使用多体分析在发育中的鼠标大脑中进行翻译分析

Summary

哺乳动物大脑的发展需要在翻译水平上正确控制基因表达。在这里，我们描述了一个多体分析系统，该系统具有易于组装的蔗糖梯度制作和分馏平台，以评估 mRNA 在发育中的大脑中的转化状态。

Abstract

哺乳动物大脑的正常发育依赖于神经干细胞增殖和分化成不同神经细胞类型的精细平衡。这种平衡由基因表达紧密控制，基因表达在多个级别进行微调，包括转录、转录后和翻译。在这方面，越来越多的证据突出了转化调节在协调神经干细胞命运决定方面的关键作用。多体分馏是评估全球和单个基因水平的 mRNA 转化状态的有力工具。在这里，我们提出了一个内部聚体分析管道，以评估细胞的转化效率从正在发育的老鼠大脑皮层。我们描述了蔗糖梯度制备、组织裂解、超中心化和基于分数的 mRNA 转化状态分析的协议。

Introduction

在哺乳动物大脑发育过程中，神经干细胞增殖和分化产生神经元和胶质^1，2。这个过程的扰动会导致大脑结构和功能的改变，如许多神经发育障碍^3，4。神经干细胞的正确行为需要特定基因⁵的精心表达。虽然对这些基因的表观遗传学和转录控制进行了深入的研究，但最近的发现表明，其他层面的基因调控也有助于协调神经干细胞增殖和分化^{6、7、8、9、10。}因此，解决转化控制程序将极大地促进我们对神经干细胞命运决定和大脑发育背后的机制的理解。

三种具有不同优势的主要技术已被广泛应用于评估 mRNA 的转化状态，包括核糖体分析、翻译核糖体亲和力纯化 （TRAP） 和多体分析。Ribosome 分析使用 RNA 测序来确定受核糖体保护的 mRNA 片段，从而允许对每个成绩单上转译核糖体的数量和位置进行全球分析，....

Protocol

所有动物的使用都由卡尔加里大学动物护理委员会监督。用于实验的CD1小鼠是从商业供应商那里购买的。

1. 准备解决方案

注意防止RNA降解，喷洒工作台和所有设备与RNASE净化溶液。实验中使用无鼻塞提示。所有解决方案均在无 RNase 水中准备。

1. 在 DMSO 中准备环氧化物库存解决方案 （100 毫克/mL），并存储在 -20 °C。
2. 通过在无 RNase 水中加入 75.3 克蔗糖，并将体积加到 100 mL（用于 16 毫分梯度制备），准备 220 万蔗糖库存解决方案。解决方案可保持在-20°C以进行长期存储。
3. 准备10倍盐溶液（1 M纳克;200米特里斯-HCl，pH 7.5;50毫克M毫克_2）。
4. 准备 60% （w/v） 蔗糖追逐溶液，包含 30 克蔗糖、5 mL 的 10 倍盐溶液，并使用无 RNase 水将体积加到 50 mL。
5. 可选地，在无 RNase 水中加入溴酚蓝色斑点或大约 5μL 的 1% 溴酚蓝色到追逐解决方案中。1.6. 在 4 °C 下存储解决方案。

2. 蔗糖梯度准备

注:蔗糖梯度的准备精度对于获得一致且可重复的结果至关重要。

1. 要....

Results

作为证明，含有75μgRNA（从8个胚胎中汇集）的皮质分析被蔗糖梯度分成12个分数。紫外线吸收峰值在254纳米识别分数包含40S亚单位，60S亚单位，80S单体和多体（图4A）。Rpl10通过对大型核糖体亚单位的西色斑点进行分析，显示其存在60S子单元（分数3）、单体（分数4）和多体（分数5-12）（图4B）。相比之下，细胞质蛋白Gapdh和Csde1与核糖体无关，而是富含自由RNA（分数1）（图4B）的分数。与不同分数的蛋白质分离一致，我们发现gadh和sex2 mRNA在含有重聚体的分数中高度丰富（分数7-12中超过三个核糖体），这表明gapdh和sex2 mRNA在发育中的皮层中被有效地转化（图4C，D）。相比之下，rpl7和rpl34 mRNA在包含单体.......

