积工具还包含去噪步骤。
      注：此问题已在 Krull 等人的研究中得到充分阐述。32 以及Huygens去卷积软件网站（https://svi.nl/HomePage）上提供的文档。
  3. 准备用于适当可视化与分析的三维数据集时间序列
    注意：在延时成像过程中，常会出现胚胎或发育阶段的漂移现象。在进行分析之前，必须对此进行校正。有时漂移较为严重，需要中断采集并进行调整。在此情况下，应尽量保持相同的X、Y和Z维度。
    1. 可以使用 Fiji 将单独的 4D 图像序列拼接成一个单一的 4D 超级图像序列 "连接" 功能。然而，此工具无法处理复合图像/超堆栈，因此必须通过以下操作将所有4D片段转换为简单堆栈 图像 | 超级图层 | 超级图层转图层保留某种编号系统以维持这些4D片段的顺序，并记录每个片段的相关信息（通道、切片、时间点）。对所有片段重复该步骤，然后使用相应流程将它们连接起来 图像 | 图像序列 | 工具 | 拼接.
    2. 使用该操作重建拼接的超堆栈 图像 | 超级图像栈 | 图像栈转超级图像栈 并选择不同维度的正确顺序。检查超堆栈，以确保所有维度均按正确顺序排列。
      注意：数量的 通道 (c) 和 切片（z） 应适用于所有4D节段；（时间）数量 帧（t） 应等于所有4D片段添加的时间点总数。在执行转换为超堆栈（hyperstack）操作之前，务必浏览堆栈以了解不同维度的插值方式。Fiji/ImageJ 的默认顺序是：交替通道，然后交替Z切片，最后交替时间点。"XYCZT"）。确认此要求适用于显微镜生成的数据。
    3. 选择“复合”作为显示模式，并保存为标记图像文件格式（TIFF）。对于大型数据集，可考虑转换为BigDataViewer格式。33 格式化，通过执行操作 插件 | BigDataViewer | 将当前图像导出为 XML/HDF5这将生成一个数据集，可使用 BigDataViewer 更高效地进行浏览和三维查看，并可由其他用于大数据集的 Fiji/ImageJ 工具进行处理。
    4. 使用以下任一方法对拼接的超堆栈（3D堆栈的时间序列）进行配准，以校正胚胎/样本台漂移 "正确的三维漂移校正" ImageJ 插件34 或 BigStitcher 插件35，具体取决于所需的漂移校正程度。XML/HDF5 文件可用 BigStitcher 打开。
      ​注意：在进行细胞追踪或运动分析之前，必须对显示胚胎漂移的三维延时图像进行校正；校正漂移对于准确解读形态发生运动也十分必要。
  4. 免疫荧光成像数据集的预处理
    1. Z轴深度信号衰减
      ​注意：尽管我们提出的校正信号衰减的方法可能具有一定的实用性，但应谨慎使用，因为深层信号减弱往往可能反映的是生物学现象而非光学现象。建议在预期目标分子不存在或不表达的组织区域测量信号衰减，并针对该区域调整补偿参数。如果深层仍存在较低的阳性信号，则可能揭示了真实的生物学现象。还需注意，样品的某些区域可能比其他区域产生更强的散射或激光衰减，而这种差异无法通过该简单方法完全校正。
      1. 对于较厚或晚期胚胎，由于封片介质与显微镜物镜之间的折射率不匹配所导致的光束衰减、光漂白以及球面像差 可能导致Z堆栈深层切片中的荧光强度显著衰减。因此，在分析前需对信号衰减进行校正。通过分析方法确定最精确的衰减程度较为复杂，且高度依赖于样本特性36，但可通过 ImageJ/Fiji 实验测定一个快速近似值 流程 | 数学 | 宏 功能并点击 预览.
      2. 在 Fiji/ImageJ 中加载 Z 轴堆栈图像，然后执行以下操作 图像 | 图像序列 | 重新切片开始于： 顶部，保持 避免插值 已勾选且 好的。现在 "Z" 将是 "Y" 轴。接下来，执行 图像 | 查找表 (LUT) | 火焰 （或其他多色LUT）。这将有助于在后续步骤中直观评估最佳补偿效果。切换到胚胎中间位置的切片，此处深度方向上的衰减效应清晰可见（强度从顶部[浅层]到底部[深层]逐渐降低）。
      3. 继续确定垂直方向的校正（"y"强度随操作步骤的下降 流程 | 数学 | 宏，并添加以下内容 "代码" exactly as written here:
        ​v = v * A * exp ( B * y/h )
        在此表达式中 "v" 是像素强度的变量（该变量将作为深度的函数进行调整）， "y" 深度变量，以及 "h" 完整深度，以及 "实验" 是一个指数函数； "A" 应替换为 0.5 到 1.0 之间的数值（选择较低值以避免 Z 层叠顶部层过饱和）；B 替换为 0.5 到 2.0 之间的数值，具体取决于 Z 深度衰减的严重程度——理想情况下应为 1，但在某些情况下，需使用更小（或更大）的值以正确补偿底部层；B 值越高，衰减补偿越强。点击 预览 进行初步评估。测试不同的A和B值，直至图像从顶部到底部获得适当的补偿（ "火" LUT 可对此评估有所帮助）。满意后，单击以应用设置 好的.
        ​注意：必须在每个通道中单独执行此操作，因为红移染料和激光的衰减可能较小，且某些染料的漂白速度比其他染料更快。需注意，该方法可能不足以精确量化随深度变化的荧光强度差异，尽管其可靠性仍明显高于直接在受深度信号衰减严重影响的原始三维数据集上进行定量分析。识别并控制此效应的一种方法是，比较从背侧或腹侧成像的不同胚胎的图像 腹侧
