哺乳动物大脑的发育需要在翻译水平上对基因表达进行精确调控。本文介绍了一种多聚核糖体分析系统，该系统配备易于组装的蔗糖梯度制备与分级分离平台，可用于评估发育中大脑内mRNA的翻译状态。
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本文内容
摘要
摘要
哺乳动物大脑的正常发育依赖于神经干细胞增殖与分化为不同神经细胞类型的精细平衡。这种平衡受到基因表达的严格调控，而基因表达在多个层面（包括转录、转录后和翻译）被精确调节。在此背景下，越来越多的证据表明，翻译调控在协调神经干细胞命运决定中发挥着关键作用。多聚核糖体（polysome）分离是一种强大的工具，可用于在全基因组范围及单个基因水平上评估 mRNA 的翻译状态。本文介绍了一种自主建立的多聚核糖体分析流程，用于检测小鼠发育中大脑皮层细胞的翻译效率。我们详细描述了蔗糖梯度制备、组织裂解、超速离心以及基于组分分离的 mRNA 翻译状态分析的实验方案。
引言
在哺乳动物大脑发育过程中，神经干细胞通过增殖和分化产生神经元和胶质细胞1,2。该过程若受到干扰，可能导致脑结构和功能的改变，这在许多神经发育障碍中可见3,4。神经干细胞的正常行为依赖于特定基因的协调表达5。尽管这些基因的表观遗传调控和转录调控已被广泛研究，但近期研究发现，其他层次的基因调控也在协调神经干细胞增殖与分化过程中发挥重要作用6,7,8,9,10。因此，深入研究翻译水平的调控机制将极大促进我们对神经干细胞命运决定及大脑发育机制的理解。
目前广泛应用于评估mRNA翻译状态的三种主要技术各有优势，包括核糖体谱分析（ribosome profiling）、翻译核糖体亲和纯化（translating ribosome affinity purification, TRAP）和....
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方案
所有动物使用均受到卡尔加里大学动物护理委员会的监督。实验所用的CD1小鼠购自商业供应商。
1. 溶液的配制
注意：为防止RNA降解，需使用RNase去污染溶液喷洒工作台和所有设备。实验中使用无RNase的枪头。所有溶液均用无RNase的水配制。
- 用DMSO配制环己酰亚胺储存液（100 mg/mL），并于-20 °C保存。
- 通过将75.3 g蔗糖加入无RNase水中，并定容至100 mL，配制2.2 M蔗糖储存液（适用于约16次梯度制备）。该溶液可于-20 °C长期保存。
- 配制10x盐溶液（1 M NaCl；200 mM Tris-HCl，pH 7.5；50 mM MgCl2）。
- 配制60%（w/v）蔗糖追踪溶液，包含30 g蔗糖、5 mL 10x盐溶液，并用无RNase水定容至50 mL。
- 可选：向追踪溶液中加入少量溴酚蓝或约5 µL 1%溴酚蓝水溶液（溶于无RNase水）。1.6. 将溶液于4 °C保存。
2. 蔗糖梯度的制备
注意：蔗糖梯度的制备准确性对于获得一致且可重复的实验结果至关重要。
- 为制备六份10-50%的蔗糖梯度，按表....
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结果
作为示例，将来自8个胚胎的皮层裂解液（含75 µg RNA）通过蔗糖梯度离心分离为12个组分。在254 nm处的紫外吸收峰可识别出含有40S亚基、60S亚基、80S单核糖体及多聚核糖体的组分（图4A）。通过蛋白质印迹分析各组分中大核糖体亚基Rpl10的分布，结果显示其存在于60S亚基（第3组分）、单核糖体（第4组分）以及多聚核糖体（第5–12组分）中（图4B）。相比之下，细胞质蛋白Gapdh和Csde1不与核糖体结合，而在含有游离RNA的组分（第1组分）中富集（图4B）。与不同组分中蛋白质的分离结果一致，我们发现gapdh和sox2 mRNA在富含重多聚核糖体（每个mRNA结合三个以上核糖体，位于第7–12组分）的组分中高度富集，表明gapdh和sox2 mRNA在发育中的皮层中被高效翻译（图4C，D
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讨论
多核糖体分析是一种常用且强大的技术，可用于评估单个基因水平和全基因组水平的翻译状态14。在本报告中，我们介绍了一种使用自制平台进行多核糖体分析的实验方案，并展示了其在分析小鼠大脑皮层发育过程中的应用。该平台成本低廉、易于组装，能够生成稳定且可重复的蔗糖梯度，实现高灵敏度的多核糖体分析。
值得注意的是，制备均一且高质量的蔗糖梯度对于获得可重复的多聚核糖体分析结果至关重要17。在梯度制备过程中，10–50% 蔗糖溶液的体积变化可能导致多聚核糖体峰的偏移，并造成后续分析结果的不一致。此外，在插入和拔出针头时扰动梯度也会导致梯度制备的不一致。与其他方法及商用设备相比，我们自制的梯度制备系统采用电机驱动平台以减少制备过程中对梯度的扰动，并使用注射泵精确分配蔗糖溶液，从而为梯度制备提供了一种廉价且简便的解决方案。
将本研究中提供的多聚核糖体分析平台和方案应用于发育中的小鼠大脑皮层，我们发现核糖体蛋白 Rpl10 以及细胞质蛋白 Gapdh 和 .......