Discussion

多体特征分析是一种常用和强大的技术，用于评估单个基因和全基因组¹⁴ 级的转化状态。在本报告中，我们提出了一个多体分析协议，使用家庭组装的平台及其应用来分析正在发育的鼠标皮层。这个经济高效的平台易于组装和生成坚固、可重复的蔗糖梯度和具有高灵敏度的多体剖析。

值得注意的是，制备一致和优质蔗糖梯度对于获得可重复的多体剖析结果^至关重要。梯度制备过程中10-50%蔗糖溶液体积的变化可能导致多体峰的移动和下游分析结果的不一致。此外，在插入和去除针头过程中干扰梯度可能导致梯度制备不一致。与其他方法和商业设备相比，我们自制的梯度制造系统采用电动阶段来减少制备过程中梯度干扰，并使用注射器泵精确分配蔗糖溶液，为梯度制备提供了廉价而简单的解决方案。

将此处的多体分析平台和协议应用于正在发育的鼠标皮层，我们发现核糖核酸蛋白 Rpl10 和细胞质蛋白 Gapdh 和 Csde1 分布在正确的分数中。此外，高翻译的 gapdh 和 sox2 mRNA 在多色素.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL 不含 RNA 的微管	Axygen	MCT-150-C
10 cm 培养皿	Greiner-Bio	664160
1M MgCl2	Invitrogen	AM9530G
21-23G 针头	BD	305193
2M KCl	Invitrogen	AM8640G
30 mL 注射器	BD	302832
头针	VWR	20068-781
面包板	Thorlabs	MB2530/M
溴酚蓝	Sigma	115-39-9
CD1 小鼠		Charles River 实验室
弯尖镊子	Sigma	#Z168785
放线菌酮		Sigma	66-81-9
数据采集软件TracerDAQ	Measurement Computing
数字转换器		Measurement Computing	USB-1208LS
Direct-zol RNA 小量制备试剂盒	Zymo	R2070
二硫苏糖醇 （DTT）	Bio-basic	12-03-3483
DMSO	Bioshop	67-68-5
Dumont No.5 镊子	Sigma	#F6521
馏分收集器	Bio-Rad	Model 2110
HBSS	Wisent	311-513-CL
线性平台执行器	Rattmmotor	CBX1605-100A
荧光素酶对照 RNA	Promega	L4561
Maxima 第一链 cDNA 合成试剂盒	Themo Fisher	M1681
微型 V 型夹	Thorlabs	VH1/M
迷你系列面包板	Thorlabs	MSB7515/M
迷你系列光学柱	Thorlabs	MS2R/M
迷你系列基座柱支架底座	Thorlabs	MBA1
NaCl	Bio-basic	7647-14-5
神经基础培养基	Gibco	21103-049
Ø12.7 mm 铝柱	Thorlabs	TRA150/M
Parafilm	Bemis	PM992
PerfeCTa SYBR green fastmix	Quanta Bio	CA101414-274
磷酸盐缓冲盐水 （PBS）	Wisent	311-010-CL
嘌呤霉素	Bioshop	58-58-2
直角夹	Thorlabs	RA90/M
直角 & Oslash;1/2" 到 Ø6 mm 柱夹	Thorlabs	RA90TR/M
Rnase AWAY	Molecular BioProducts	7002
无 RNase 吸头	Frogga Bio	FT10、FT200、FT1000
无 RNase 水	Wisent	809-115-CL
RNasin	Promega	N2111
细长型直角支架	Thorlabs	AB90B/M
小型 V 型夹	Thorlabs	VC1/M
脱氧胆酸钠	Sigma	302-95-4
步进电机驱动器	SongHe	TB6600
蔗糖	Bioshop	57501
SW 41 Ti 转子	贝克曼库尔特	331362
注射泵	哈佛仪器	70-4500
注射泵	哈佛仪器	70-4500
Triton-X-100	生物碱性	9002-93-1
Trizol	Thermofisher Scientific	15596018
管穿刺器	Brandel	BR-184
超速离心机		Beckman Coulter	L8-70M
超速离心管	Beckman Coulter	331372
UltraPure 1M Tris-HCl pH 7.5	Invitrogen	15567-027
UNO 项目超级入门套件	Elegoo	EL-KIT-003
紫外线监测器	Bio-Rad	EM-1 Econo
垂直支架	Thorlabs	VB01A/M