      4. 通过执行以下操作来恢复经补偿的Z堆栈的原始几何形态 图像 | 图像序列 | 重新切片，从以下位置开始 顶部，保持 避免插值 已勾选，现在 "Y" 必须成为 "Z" 平面再次；通过执行替换颜色 "图像 | 查找表 | 灰度" （或其他选定的查找表）。丢弃原始未补偿的z轴图像序列，保存已补偿的版本。
        注意：参见 补充图2 作为Z轴深度信号衰减法的代表性结果。
    2. Z轴缩放校正
      1. 如果使用专为与胚胎封片所用折射率不同的物镜进行成像，则必须对切片厚度进行重新缩放，否则深度方向的测量结果将不准确（若使用 "干燥" 在组织透明化胚胎上的目标（objective）。这一点将在下文进行解释、综述，并讨论各种不同的方法。 37 和 38确定实际的Z轴畸变比例在分析上较为复杂，但可通过计算样本折射率与物镜折射率之比，简便地获得可接受的近似值（例如，使用干式20倍物镜对水杨酸甲酯透明化胚胎成像时为1.53/1.0，或使用水浸物镜对经BABB透明化胚胎成像时为1.56/1.33）。
      2. 使用Z轴层叠数据集在Fiji/ImageJ中打开（对于多通道图像，在将其组装为 "复合材料" （所有通道），前往 图像 | 属性 并改变 体素深度 图像采集时获得的切片厚度乘以前一步骤（4.2.1）中确定的Z轴缩放校正系数； "图像数据集预处理" 部分）。使用以下方法验证结果 图像 | 图像序列 | 正交视图.
    3. 使用 Fiji/ImageJ 将胚胎重定位至解剖学标准位置
      注意：重新定位胚胎（参见文中强调的优势） 补充图3) 使用 Fiji/ImageJ 将其标准化至前后 [A-P] 和背腹 [D-V] 轴方向，需要安装 TransformJ 39 Fiji 的插件套件 "图像科学" 更新网站。
      ​注意：与在三个平面上进行多次旋转相比，该技术更为可取，因为后者会引入混叠伪影并导致分辨率下降。然而，由于Fiji/ImageJ 3D查看器插件无法正确处理大于200–300 Mb的数据集（当尝试旋转视角时，该插件可能无法渲染或表现出不可预测的行为），因此必须首先对原始3D数据集进行降采样。
      1. 首先在 Fiji 中减小数据集的大小 图像 | 比例尺 然后插入 X、Y 和 Z "规模" 将数据集缩减至小于 200 Mb 所需的值（例如，0.5 × 0.5 × 0.5 的下采样将使数据集缩小为原来的 1/8）。确保 创建新窗口 选项已勾选。
      2. 然后前往 插件 | 3D 查看器在3D查看器窗口内，单击胚胎以选中它，此时应出现一个红色的3D方框。在此模式下（红色方框激活时），可通过鼠标控制数据集的旋转，这与默认的旋转视角行为不同。使用鼠标重新定位胚胎时，切勿单击方框外部，否则数据集将被取消选择。
      3. 当对胚胎的新位置满意后，选择 编辑 | 转换 | 导出转换后的图像 在菜单中 "3D 查看器" 窗口。要查看不同的正交平面，请前往 图像 | 图像序列 | 正交视图如果胚胎位置不正确，关闭窗口并返回到上一步骤 3D 查看器 窗口并重新调整。重复步骤 4.3.2。
      4. 当胚胎位置正确时，选择以下选项 "3D 查看器" 窗口菜单 编辑 | 转换 | 保存转换 并将变换矩阵保存为扩展名为 *.mat 的文本文件。使用 Fiji/ImageJ 打开该文本文件，删除前两行（文本内容），然后重新保存。这将生成一个与 "TransformJ" 插件在下文所述 39.
      5. 切换至全分辨率数据集（可以是多通道复合超堆栈）并执行操作 插件 | TransformJ | TransformJ 仿射变换在新窗口中，浏览并查找之前保存的矩阵文件，选择该文件 三次B样条插值 | 各向同性重采样 | 确定.
        ​注意：此操作对内存和中央处理器资源消耗较大。根据工作站性能和数据集大小，操作可能需要数分钟至数小时。建议使用 各向同性重采样 该选项可确保在变换操作过程中不丢失任何分辨率，因此数据集的尺寸将显著增加，且不再具有原始共聚焦Z轴图像序列的各向异性特征；预期Z轴的切片数量将增加至与每个切片的X和Y像素数量相同，从而使图像序列的体积膨胀至原始大小的5到10倍。这是为了确保在旋转和平移过程中进行体素插值时不会丢失任何信息。
      6. 一旦胚胎被正确地重新定位，通常可以裁剪掉胚胎周围产生的大部分空白区域。进行完整的Z轴投影。 图像 | 图像序列 | Z 轴投影… 并选择 最大强度；在X和Y方向上绘制包含整个胚胎的最小ROI。切换到原始数据集图像窗口，前往 编辑 | 选择 | 恢复选择，并通过选择进行裁剪 图像 | 裁剪.
      7. 修剪掉不包含胚胎组织的起始和末端切片。为此，选择 图像 | 图像序列 | 工具 | 切片移除器 并指定要移除的第一层和最后一层切片，确保修改相应的参数 "增量" 至1（否则将仅移除每隔一个的切片）。
      8. 重新定位和裁剪新数据集后，务必将其另存为新的 TIFF 文件。如果该数据集过大（超过 GPU 显存），请考虑使用 BigDataViewer 按照步骤 3.3 中的说明将其导出为 XML/HDF5 格式（来自 "图像数据集预处理" 部分）。
  5. OPT 数据集预处理与重建
    1. 使用该方案进行OPT数据集的预处理与重建 如Martins等人所述19 和 Gualda 等人28.

