本方案旨在监测 体内 通过正电子发射断层扫描（PET）成像在多发性硬化动物模型中观察髓鞘变化（脱髓鞘与再髓鞘化）
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摘要
摘要
多发性硬化症（MS）是一种神经炎症性疾病，伴有中枢神经系统内不断扩展的轴突和神经元变性及脱髓鞘，导致在MS进展过程中出现运动功能障碍、精神障碍和认知损害。正电子发射断层扫描（PET）是一种能够定量检测 体内 细胞和分子水平的改变
具有完整髓鞘亲和力的放射性示踪剂可用于随时间动态观察髓鞘含量变化的体内成像。该成像技术可检测髓鞘含量的增加或减少，意味着能够识别中枢神经系统中的脱髓鞘和再髓鞘化过程。在本实验方案中，我们展示了如何利用正电子发射断层扫描（PET）成像技术在溶血卵磷脂大鼠模型中检测髓鞘变化，该模型是一种局灶性脱髓鞘病灶模型（通过立体定位注射诱导），即多发性硬化症疾病的模型。11C-PIB PET成像分别在基线期、以及大鼠脑右侧纹状体（4 µL）和胼胝体（3 µL）立体定位注射1%溶血卵磷脂后1周和4周进行，从而实现对局灶性脱髓鞘（注射后1周的注射部位）及再髓鞘化过程（注射后4周的注射部位）的定量分析。
髓鞘PET成像是一种用于监测的有用工具 体内 髓鞘含量的变化，可用于监测脱髓鞘疾病的进展及治疗反应。
引言
多发性硬化症（MS）是一种影响中枢神经系统的神经炎症性疾病，其特征为炎症、脱髓鞘和轴突丢失1。尽管治疗手段不断进步，该疾病的预后仍存在较大差异，且是导致年轻人神经系统功能缺损的最常见病因之一1。MS的诊断依据为临床表现以及通过磁共振成像（MRI）观察到特征性病灶2,3。
正电子发射断层扫描（PET）可作为体内监测多发性硬化症（MS）进展及治疗效果的有用工具。in vivo 常用碳-11标记的匹兹堡化合物B放射性示踪剂（11C-PIB）来定量β-淀粉样蛋白斑块；然而，在过去十年中，该示踪剂也被用于量化髓鞘含量，并显示脱髓鞘与再髓鞘化的动态过程4,5,6。
不同的淀粉样蛋白PET示踪剂（11C-PIB、18F-florbetaben、18F-florbetapir、18F-flutemetamol）可用于....
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方案
所有操作均遵循巴西国家动物实验控制委员会（CONCEA，巴西）的指南，并获得圣保罗大学医学院动物研究伦理委员会（CEUA-FMUSP，巴西——方案编号：25/15）的批准。
注意：在本实验方案中，我们展示了如何建立溶血卵磷脂诱导的大鼠多发性硬化模型，以及如何获取和分析髓鞘PET图像。
1. 溶血磷脂酰胆碱溶液的制备
- 使用锥形塑料管（1.5 mL）在分析天平上称取卵磷脂（来自蛋黄的L-α-溶血磷脂酰胆碱）。
- 向管中加入无菌生理盐水，配制成1%溶液（例如：称取1 mg溶血卵磷脂，加入100 µL生理盐水溶解），通过水平摇动管子溶解溶血卵磷脂（避免上下翻转，应左右摇动）。
- 在开始动物模型制备前现配该溶液（不可将配好的溶液储存备用）。
2. 溶血卵磷脂大鼠模型——立体定位手术
- 使用体重在220 - 270 g之间的雄性Wistar大鼠。所有操作过程中均需佩戴手套和口罩。
- 使用5%异氟烷与100%氧气混合诱导麻醉2 (1 L/min) 通过诱导盒进行麻醉。通过观察动物是否无运动（仅可见呼吸）来确认其是否已麻醉。
- 将动物置于立体定位仪中的加热垫上，固定其鼻部和耳部。
注意：有关如何进行立体....
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结果
图1展示了随时间变化的髓鞘改变的代表性11C-PIB PET图像。在基线扫描中，髓鞘含量无明显差异（即不存在脱髓鞘）。在1周时间点的图像中，可见局灶性脱髓鞘病灶（位于右半球），如白色箭头所示。图像以三个解剖平面（冠状面、轴向面和矢状面）呈现，可在所有平面上识别出脱髓鞘病灶。1周图像显示注射部位出现边界清晰的病灶，表明模型成功诱导且图像可检测到病变。在4周图像中，病灶已不可见，提示再髓鞘化已经发生，髓鞘含量恢复至正常水平（或接近正常）。
代表性图表展示了3个不同时间点下4只动物图像的定量结果。第一张图表显示了病灶区（手动勾画感兴趣区）与对侧半球比值的定量结果，表明在溶血卵磷脂注射部位出现更为局限的髓鞘变化。第二张图表展示了相同的定量分析，但感兴趣区位于纹状体（注射侧纹状体与对侧比值），此情况下差异无统计学意义，这可能归因于样本量较小，以及感兴趣区范围较大，导致放射性浓度不仅反映溶血卵磷脂注射部位的信号。
组间差异采用Kruskal-Wallis检验.......
