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方法文章

利用多聚核糖体分析法研究小鼠发育大脑中的翻译过程

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DOI：

10.3791/62088

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2021年5月22日

 ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology; Cumming School of Medicine, University of Calgary, 2Department of Medical Genetics, Cumming School of Medicine, University of Calgary, 3Alberta Children's Hospital Research Institute, University of Calgary

本文内容

摘要

哺乳动物大脑的发育需要在翻译水平上对基因表达进行精确调控。本文介绍了一种多聚核糖体分析系统，该系统配备易于组装的蔗糖梯度制备与分级分离平台，可用于评估发育中大脑内mRNA的翻译状态。

摘要

哺乳动物大脑的正常发育依赖于神经干细胞增殖与分化为不同神经细胞类型的精细平衡。这种平衡受到基因表达的严格调控，而基因表达在多个层面（包括转录、转录后和翻译）被精确调节。在此背景下，越来越多的证据表明，翻译调控在协调神经干细胞命运决定中发挥着关键作用。多聚核糖体（polysome）分离是一种强大的工具，可用于在全基因组范围及单个基因水平上评估 mRNA 的翻译状态。本文介绍了一种自主建立的多聚核糖体分析流程，用于检测小鼠发育中大脑皮层细胞的翻译效率。我们详细描述了蔗糖梯度制备、组织裂解、超速离心以及基于组分分离的 mRNA 翻译状态分析的实验方案。

引言

在哺乳动物大脑发育过程中，神经干细胞通过增殖和分化产生神经元和胶质细胞1,2。该过程若受到干扰，可能导致脑结构和功能的改变，这在许多神经发育障碍中可见3,4。神经干细胞的正常行为依赖于特定基因的协调表达5。尽管这些基因的表观遗传调控和转录调控已被广泛研究，但近期研究发现，其他层次的基因调控也在协调神经干细胞增殖与分化过程中发挥重要作用6,7,8,9,10。因此，深入研究翻译水平的调控机制将极大促进我们对神经干细胞命运决定及大脑发育机制的理解。

目前广泛应用于评估mRNA翻译状态的三种主要技术各有优势，包括核糖体谱分析（ribosome profiling）、翻译核糖体亲和纯化（translating ribosome affinity purification, TRAP）和多聚核糖体谱分析（polysome profiling）。核糖体谱分析利用RNA测序技术检测受核糖体保护的mRNA片段，从而全局分析每条转录本上翻译中核糖体的数量和位置，并通过与转录本丰度比较间接推断翻译速率11。TRAP技术则利用表位标记的核糖体蛋白来富集与核糖体结合的mRNA12。由于可通过遗传学方法在特定细胞类型中表达标记的核糖体蛋白，TRAP能够实现细胞类型特异性的翻译分析。相比之下，多聚核糖体谱分析采用蔗糖密度梯度离心法，将未结合或翻译效率较低的游离mRNA（较轻的单体核糖体）与正在被多个核糖体活跃翻译的mRNA（较重的多聚核糖体）分离开来，从而直接测量mRNA上的核糖体密度13。该技术的一个优势在于其灵活性，既可用于研究特定目标mRNA的翻译情况，也可用于全基因组范围的翻译组分析14。

本文中，我们描述了一种用于分析发育中小鼠大脑皮层的多聚核糖体分析详细实验方案。我们使用自行组装的系统制备蔗糖密度梯度，并收集用于下游应用的组分。此处提供的方案可轻松适用于分析其他类型的组织和生物体。

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方案

所有动物使用均受到卡尔加里大学动物护理委员会的监督。实验所用的CD1小鼠购自商业供应商。

1. 溶液的配制

注意：为防止RNA降解，需使用RNase去污染溶液喷洒工作台和所有设备。实验中使用无RNase的枪头。所有溶液均用无RNase的水配制。

  1. 用DMSO配制环己酰亚胺储存液（100 mg/mL），并于-20 °C保存。
  2. 通过将75.3 g蔗糖加入无RNase水中，并定容至100 mL，配制2.2 M蔗糖储存液（适用于约16次梯度制备）。该溶液可于-20 °C长期保存。
  3. 配制10x盐溶液（1 M NaCl；200 mM Tris-HCl，pH 7.5；50 mM MgCl2）。
  4. 配制60%（w/v）蔗糖追踪溶液，包含30 g蔗糖、5 mL 10x盐溶液，并用无RNase水定容至50 mL。
  5. 可选：向追踪溶液中加入少量溴酚蓝或约5 µL 1%溴酚蓝水溶液（溶于无RNase水）。1.6. 将溶液于4 °C保存。