4. 三维渲染、可视化与分析

注意：此处我们列出了一些不同软件工具的潜在应用，这些工具可用于增强或实现三维成像数据集的可视化与分析。

  1. 使用 Drishti 进行三维渲染与可视化
    注意：Drishti40 是一款免费的科学可视化软件，用于探索和展示来自显微CT、共聚焦/多光子显微镜以及光片显微镜的3D和4D数据集。本文中，我们使用该软件对整体免疫荧光染色样本进行3D重建与可视化（步骤2； "用于三维成像的样品制备" 部分）。网上有多个教程可帮助用户了解如何操作 Drishti；请在线搜索 "Ajay Limaye Drishti 三维教程"Drishti 无法直接读取 TIFF 文件序列，因此必须先将其转换为原生格式 "pvl.nc" 格式。
    1. 运行 "drishtiimport.exe" 位于 Drishti 安装文件夹中的工具： 文件 | 加载 | 文件 | 选择 "灰度TIFF图像文件，加载由 Fiji/ImageJ 保存的单通道三维图像栈。若为多通道复合图像栈，需在 Fiji/ImageJ 中将各通道拆分后分别保存。体素类型为 "ushort"; "文件"..."另存为"..."TIF"，回复 "y" 所有问题。在 附加信息 要求输入体素大小的窗口，请务必添加正确的数值 "X Y Z" 体素大小。
    2. 将 *.pvl.nc 文件导入 Drishti 并进行渲染：在 Drishti 的主窗口中 文件 | 加载 | 加载 1（-4）个体积 根据可用通道的数量（作为单独的文件）进行选择。加载后，按下 F2 用于高质量渲染。此操作需要高性能 GPU 显卡。处理渲染参数的相关信息， 传递函数编辑器，搜索在线教程。当对渲染属性满意后，继续生成动画渲染。
    3. 前往 查看 并激活 关键帧编辑器. 操作胚胎并将其置于所需的起始位置。使用鼠标右键 "拖动" 如有必要，将胚胎移至中心，或使用鼠标滚轮缩放。按下 设置关键帧 在 关键帧编辑器，然后选择另一个位置、角度或缩放比例，将时间线标记拖动到不同的时间点 设置关键帧 再次。现在有两个关键帧，分别显示胚胎处于两个不同的位置/角度/缩放状态，以及若干中间帧。按下 播放 按钮，Drishti 可以插值补全缺失的条件并将其播放为动画。转到 文件 | 保存图像序列 保存所有帧的动画序列。该帧序列之后可在 Fiji/ImageJ 中打开，并保存为 AVI 格式（文件 | 导入 | 图像序列…… 文件 | 另存为 | JPEG 压缩 以合理的帧率（建议 15 - 30）。
      注意：尽管 Drishti 支持保存为 *.wmv 视频，但建议将其保存为单独的帧，之后再将序列转换为 AVI 或 MOV 视频格式（可使用 Fiji/ImageJ 完成此操作）。
  2. 使用 Amira 进行组织的三维重建与手动分割
    注意：该商业软件可对三维数据集中的胚胎组织进行手动或自动/半自动的三维分割。提供在线 "学习中心" 该软件配有多个教程 41. 以下描述了从免疫荧光染色的胚胎中手动分割胚胎组织所需的基本步骤（步骤 1.2）。在胚胎被正确地沿标准的 A-P/D-V 轴定向后，手动分割将变得更加容易（参见" 图像数据集预处理" 第4.3步
    1. 加载一个3D TIFF数据集。在提示时，务必指定正确的体素尺寸。创建并连接一个可视化模块（例如， "正交切片" 或 "Volren"）并在三维中检查数据集。
    2. 连接 标签字段 （或 编辑新标签字段 在 Amira 的较新版本中）。在此软件中，手动分割的结果存储于 "材料"，因此需针对每种目标组织分别制备一种材料。使用 "lasso" 用于手动分割的工具。有多个教程可供参考，解释如何执行此操作（在线搜索以获取） "Amira 分割编辑器教程").