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讨论
使用溶血卵磷脂模型研究多发性硬化症的最大优势在于脱髓鞘（约1周）和再髓鞘化（约4周）的时间进程较快14该模型也可在小鼠中建立15然而，在大鼠中进行诱导更具优势 体内 由于大鼠脑部体积大于小鼠，因此适用于PET成像。
诱导模型的第一步是必须极为谨慎。该模型已由 de Paula Faria 等人验证用于髓鞘PET成像。10 2014年的一项研究表明，溶血卵磷脂在脑内注射的速度对于成功建立模型至关重要。注射必须非常缓慢地进行，每10分钟注射1 µL，以避免组织损伤。溶血卵磷脂溶液也应在立体定位注射当天配制，最好在手术开始前立即配制。如果研究团队首次使用该模型，我们建议在进行PET成像的髓鞘定量之前，应先对模型进行验证。验证需包括死后组织的髓鞘染色分析，例如：Luxol fast blue组织学染色，如图所示 图2，以及髓鞘碱性蛋白（MBP）免疫组织化学， 在.......
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致谢
β-cube 设备（Molecubes NV，比利时）由巴西圣保罗研究基金会 FAPESP 资助（#2018/15167-1）。LES 获得巴西圣保罗研究基金会 FAPESP 的博士生奖学金（#2019/15654-2）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 分析天平 | Marte | AUWZZOD | 最大称量：220 g，最小称量：1 mg |
| 麻醉蒸发器 | Nanitech | 15800 | |
| Beta-cube | Molecubes | ||
| 动脉夹 | Stoelting | 5212043P | |
| 氯己定 | Rioquimica | 0.5%/100 mL | |
| 棉签 | Johnson & Johnson | ||
| 放射性剂量计 | Capintech | ||
| 钻机 | Kinzo powertools | 352901 | 型号 Q0M-DC3C |
| 离心管 | Eppendorf | 30125150 | 1.5 mL |
| 眼用润滑剂 | ADVFARMA | 30049099 | 凡士林 15 g（药用纯度） |
| 精细镊子 | Stoelting | 52102-38P | |
| 手套 | Descarpack | 212101 | 6.5 号 |
| 加热垫 | Softhear | ||
| 注射器 | Hamilton | 80314 | 10µL，32 号针头，型号 701 |
| 胰岛素注射器 | BD | 328328 | 1 mL 胰岛素注射器，带针头 |
| 异氟烷 | Cristália | 410525 | 100 mL，浓度 1 mL/1 mL |
| 酮洛芬或其他镇痛药 | Sanofi | 100 mg/2 mL | |
| 利多卡因 | Hipolabor | 1.1343.0102.001-5 | 2%/20 mL |
| 蛋黄来源 L-α-溶血磷脂酰胆碱 | Sigma-aldrich | L-4129 | 25 mg - ≥99%，I 型，粉末 |
| 持针器 | Stoelting | 5212290P | |
| 氧气 | White Martins | 7782-44-7 | 压缩气体 |
| PMOD 软件 | PMOD technologies | 版本 4.1 | 模块 fuse it |
| 大鼠麻醉面罩 | KOPF | 型号 906 | |
| 生理盐水 | Farmace | 0543325/ 14-8 | 0.9% 氯化钠注射液，10 mL |
| 手术刀片 | Stoelting | 52173-10 | |
| 手术刀柄 | Stoelting | 52171P | |
| 剪刀 | Stoelting | 52136-50P | |
| 半分析天平 | Quimis | BK-3000 | 最大称量：3,100 g；最小称量：0.2 g |
| 剃毛器 | Mega profissional | AT200 型号 | |
| 立体定位仪 | KOPF | 型号 900 | |
| 带针头支架的通用夹具 | KOPF | 型号 1772-F1 | 适用于 5 和 10 µL Hamilton 注射器的支架 |
参考文献
- Oh, J., Vidal-Jordana, A., Montalban, X. Multiple sclerosis: clinical aspects. Current Opinion in Neurology. 31 (6), 752-759 (2018).
- Sand, I. K. Classification, diagnosis, and differential diagnosis of multiple sclerosis. Current Opinion in Neurology.
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重印与许可
勘误
Formal Correction: Erratum: Positron Emission Tomography Imaging for In Vivo Measuring of Myelin Content in the Lysolecithin Rat Model of Multiple Sclerosis
Posted by JoVE Editors on 2/16/2023. Citeable Link.
An erratum was issued for: Positron Emission Tomography Imaging for In Vivo Measuring of Myelin Content in the Lysolecithin Rat Model of Multiple Sclerosis. The citation was updated.
The citation was updated from:
de Paula Faria, D., Cristiano Real, C., Estessi de Souza, L., Teles Garcez, A., Navarro Marques, F. L., Buchpiguel, C. A. Positron Emission Tomography Imaging for In Vivo Measuring of Myelin Content in the Lysolecithin Rat Model of Multiple Sclerosis. J. Vis. Exp. (168), e62094, doi:10.3791/62094 (2021).
to:
de Paula Faria, D., Real, C.C., Estessi de Souza, L., Teles Garcez, A., Navarro Marques, F. L., Buchpiguel, C. A. Positron Emission Tomography Imaging for In Vivo Measuring of Myelin Content in the Lysolecithin Rat Model of Multiple Sclerosis. J. Vis. Exp. (168), e62094, doi:10.3791/62094 (2021).