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披露
作者声明无竞争利益。
致谢
本工作由加拿大自然科学与工程研究委员会发现基金（NSERC Discovery Grant，项目号 RGPIN/04246-2018，授予 G.Y.）资助。G.Y. 是加拿大研究讲席学者。S.K. 受 Mitacs Globalink 研究生奖学金和 ACHRI 研究生学生奖学金资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1.5 mL 无RNA酶离心管 | Axygen | MCT-150-C | |
| 10 cm 培养皿 | Greiner-Bio | 664160 | |
| 1M MgCl₂ | Invitrogen | AM9530G | |
| 21-23G 针头 | BD | 305193 | |
| 2M KCl | Invitrogen | AM8640G | |
| 30 mL 注射器 | BD | 302832 | |
| 钝头针头 | VWR | 20068-781 | |
| 光学实验平台 | Thorlabs | MB2530/M | |
| 溴酚蓝 | Sigma | 115-39-9 | |
| CD1 小鼠 | Charles River Laboratory | ||
| 弯头镊子 | Sigma | #Z168785 | |
| 放线菌酮（Cycloheximide） | Sigma | 66-81-9 | |
| 数据采集软件 TracerDAQ | Measurement Computing | ||
| 数字转换器 | Measurement Computing | USB-1208LS | |
| Direct-zol RNA 小量提取试剂盒 | Zymo | R2070 | |
| 二硫苏糖醇（DTT） | Bio-basic | 12-03-3483 | |
| DMSO | Bioshop | 67-68-5 | |
| Dumont No.5 镊子 | Sigma | #F6521 | |
| 组分收集器 | Bio-Rad | Model 2110 | |
| HBSS | Wisent | 311-513-CL | |
| 线性位移执行器 | Rattmmotor | CBX1605-100A | |
| 荧光素酶对照RNA | Promega | L4561 | |
| Maxima 第一链cDNA合成试剂盒 | Thermo Fisher | M1681 | |
| 微型V型夹具 | Thorlabs | VH1/M | |
| 迷你系列光学实验平台 | Thorlabs | MSB7515/M | |
| 迷你系列光学支架 | Thorlabs | MS2R/M | |
| 迷你系列底座支架 | Thorlabs | MBA1 | |
| NaCl | Bio-basic | 7647-14-5 | |
| Neurobasal 培养基 | Gibco | 21103-049 | |
| Ø12.7 mm 铝制支架 | Thorlabs | TRA150/M | |
| Parafilm 封口膜 | Bemis | PM992 | |
| PerfeCTa SYBR Green FastMix | Quanta Bio | CA101414-274 | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | Wisent | 311-010-CL | |
| 嘌呤霉素（Puromycin） | Bioshop | 58-58-2 | |
| 直角夹具 | Thorlabs | RA90/M | |
| 直角 Ø1/2" 转 Ø6 mm 支架夹具 | Thorlabs | RA90TR/M | |
| RNase AWAY | Molecular BioProducts | 7002 | |
| 无RNase吸头 | Frogga Bio | FT10, FT200, FT1000 | |
| 无RNase水 | Wisent | 809-115-CL | |
| RNasin | Promega | N2111 | |
| 窄型直角支架 | Thorlabs | AB90B/M | |
| 小型V型夹具 | Thorlabs | VC1/M | |
| 脱氧胆酸钠 | Sigma | 302-95-4 | |
| 步进电机驱动器 | SongHe | TB6600 | |
| 蔗糖 | Bioshop | 57501 | |
| SW 41 Ti 转子 | Beckman Coulter | 331362 | |
| 注射泵 | Harvard Apparatus | 70-4500 | |
| 注射泵 | Harvard Apparatus | 70-4500 | |
| Triton X-100 | Bio-basic | 9002-93-1 | |
| Trizol | Thermofisher Scientific | 15596018 | |
| 管穿刺器 | Brandel | BR-184 | |
| 超速离心机 | Beckman Coulter | L8-70M | |
| 超速离心管 | Beckman Coulter | 331372 | |
| UltraPure 1M Tris-HCl pH 7.5 | Invitrogen | 15567-027 | |
| UNO Project 超级入门套件 | Elegoo | EL-KIT-003 | |
| 紫外监测仪 | Bio-Rad | EM-1 Econo | |
| 垂直支架 | Thorlabs | VB01A/M |
参考文献
- Götz, M., Huttner, W. B. The cell biology of neurogenesis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6, 777-788 (2005).
- Guillemot, F. Spatial and temporal specification of neural fates by transcription factor codes. Development. 134, 3771-3780 (2007).
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重印与许可