    3. 完成所有目标组织的分割后，退出 分割编辑器 通过切换回 项目 模式。创建了数据集的新版本（该 "标签字段"，该图像现已附加到原始数据集模块中，其中属于每种材料的像素具有相同的值。
    4. 转换这些 "材料" 通过从三维表面模型生成将物体转化为三维对象 "标签" 数据集。这可以通过连接一个 "生成表面" 模块，根据需要调整参数（激活 "压缩", "边界", "调整坐标" 和 "无约束平滑" 选项）。点击 应用 并生成一个新的模块 *.surf。
    5. 可视化表面对象，分别提取并导出为 *obj 文件。连接一个 显示 | SurfaceView 模块连接至 *.surf 模块，并在主视图中进行检查。在 "性质" 面板的 "表面视图" 模块，在其中的 "材料" 特性选择 全部 + 全部 并点击 移除，因此查看者的缓冲区被清空。然后在第二次下拉时 材料 选择一种材料，然后点击“添加到缓冲区”；此时应仅显示该材料。
    6. 在该属性中 绘图样式 点击进入 更多选项 | 创建表面 并创建一个新的 *.surf 模块并将其添加到项目中。将其重命名为组织名称（按键盘上的 F2 键），然后 文件 | 另存数据为…… 和 保存类型： 波前文件 (*.obj)。对每种材料重复此操作。
      注意：这些 *.obj 文件，每个文件包含在 Amira 中分割的一种组织，可被其他工具使用（"3Dviewer" 来自 Fiji/ImageJ 和 SimLab 的插件。
  3. 使用 SimLab Composer 在便携式文档格式（PDF）中实现交互式 3D 可视化
    注意：该三维计算机图形软件可辅助生成表面渲染图像、动画及模拟。相关实用教程可在线获取。 42. 本文描述了如何利用该软件创建交互式3D PDF插图，所用数据为使用Amira生成的波前（*.obj）三维表面文件（步骤2.3； "3D 渲染、可视化与分析" 部分）。
    1. 前往 文件 | 新建 并创建一个 空场景然后 文件 | 导入 并导入从 Amira 保存的第一个 *.obj 文件。保留所有选项 导入文件 窗口未勾选并点击 好的.
    2. 如果编辑器的显示窗口中未显示任何内容，请单击 Ctrl+F 或图标以 全部适配现在分割的对象应出现在窗口中央。重复此过程以添加另一个分割对象，并确认其相对于第一个对象的位置（例如，两个相邻的体节）。
    3. 在显示窗口中用鼠标左键单击选择其中一个对象，将其名称更改为相应的解剖结构或组织名称，然后切换到 "3DGeom~1" 表示，并使用 材料 面板，通过调整R、G、B值来更改颜色。
    4. 对所有对象重复上述操作，直至完成整个 3D 图示的组装。请注意，通过调整某些材质的参数，也可使其变为透明。 "阿尔法" 通道，在RGB值旁边，从而允许观察内部或被遮挡的物体。
    5. 使用该软件可将组装的胚胎图解导出为 "3D PDF" 文件，可包含在出版物中。首先创建一个 "模板" 包含文本及可点击的链接以进行修改 "场景状态" 能够将说明文字和三个不同阶段包含在同一幅插图中。这可以通过切换 "场景构建" 到 "共享" 模式（位于作曲家窗口左侧的按钮），然后单击 显示 PDF 设置，以及创建一个新的页面模板。要创建一个可包含在论文中的简单交互式图表，请勿使用模板，直接 导出 PDF.
      注意：请使用 Adobe Acrobat Reader 软件与 3D PDF 文件进行交互（交互式 3D PDF 插图中的功能可用性可能因 Acrobat Reader 版本而异）。大多数其他查看器（包括网页浏览器）均不支持 3D PDF 格式。此类交互式 3D PDF 插图可包含在出版物中；请提前咨询编辑是否允许。