2. 蔗糖梯度的制备

注意：蔗糖梯度的制备准确性对于获得一致且可重复的实验结果至关重要。

  1. 为制备六份10-50%的蔗糖梯度，按表1稀释2.2 M蔗糖溶液。
蔗糖溶液10%20%30%40%50%
2.2 M 蔗糖2 mL4 mL6 mL8 mL10 mL
10X 盐溶液1.5 mL1.5 mL1.5 mL1.5 mL1.5 mL
放线菌酮（Cycloheximide）15 µL15 µL15 µL15 µL15 µL
水11.5 mL9.5 mL7.5 mL5.5 mL3.5 mL
总体积15 mL15 mL15 mL15 mL15 mL

表1：制备蔗糖梯度所需的蔗糖稀释液。

注意：在超速离心过程中为保持重量平衡，蔗糖梯度液的制备必须以偶数倍进行。

  1. 用 RNase 去污染溶液擦拭金属钝头针。使用无 RNase 水短暂冲洗超速离心管、管路和注射器。将离心管自然晾干，确保管内无水滴残留，因为残留水分会改变蔗糖浓度。
  2. 将金属针固定在夹具支架上，并将离心管置于电机驱动的移动平台上。为确保梯度制备的一致性，使用一套自行组装的系统，该系统包含一个用于固定超速离心管的电机驱动平台和一个用于注入蔗糖溶液的注射泵（图1，详见步骤9）。
  3. 用一个30 mL注射器吸取约16 mL的10%蔗糖溶液（足够制备六个梯度），将其安装在注射泵上，并与针头连接。确保注射器、管路和针头中无气泡。擦拭针头尖端以去除任何残留溶液。
  4. 向上移动电机驱动平台，使针头尖端接触离心管底部中心位置。
  5. 将注射泵设定为流速2 mL/min，体积2.3 mL。
  6. 注入2.3 mL的10%蔗糖溶液后，向下移动电机驱动平台，并对全部六个梯度重复此过程。
  7. 重复步骤2.4–2.7，依次向管底加入20%蔗糖溶液，随后分别为30%、40%和50%蔗糖溶液。
  8. 梯度制备完成后，用石蜡膜密封超速离心管。
  9. 将离心管在4 °C下静置过夜，使不同浓度的蔗糖层相互扩散，形成连续梯度。

3. 组织解剖

注意：先使用 5% 异氟烷进行麻醉，再通过颈椎脱位法处死怀孕小鼠。

  1. 在胚胎第12天（或根据需要选择其他时间点）收集CD1小鼠胚胎，并将胚胎置于含有冰冻Hank's平衡盐溶液（HBSS）的Ø 10 cm培养皿中，置于冰上以保持细胞活性。
  2. 在解剖显微镜下，将一个胚胎转移至含有冰冻HBSS的Ø 6 cm培养皿中。
  3. 使用21–23 G针头以大约45°角穿刺眼睛以固定头部位置，并施加力量确保针头固定在培养皿上（图2A）。
  4. 使用5号镊子从中间向两侧剥离皮肤和颅骨。
  5. 用镊子切断嗅球并去除软脑膜，以暴露皮层组织。使用弯头镊子将皮层组织切割至盛有2–3 mL冰上预冷的Neurobasal培养基的容器中（图2B）。根据需要合并来自不同胚胎的皮层组织。通常8–10个胚胎的组织可获得约200 µg总RNA。

4. 细胞裂解

  1. 在组织解剖当天，按照表2所述配制新鲜的细胞裂解缓冲液。
溶液终浓度体积
Tris-HCl (pH 7.5)20 mM100 µL
KCl100 mM250 µL
MgCl25 mM25 µL
Triton X-1001% (v/v)500 µL
脱氧胆酸钠0.5% (w/v)500 µL
二硫苏糖醇 (DTT)1 mM5 µL
放线菌酮100 µg/mL5 µL
无RNase水加至 5 mL
总量5 mL5 mL