  4. 使用 Imaris 进行三维可视化与分析
    注意：该软件支持对2D至4D显微镜数据集进行全面的成像可视化、分析与解释，具有直观的界面和工作流程。有关如何开始使用该软件的多个实用教程可在线获取，详见网站（https://imaris.oxinst.com/tutorials）。为了在Imaris中更高效地加载和处理大型数据集（通常指大于GPU内存容量的数据集），建议首先使用Imaris安装目录中的“ImarisFileConverter.exe”程序将数据集转换为“*.ims”格式。ImarisFileConverter可读取多种显微镜图像格式，包括OME格式以及Fiji的BigDataViewer所保存的“h5”文件。
    1. 3D 可视化
      1. 该软件可利用数据集生成三维可视化图像 "3D 视图" 模式，用户可对数据集的显示方式进行多项调整［例如， 在MIP（最大强度投影）与混合模式（可提供更佳的深度线索和阴影渲染效果）之间进行选择。
      2. 正交视图" 模式 - 在正确胚胎定位的情况下（步骤 4.3； "图像数据集预处理" 部分）可以使用 "部分" 标签并浏览整个胚胎，观察来自标准平面（横断面、冠状面和矢状面）的光学切片。如果胚胎未被正确重新定位，通过正交平面解读其解剖结构将极为困难（参见 补充图3）。尽管 Imaris 拥有一项名为 "参考系" 为解决分析三维胚胎时的这一问题，最好预先对数据集进行重新定位。
    2. 三维分析
      ​注意：该软件还包含多种用于分析形态学和荧光强度的工具。例如，此处我们介绍一种使用 Imaris 分析随时间变化的组织荧光强度差异的简单工作流程 "斑点" 工具，用户可手动放置球形感兴趣区域（ROIs） 在三维胚胎中，Imaris 随后可测量这些球形 ROI 内部的组织荧光。
      1. 在 Imaris 中加载一个 3D 或 4D 数据集 添加新位点 在 3D 视图 模式。然后，可以选择胚胎的特定区域（如果使用4D数据集，也可选择多个时间点），并在这些区域内部进行定量分析，例如平均荧光强度。
        注意：该软件还支持绘制强度随时间变化的曲线图，使用户能够轻松回答以下问题： "随时间推移，体节内部的荧光如何变化？".
      2. 加入 斑点 通过点击模块来 添加新位点 按钮或选择 3D 视图 | 斑点 在 Imaris 菜单中。选择 跳过自动反应，手动编辑. 将 Imaris 指针模式切换为 导航 到 选择 （也可通过按下 ESC 键盘上的键
      3. 在 斑点 属性窗口中，选择 特异性通道 用于附着斑点的表面（例如， "通道 1"），并在 手动追踪 的 自动连接至选定位置 以及 启用自动前进前的延迟 选项
      4. 将鼠标光标移至可视化窗口，光标应变为一个空心的黄色线框球体。转到时间点1，在目标组织区域单击以添加一个斑点（=球体）。该球体"斑点"仅在按住按键的同时点击时才添加） 移位 关键。对所有期望的时间点重复此操作，确保随时间跟踪同一部分组织。
      5. 在 斑点特性 窗口，切换到 统计学 标签，以及内部的 统计学 切换自 总体 到 详细 统计学。从第一个下拉菜单中选择 特定值，然后从第二个下拉菜单中选择 "平均强度 Ch=*..."，其中 Ch* 为将要进行测量的通道。其右侧有一个按钮 "单击以打开时间图面板" 将在斑点属性窗口的左下角找到。单击此按钮将打开一个图表，显示斑点内部的中位荧光强度 "斑点"随时间变化绘制的曲线图。这些数值也可导出至电子表格以进行进一步分析。

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结果

本文中展示的活体成像和免疫荧光成像的代表性结果均使用双光子系统获得，配备20 × 1.0 NA水镜物镜，激发激光调至960 nm，并使用GaAsP光电探测器（详见Dias等，(2020)43）。光学投影断层扫描采用自行搭建的OPenT扫描仪完成（详见Gualda等，(2013)28）。

活体成像（4D 分析）
根据“活体成像样品制备”（第 1.1 步；“3D 成像样品制备”部分）、“活体成像数据集预处理”（第 3 步；“图像数据集预处理”部分）以及“使用 Imaris 进行 3D 可视化与分析”（第 4.4 步；“3D 渲染、可视化与分析”部分）所述方案获得的小鼠胚胎在体轴延伸过程中的 LuVeLu 报告基因活性代表性分析结果，可见于 图 1 和 视频 1。

三维可视化与分析

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讨论

轴向伸长和体节化是脊椎动物胚胎发育过程中最复杂且动态的两个过程。长期以来，研究人员已将单细胞追踪的三维（3D）和四维（4D）成像技术应用于斑马鱼和鸡胚胎中对这些过程的研究，因为这些模型在可及性和培养条件方面有利于进行复杂的成像19,44,45,46,47,48,49。相比之下，尽管已有部分进展（例如活体成像技术的应用50），小鼠胚胎在器官发生的中晚期阶段仍缺乏如此精细的研究。在本论文中，我们提供了多种方法的具体实验方案，可用于获取多维图像并对其进行分析，以促进对颈、躯干和尾部形成过程中神经中胚层前体细胞（NMPs）及其中胚层衍生物...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

我们感谢Olivier Pourquié和Alexander Aulehla提供LuVeLu报告基因小鼠品系，感谢SunJin实验室提供RapiClear测试样品，感谢Hugo Pereira在使用BigStitcher软件方面的帮助，感谢Nuno Granjeiro协助搭建活体成像装置，同时感谢IGC动物实验中心以及Mallo实验室的历任和现任成员在本研究进行过程中提供的有益建议与支持。