表2：制备 多核糖体裂解缓冲液

注意：在裂解缓冲液中添加蛋白酶和磷酸酶抑制剂。

  1. 向含有解剖组织的Neurobasal培养基中加入环己酰亚胺，使其终浓度为100 µg/mL，37 °C孵育10分钟。环己酰亚胺可阻断翻译延伸，从而防止核糖体脱离15。
  2. 在4 °C下以500 × g离心5分钟，弃去上清液。
  3. 用预冷的含100 µg/mL环己酰亚胺的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤组织两次。
  4. 加入500 µL细胞裂解缓冲液，并添加4 µL RNase抑制剂。用移液器上下吹打，使组织在裂解缓冲液中充分重悬。使用胰岛素针头轻轻裂解组织。
  5. 将组织置于冰上孵育10分钟，每2–3分钟短暂涡旋一次。
    注意：为防止组织降解，所有组织裂解步骤均需在冰上操作。
  6. 在4 °C下以2,000 × g离心5分钟。
  7. 将上清液转移至冰上预冷的新离心管中。
  8. 在4 °C下以约13,000 × g离心5分钟。
  9. 将上清液转移至冰上预冷的新离心管中。
  10. 使用紫外-可见分光光度计测定组织裂解液中的RNA浓度。
    注意：若实验中包含多个样品，应用额外的细胞裂解缓冲液将各样品稀释至相同浓度，以减少差异。

5. 样品上样与超速离心

  1. 将超速离心转子和摆动桶在 4 °C 预冷，并将超速离心机的温度设置为 4 °C。
  2. 保留 20 µL 组织裂解液作为总 RNA 输入样本。
  3. 通过将裂解液缓慢加至超速离心管管壁顶部，将样品（50–300 µg RNA，体积相等）加到蔗糖梯度上方。
  4. 将超速离心管轻轻放入摆动桶中，确保所有对称位置的桶已平衡。
  5. 将摆动桶安装到转子上，将超速离心机设置为 190,000 × g（约 39,000 rpm），4 °C 离心 90 分钟。
  6. 离心后，将梯度液轻轻放置于冰上。

6. 组分分离与样品收集

注意：使用自制的分级、记录和收集系统对梯度样品进行分析和收集（图3，参见装置组件）。

  1. 将空的超速离心管放置在管穿刺器上，从底部用针头轻轻刺入管中。
  2. 打开紫外监测仪，并启动数字信号记录软件。
  3. 用一个30 mL注射器吸取25 mL的60%蔗糖追赶溶液。轻轻推动注射器，使追赶溶液充满空管并流经254 nm紫外监测仪，以设定检测的基线。
  4. 按下紫外监测仪上的自动调零按钮，设定检测基线。在软件中点击播放，开始记录。
  5. 当系统建立稳定基线后，暂停软件中的记录，并回抽追赶溶液。确保系统中无残留的追赶溶液。
    注意：使用无RNase水冲洗系统，以去除前次运行残留的蔗糖溶液。
  6. 将一个样品管装入管穿刺器。从底部用针头轻轻刺入管中。
  7. 在软件中开始记录。启动注射泵（流速为1 mL/min，体积为25 mL）和组分收集器，以收集多聚核糖体组分。将组分收集器设置为每30秒收集一管。
    注意：每次运行前，应轻轻推动注射器，使追赶溶液持续通过针头，以确保注射器和管路中无气泡。
  8. 使用组分收集器将组分收集至1.5 mL离心管中（每管500 µL）。
  9. 收集的组分可立即进行后续处理，或保存于-80 °C。
  10. 完成组分收集后，使用无RNase水冲洗系统，以去除残留的蔗糖。

7. RNA 的提取

  1. 向每份组分中加入 10 ng 荧光素酶 mRNA 外参对照。
  2. 向每份组分中加入三倍体积的基于盐酸胍的商用 RNA 分离试剂。
  3. 涡旋振荡 15 秒，时间短暂。
  4. 使用与步骤 7.2 中所用溶液兼容的 RNA 提取试剂盒提取 RNA。

8. 逆转录与实时 PCR

  1. 使用紫外-可见分光光度计测定RNA的浓度。
  2. 根据制造商提供的说明书，使用cDNA合成试剂盒对RNA进行逆转录反应。
  3. 以gapdh mRNA为例，采用定量实时PCR（qPCR）检测其多聚核糖体分布。qPCR使用qPCR检测系统和qPCR预混试剂进行，循环条件如下：95 °C 预变性10分钟，然后进行40个循环（95 °C 变性15秒，60 °C 退火30秒，72 °C 延伸40秒），最后在95 °C 保持60秒。
  4. 从扩增曲线中获取阈值循环（Ct）值，并采用ΔΔCt法计算相对表达量的变化倍数。