我们感谢葡萄牙IGC先进影像中心（Advanced Imaging Facility）提供的技术支持，该中心获得葡萄牙资助项目编号PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122和PTDC/BII-BTI/32375/2017的支持，由里斯本地区运营计划（Lisboa 2020）在葡萄牙2020合作伙伴协议框架下，通过欧洲区域发展基金（FEDER）以及葡萄牙科学技术基金会（FCT, Portugal）共同资助。本论文所述工作获得了M.M.主持的FCT（葡萄牙科学技术基金会）项目LISBOA-01-0145-FEDER-030254和Santa Casa da Misericórdia（葡萄牙）项目SCML-MC-60-2014的资助，同时得到研究基础设施Congento（项目编号LISBOA-01-0145-FEDER-022170）的支持，以及A.D.获得的博士奖学金PD/BD/128426/2017。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
低熔点琼脂糖SigmaA9414用于包埋胚胎（例如用于光学投影断层成像）
Amira 软件Thermofisher-商业软件工具
抗 Brachyury 抗体（山羊多克隆）R and D SystemsAF2085 RRID:AB_2200235用于免疫荧光染色
抗 Sox2 抗体（兔单克隆）Abcamab92494 RRID:AB_10585428用于免疫荧光染色
抗 Tbx6 抗体（山羊多克隆）R and D SystemsAF4744 RRID:AB_2200834用于免疫荧光染色
抗层粘连蛋白111 抗体（兔多克隆）SigmaL9393 RRID:AB_477163用于免疫荧光染色
抗山羊 IgG 488 标记二抗（驴多克隆）Molecular ProbesA11055 RRID:AB_2534102用于免疫荧光染色
抗兔 IgG 568 标记二抗（驴多克隆）ThermoFisher   ScientificA10042 RRID:AB_2534017用于免疫荧光染色
苯甲醇（99+%）（任意品牌）-用于胚胎透明化处理（BABB 试剂组分之一）
苯甲酸苄酯（99+%）（任意品牌）-用于胚胎透明化处理（BABB 试剂组分之一）
牛血清白蛋白BiowestP6154用于免疫荧光染色
盖玻片 20×20 mm #0（任意品牌）-厚度为 100 μm
盖玻片 20×20 mm #1（任意品牌）-厚度为 170 μm
盖玻片 20×60 mm #1.5（任意品牌）-用作 “载玻片”
DAPI（4’,6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐）Life TechnologiesD3571用于免疫荧光染色
Drishti 软件（开源）-免费软件工具
EDTASigmaED2SS用于脱矿处理
Fiji/ImageJ 软件（开源）-免费软件工具
甘氨酸NZYtechMB01401用于免疫荧光染色
Huygens 软件Scientific Volume Imaging-商业软件工具
HyClone 定义型胎牛血清GE Healthcare#HYCLSH30070.03用于活体成像培养基
30% 过氧化氢溶液Milipore1085971000用于透明化处理
Imaris 软件Bitplane / Oxford instruments-商业软件工具
iSpacersSunJin Lab（型号各异）用作样品制备中的间隔物
L-谷氨酰胺Gibco#25030–024用于活体成像培养基
低糖 DMEM 培养基Gibco11054020用于活体成像培养基
M2 培养基SigmaM7167用于胚胎解剖
甲醇VWRVWRC20847.307用于脱水和再水化步骤
水杨酸甲酯SigmaM6752用于胚胎透明化处理
多聚甲醛SigmaP6148用于配制胚胎固定液
青霉素-链霉素Sigma#P0781用于活体成像培养基
PBS（磷酸盐缓冲液）BiowestL0615-500-
RapiClearSunJin LaboratoryRapiClear 1.52用于胚胎透明化处理
Secure-Sea 杂交室SigmaC5474用作样品制备中的间隔物
simLab 软件SimLab soft-商业软件工具
凹面载玻片 - 75×25 mm（任意品牌）-用于包埋较厚的胚胎
Triton X-100SigmaT8787用于免疫荧光染色

参考文献

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