9. 蔗糖梯度制备系统的组装

注意：按照以下步骤组装蔗糖梯度混合器的各个部件（如表3所述，见图1）。

  1. 在底板面包板（A1）上安装两个垂直支架（A2）。
  2. 使用两个细型直角支架（B2）将线性位移台执行器安装到底板面包板（A1）上。
  3. 使用Ø12.7 mm铝制支撑杆（C2）上的紧定螺钉，将其固定在管架底板面包板（C1）上，作为管架的支架。
  4. 将Ø1/2"转Ø6 mm的直角杆夹（C3）与支撑杆（C2）和微型光学杆（C4）组装在一起。
  5. 使用光学杆（C4）上的紧定螺钉连接一个小V型夹（C5），作为管架。
  6. 将离心管放入管架中，并调整角度使其垂直。标记离心管的位置，并在底板面包板（C1）上安装基座杆架（C6）以支撑离心管。
  7. 在面包板（A1）的另一侧，使用Ø12.7 mm铝制支撑杆（D1）上的紧定螺钉将其固定，并通过一个Ø1/2"转Ø6 mm的直角杆夹（D2）连接微型光学杆（D3）。
  8. 将微型V型夹（D4）与钝端针头（D5）连接至支撑杆（D3）。调整夹具角度使针头保持垂直，并调节支撑杆长度，确保针头与离心管接触。
  9. 将执行器（B1）连接至步进电机驱动器（E1），并使用UNO R3控制板及UNO入门套件中的摇杆模块（E2）控制执行器。可使用电源适配器（例如9–24 V AC/DC可调电源适配器）单独为电机供电。
  10. 将注射泵（F）放置在梯度生成装置旁边，并将注射器与针头连接。
  11. 使用摇杆控制管架平台上下移动。
组件项目
B1线性滑台执行器
E1步进电机驱动器
E2UNO项目超级启动套件
A1面包板
A2垂直支架
B2窄型直角支架
C1微型系列面包板
C5小型V型夹
D4微型V型夹
C2Ø12.7 mm铝制立柱
C4, D3微型系列光学立柱
D1Ø12.7 mm铝制立柱
C3, D2直角型Ø1/2"转Ø6 mm立柱夹
C6微型系列底座立柱固定座
D5钝端针头
F注射泵

表3：梯度生成系统的组成部件。

10. 分离与检测系统组装（图2）。

  1. 使用普通的圆口滴定管夹将紫外监测仪的光学模块固定在穿管器上。将一段 tubing（1 cm 长，内径 0.56 mm）一端连接至穿管器的接口，另一端连接至光学模块的 Fluid In 接口。将 Fluid Out 接口连接至组分收集器。
  2. 根据制造商的操作手册，将光学模块与紫外监测仪的控制单元连接。
  3. 根据制造商的操作手册，使用分线电缆将信号输出插座连接至地面的数字转换器，并连接模拟输入接口。
  4. 使用普通 USB 线缆将数字转换器连接至笔记本电脑，并使用数据采集软件记录转换后的数字信号。

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结果

作为示例，将来自8个胚胎的皮层裂解液（含75 µg RNA）通过蔗糖梯度离心分离为12个组分。在254 nm处的紫外吸收峰可识别出含有40S亚基、60S亚基、80S单核糖体及多聚核糖体的组分（图4A）。通过蛋白质印迹分析各组分中大核糖体亚基Rpl10的分布，结果显示其存在于60S亚基（第3组分）、单核糖体（第4组分）以及多聚核糖体（第5–12组分）中（图4B）。相比之下，细胞质蛋白Gapdh和Csde1不与核糖体结合，而在含有游离RNA的组分（第1组分）中富集（图4B）。与不同组分中蛋白质的分离结果一致，我们发现gapdh和sox2 mRNA在富含重多聚核糖体（每个mRNA结合三个以上核糖体，位于第7–12组分）的组分中高度富集，表明gapdh和sox2 mRNA在发育中的皮层中被高效翻译（图4C，D

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讨论

多核糖体分析是一种常用且强大的技术，可用于评估单个基因水平和全基因组水平的翻译状态14。在本报告中，我们介绍了一种使用自制平台进行多核糖体分析的实验方案，并展示了其在分析小鼠大脑皮层发育过程中的应用。该平台成本低廉、易于组装，能够生成稳定且可重复的蔗糖梯度，实现高灵敏度的多核糖体分析。

值得注意的是，制备均一且高质量的蔗糖梯度对于获得可重复的多聚核糖体分析结果至关重要17。在梯度制备过程中，10–50% 蔗糖溶液的体积变化可能导致多聚核糖体峰的偏移，并造成后续分析结果的不一致。此外，在插入和拔出针头时扰动梯度也会导致梯度制备的不一致。与其他方法及商用设备相比，我们自制的梯度制备系统采用电机驱动平台以减少制备过程中对梯度的扰动，并使用注射泵精确分配蔗糖溶液，从而为梯度制备提供了一种廉价且简便的解决方案。

将本研究中提供的多聚核糖体分析平台和方案应用于发育中的小鼠大脑皮层，我们发现核糖体蛋白 Rpl10 以及细胞质蛋白 Gapdh 和 ...

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披露

作者声明无竞争利益。

致谢

本工作由加拿大自然科学与工程研究委员会发现基金（NSERC Discovery Grant，项目号 RGPIN/04246-2018，授予 G.Y.）资助。G.Y. 是加拿大研究讲席学者。S.K. 受 Mitacs Globalink 研究生奖学金和 ACHRI 研究生学生奖学金资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1.5 mL 无RNA酶离心管AxygenMCT-150-C
10 cm 培养皿Greiner-Bio664160
1M MgCl₂InvitrogenAM9530G
21-23G 针头BD305193
2M KClInvitrogenAM8640G
30 mL 注射器BD302832
钝头针头VWR20068-781
光学实验平台ThorlabsMB2530/M
溴酚蓝Sigma115-39-9
CD1 小鼠Charles River Laboratory
弯头镊子Sigma#Z168785
放线菌酮（Cycloheximide）Sigma66-81-9
数据采集软件 TracerDAQMeasurement Computing
数字转换器Measurement ComputingUSB-1208LS
Direct-zol RNA 小量提取试剂盒ZymoR2070
二硫苏糖醇（DTT）Bio-basic12-03-3483
DMSOBioshop67-68-5
Dumont No.5 镊子Sigma#F6521
组分收集器Bio-RadModel 2110
HBSSWisent311-513-CL
线性位移执行器RattmmotorCBX1605-100A
荧光素酶对照RNAPromegaL4561
Maxima 第一链cDNA合成试剂盒Thermo FisherM1681
微型V型夹具ThorlabsVH1/M
迷你系列光学实验平台ThorlabsMSB7515/M
迷你系列光学支架ThorlabsMS2R/M
迷你系列底座支架ThorlabsMBA1
NaClBio-basic7647-14-5
Neurobasal 培养基Gibco21103-049
Ø12.7 mm 铝制支架ThorlabsTRA150/M
Parafilm 封口膜BemisPM992
PerfeCTa SYBR Green FastMixQuanta BioCA101414-274
磷酸盐缓冲液（PBS）Wisent311-010-CL
嘌呤霉素（Puromycin）Bioshop58-58-2
直角夹具ThorlabsRA90/M
直角 Ø1/2" 转 Ø6 mm 支架夹具ThorlabsRA90TR/M
RNase AWAYMolecular BioProducts7002
无RNase吸头Frogga BioFT10, FT200, FT1000
无RNase水Wisent809-115-CL
RNasinPromegaN2111
窄型直角支架ThorlabsAB90B/M
小型V型夹具ThorlabsVC1/M
脱氧胆酸钠Sigma302-95-4
步进电机驱动器SongHeTB6600
蔗糖Bioshop57501
SW 41 Ti 转子Beckman Coulter331362
注射泵Harvard Apparatus70-4500
注射泵Harvard Apparatus70-4500
Triton X-100Bio-basic9002-93-1
TrizolThermofisher Scientific15596018
管穿刺器BrandelBR-184
超速离心机Beckman CoulterL8-70M
超速离心管Beckman Coulter331372
UltraPure 1M Tris-HCl pH 7.5Invitrogen15567-027
UNO Project 超级入门套件ElegooEL-KIT-003
紫外监测仪Bio-RadEM-1 Econo
垂直支架ThorlabsVB01A/M

参考文献

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